人脐带间充质干细胞与蚕丝素多孔