3种核酸提取方法检测甲型H1N1流感病毒的比较

目的选择常见的3种核酸提取方法,比较其对低拷贝数甲型H1N1流感病毒核酸检测的敏感性差异,为实验室应用和结果的评价提供依据。方法对已确定阳性的甲型H1N1流感病毒标本,作10^-1～10^-4系列稀释,选用Promega公司全自动核酸提取仪及配套试剂盒、QIAGEN公司Rneasy Mini Kit和国产H公司提取试剂盒3种核酸提取方法提取上述标本核酸模板,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（荧光RT—PCR）对其进行评价。结果在对不同拷贝数流感病毒的检测中,3种核酸提取方法以Promega公司全自动核酸提取仪提取效率最高,以此提取效率作为100％,则QIAGEN Rneasy Mini Kit和国产H公司提取试剂盒的平均提取效率依次为83．27％、55．70％。经方差分析,3种方法之间存在显著性差异（P〈0．05）。结论各试剂之间提取核酸的效率存在显著差异,建议根据实际情况采用合适的核酸提取试剂和方法。     

两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA提取效能的比较

目的 比较两种核酸提取方法对小鼠诺如病毒RNA的提取效能.方法 用Trizol提取法和QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法分别提取感染小鼠诺如病毒(Murine Norovirus,MNV)的小鼠小肠组织样品RNA和细胞培养物RNA,测定RNA浓度;用MNV特异的引物对分离的核酸样品进行一步法RT-PCR扩增.结果 Trizol提取法提取小肠组织的RNA浓度高于QIAamp Viral RNA Mini Kit提取法;QIAamp Viral RNA Mini Kit提取得到的细胞培养物RNA浓度高于Trizol提取法.经QIAamp Viral RNA Mini Kit提取的两种核酸样品均能扩增出特异条带,而Trizol提取的核酸样品未见特异条带.结论 在MNV的检测中,QIAamp Viral RNA Kit更适合组织样品中MNV病毒核酸的提取.     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒临床诊断效能评估

目的: 了解三种严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸检测试剂盒的检测效果及临床诊断效能。方法: 采集40例临床诊断为2019冠状病毒病（COVID-19）和16例非COVID-19住院患者的咽拭子样本。采用湖南圣湘生物科技有限公司（以下简称“圣湘公司”）、硕世生物科技股份有限公司（以下简称“硕世公司”）、深圳华大基因股份有限公司（以下简称“华大基因”）SARS-CoV-2核酸RT-PCR检测试剂盒检测上述样本并分析其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值。比较一步裂解法和磁珠法、两种不同核酸提取仪（圣湘公司Natch CS S12C全自动核酸提取系统和西安天隆科技有限公司NP968-C核酸提取仪）磁珠法提取咽拭子样本中病毒核酸的效果及其RT-PCR检测结果的阳性符合率、阴性符合率、总符合率及Kappa值。结果: 圣湘公司试剂盒检测SARS-CoV-2核酸的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值分别为95.00%、87.50%、95.00%、87.50%和0.825,硕世公司试剂盒分别为90.00%、87.50%、94.74%、77.78%和0.747,华大基因试剂盒分别为82.50%、81.25%、91.67%、65.00%和0.593。一步裂解法和磁珠法提取的病毒核酸检测结果阳性符合率、阴性符合率、总符合率和Kappa值分别为95.24%、100.00%、96.43%、0.909,但一步裂解法仅耗时25 min,而磁珠法需180 min。两种不同核酸提取仪磁珠法提取的RNA检测结果阳性符合率、阴性符合率、总符合率和Kappa值分别为85.00%、100.00%、89.29%和0.764。结论: 圣湘公司试剂盒检测SARS-CoV-2核酸效果略优于其他两家公司试剂盒。一步裂解法提取咽拭子样本中总RNA具有操作简单、省时和检测结果符合率较高的优点。     

3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙肝患者血清中HBV的比较

目的 比较3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙肝患者血清中HBV的灵敏度和特异性,初步探讨其用于乙肝病毒检测的临床价值。 方法 用3种免核酸提取PCR试剂盒分别检测30例慢性乙型肝炎病人及30例阴性参比血清标本中的HBV,以荧光定量PCR结果为标准,比较三种试剂检测灵敏度和特异性。结果 3种试剂盒的HBV检出率分别为93.3%（28/30）、96.7%（29/30）、100%（30/30）;3种试剂检测HBV的特异度均为100%;3种试剂检测灵敏度A公司为103 IU/ml,B、C公司均为102 IU/ml。结论 本研究使用免核酸提取PCR试剂检测HBV快速、简便、高效,可用于临床HBV快速检测。     

三种副溶血性弧菌分子检测试剂盒的评价

目的综合评价国内三种副溶血性弧菌商品试剂盒的检测效果。方法选用TIANDA公司的副溶血性弧菌PCR检测试剂盒、TAITAIGEN公司的副溶血性弧菌Real-timePCR检测试剂盒和HF公司的副溶血性弧菌LAMP检测试剂盒,以10倍稀释梯度的标准菌液确定各种试剂盒检出限;以国标法为标准,评价每种试剂盒的灵敏度、特异度和符合率;最后比较三种试剂盒的耗时、成本和操作性。结果 PCR、Real-timePCR和LAMP检测试剂盒的检出限分别为1.18×103cfu/ml、11.8cfu/ml和11.8cfu/ml;在74份海产品检测中,三种试剂盒的灵敏度分别为100%、100%和100%;特异度分别为56%、48%和50%;符合率分别为70%、65%和66%;三种试剂盒检测结果之间差异无统计学意义(P=0.074);耗时分别为120、80和80min;成本分别为:10、40和45元/次;操作性从难到易排列依次为PCR、Real-timePCR和LAMP检测试剂盒。结论三种分子检测试剂盒的灵敏度高,特异度较低,操作简便,可推荐作为副溶血性弧菌检测的初筛方法。     

甲型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的比较

目的 比较本实验室内部建立的甲型肝炎病毒核酸定量体系和另外两个商品化实时荧光定量PCR检测试剂盒的检测效果.方法 本实验室内部建立的HAV核酸检测系统选取HAV基因组的高保守区段5 ′非编码区作为扩增靶点,定量标准品采用体外转录获得的RNA分子,HAV疫苗株储存液倍比稀释成10-8 ～ 10-1后提取RNA作为模板用以比较该反应体系与市售商品化试剂盒的准确性、灵敏度以及特异性.结果 本实验室内部建立的HAV核酸检测体系十分适宜于HAV的检测,最低检测极限达到10 TCID50/ml,比国内某厂商生产的HAV定量PCR检测试剂要灵敏,然而Qiagen公司的RealArt HAV LC RT-PCR检测试剂效果最好,其检测极限可以达到5 TCID50/ml.结论 本实验室内部建立的HAV核酸定量体系可重复性好,敏感度高,特异性强,在临床样本,环境样本以及食品样本的检测方面具有广阔的应用前景.     

两种HIV抗体诊断试剂盒检测早期感染的比较

目的比较两种HIV抗体诊断试剂盒检测HIV早期感染的性能。方法采用两种试剂盒对血液样本进行检测,并对其中5份HIV抗体阳性血浆样品进行稀释,然后用ELISA检测。对检测结果呈阳性反应的稀释样品分别用两种HIV抗体确证试剂盒进行检测以测试其灵敏度,比较两种试剂盒检测结果及灵敏度。结果两种方法共检出91份阳性,确证68份阳性标本,其余23份确证为阴性。北京万泰试剂盒和英科新创试剂盒检测假阳性率分别为13．92％和15．00％,两种试剂盒假阳性率相似（P〉0．05）;2份质控品英科新创试剂出现漏检;其中有2套系列稀释样品英科新创已显示为阴性,北京万泰仍能检出阳性,且稀释8倍时北京万泰试剂仍检出阳性。结论北京万泰诊断试剂盒与英科新创诊断试剂盒相比,可以更灵敏地检测出HIV抗体。     

临床研究3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的比较

目的 比较3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒(HBV) DNA的灵敏度和特异度,初步探讨其用于HBV DNA检测的临床价值.方法 用3种免核酸提取PCR试剂盒分别检测30例慢性乙型肝炎患者及30例阴性参比血清标本中的HBV DNA,以荧光定量PCR结果为标准,比较3种试剂检测灵敏度和特异度.结果 3种试剂盒的HBV DNA阳性检出率分别为93.3%(28/30)、96.7%(29/30)、100%(30/30);3种试剂检测HBV阴性的特异度均为100%;3种试剂检测灵敏度A公司为103 IU/mL,B、C公司均为102 IU/mL.结论 使用免核酸提取PCR试剂检测HBV快速、简便、高效,可用于临床HBV DNA快速检测.     

病毒RNA提取试剂对甲型流感病毒的灭活效果

目的测试病毒RNA提取试剂（硅胶柱法和改良异硫氰酸胍法）灭活甲型流感病毒的能力,以评估在低防护区操作甲型流感病毒核酸提取过程的可能性。方法根据试剂盒操作指导分别用两种提取试剂的裂解液Bufier AVL（德国QIAGEN）MGTC溶液（广州华银）处理一甲型流感2009年大流行株（105．67TCID50／ml）;系列对数稀释病毒处理液后接种于MDCK细胞单层进行分离培养;倒置显微镜每日观察细胞生长状态,出现75％以上病变后收获培养物进行血凝实验测定。同时设置试剂对照以了解试剂的细胞毒性,病毒对照以确定病毒的感染能力。结果未稀释和10倍稀释的两种裂解液都可引起MDCK大范围死亡,两病毒对照感染细胞的终点稀释度都为10^4,而所有10^2稀释度以上的病毒处理液培养孔细胞生长良好,血凝实验阴性。结论两种病毒RNA提取试剂可以完全灭活高滴度的甲型流感病毒,标本裂解处理后可在低防护区域操作。     

HBV DNA免提取核酸荧光定量PCR检测法应用评价

目的评价乙型肝炎病毒核酸免提取荧光定量PCR方法(一步法)对不同病毒载量时检测性能。方法评价试剂为圣湘公司HBV DNA荧光定量PCR检测免提取试剂盒,对照试剂为匹基公司、科发公司、达安公司3家煮沸核酸提取法试剂盒。将4种试剂盒按各自要求对配套的不同浓度标准品、阴性、临界值的反应曲线考核其线性和灵敏度。另检测1份已知浓度质控品、5份未知浓度样本血清考核其准确性、可比较性。检测仪器为瑞士罗氏公司Light Cycler荧光定量仪。结果一步法、匹基公司、科发公司、达安公司4家标准品浓度相关性R2分别为0.992、0.998、0.999及0.963,线性均满意。4个不同浓度标准品扩增曲线图形:一步法曲线比其他3家更为光滑,呈间距均匀的S形抛物线,2次结果重复曲线更趋重迭。对已知定值为(1.5E+06)IU/mL的质控品检测:一步法、匹基公司、科发公司、达安公司相应结果为(1.16E+06)、(5.27E+05)、(4.32E+05)及(4.90E+06)IU/mL,一步法最接近靶值。5份血清结果显示:4种试剂盒除P公司对2号样本结果为低于检出下限外,其他对1号、2号、3号、5号检出结果均与其他3家接近,可为临床接受。4号样本为一个低值临界范围,出现低于报告限、低值及临界追踪值3种结果现象。结论 4家HBV DNA荧光定量PCR检测检测试剂线性结果均满意,对中、高浓度样本检测结果较接近,但在低浓度临界范围检测报告可能会对临床诊断带来误导,需追踪复查。HBV PCR一步法检测技术免除了核酸高温裂解提取步骤,操作简便,人为误差减少,性能稳定,有利提高检测灵敏度、结果准确性。     

不同RT-PCR方法学的探讨

目的:探讨微量RNA标本的RT-PCR方法。方法:采集13例新生大鼠脊髓标本,提取RNA,分别稀释至1μg/μl、1ng/μl和1 pg/μl,分别以两步法RT-PCR、Promega公司和Qiagen公司一步法RT-PCR试剂盒,扩增β-actin基因,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外透射仪下观察分析。结果:浓度为1μg/μl和1ng/μl的标本,三种方法均出现了目标带,而浓度为1 pg/μl的标本,两步法RT- PCR、Promega公司和Qiagen公司一步法RT-PCR试剂盒的阳性率分别为85%、77%和100%。结论:一步法敏感性高于两步法,微量RNA标本以采用Qiagen公司的一步法试剂盒进行RT-PCR实验为好。     

HCV RNA定量检测试剂的临床应用

目的:探讨HCV RNA定量检测试剂的临床应用效果。方法:通过和市场上广泛使用的柱提取试剂比实验,对一种丙型肝炎病毒磁珠法核酸提取荧光定量PCR检测试剂的临床使用进行评估。结果:①浓度在5.00E+03～5.00E+06 IU/mL的样本,两种试剂的定量结果与理论靶值均具有很好的对应性,具有较好的重复性和精密度;对于1.00E+03IU/mL以下的样本,磁珠法的定量结果重复性好,定量准确;而柱提取法大部分均未能检出。②对于2种方法检测的339例临床样本,中高病毒载量组柱提取法检测>5.00E+02IU/mL有147例,两种试剂定量结果基本一致,相关性r为0.9413。3 339例临床血清样本中5例样本磁珠法检测为阳性,而柱提取法检测为阴性,P<0.01,二者有显著性差异。这5例样本,丙肝肝炎抗体检测均为阳性。结论:①对于中高病毒载量的样本,两种试剂均具有良好的检测效果;②磁珠法对比柱提取法在低病毒载量区域,灵敏度更高,同时操作相对简单,不易出现污染与脱靶,具有较高的临床应用价值。     

全自动核酸纯化系统在临床分子检测中的应用研究

摘要：目的探讨全自动核酸纯化系统在实时荧光定量检测中的应用价值。方法手工法和全自动核酸纯化系统配套不同磁珠法试剂,分别提取HCV及肠道病毒核酸样本,通过实施荧光定量检测不同方法提取的RNA,对比CT值,比较不同方法的提取效率。结果同一检测项目不同试剂的机提之间无显著差异（t1=0．805,P1=〉005;1．952,P4〉O．05）,机提与手工法之间有显著差异（t3=-3．314,P3〈0．01;t1=-3．576,P2〈0．01）;手工法提取30个样本所需时间均为2h左右;而全自动核酸纯化系统同时提取32个样本所需时间均在1h以内;结论全自动核酸纯化系统提取效率明显优于手工法,NP968全自动核酸纯化系统磁珠法试剂是全开放性的,全自动核酸纯化系统操作简单、快速、提取效率高,值得临床检验推广。     

不同转移习性人鼻咽癌细胞株中外泌体的提取及鉴定

目的 探索不同转移习性人鼻咽癌细胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和正常鼻咽上皮细胞NP69细胞外泌体的表达情况,为进一步研究鼻咽癌的诊断和治疗新方法提供一定的理论基础。 方法 在2018年5月—2019年6月期间,用Exosome提取试剂盒从SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69培养上清液分离出外泌体,使用透射电镜进行观察验证外泌体形态,BCA试剂盒测定外泌体蛋白的浓度,蛋白质印迹法(Western blotting)法进行外泌体特异性抗原分子CD63及筏蛋白-1的检测。 结果 3种鼻咽癌细胞系和正常鼻咽上皮细胞上清液中均分离出泡状物,在透射电镜下呈椭圆形或者圆形的泡状物。SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和NP69细胞系外泌体蛋白浓度分别为0.778、0.635、0.788、0.576μg/μL;且所有细胞系来源的外泌体经检测均表达特异性抗原分子CD63及筏蛋白-1。 结论 3种鼻咽癌细胞株SUNE-1-5-8F、SUNE-1-6-10B、SUNE-1和正常鼻咽上皮细胞NP69细胞均产生外泌体。      

甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒行业标准的验证

目的规范和提高甲型H1N1流感病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）的质量,提出本行业标准并加以验证。方法使用市场上4家试剂盒对本标准的外观、阳性和阴性参考品符合率、最低检测限、重复性和稳定性等项目进行试验验证。结果除试剂盒D（北京金豪制药股份有限公司生产）外观和重复性项目不符合外,其他试剂盒的验证结果均符合标准的规定。加速稳定性试验结果显示,试剂盒A（中山大学达安基因股份有限公司生产）检测重复性参考品R2和25℃下放置2d条件下出现较多不合格结果,其他产品均符合标准规定。结论多数试剂盒的验证结果符合行业标准的要求,说明本标准整体具有合理性。本标准的建立有利于进一步规范和提高该类产品的质量,为将来核酸检测试剂盒加速稳定性条件的探索工作提供了依据。     

22例非综合征型耳聋患者的致病基因突变位点分析

目的:对遗传性非综合征型耳聋患者进行中国人常见的耳聋相关基因的突变分析,以明确其分子病因。方法:门诊收集非综合征耳聋患者22名的外周血样本,常规方法提取基因组DNA,PCR扩增GJB2基因和线粒体12SrRNA基因全序列,以及SLC26A4基因7+8外显子和19外显子序列。所有PCR扩增产物经DNA测序分析,测序结果提交NCBIGenBank数据库进行比对,从而对耳聋相关基因的突变进行分析。结果:22名非综合征耳聋患者中共检测到3种GJB2基因的突变:235delC纯合突变2例;235delC杂合突变3例及176del16bp和299delAT复合突变1例;mtDNA12SrRNA基因检出有2种已知致病突变:A1555G2例和C1494T2例;SLC26A4基因有IVS7-2A>G杂合突变2例,纯合突变1例。结论:PCR扩增结合DNA测序是耳聋基因诊断的经典和有效的方法,能确诊非综合征型耳聋患者的分子病因,为临床诊断和治疗提供依据。但该方法存在不能定性、耗时费力、所需成本昂贵且不能同时对不同基因的多个突变位点进行检测等缺点。因此,临床的耳聋基因诊断,需要操作简便、结果准确、通量高、价格低廉的新手段。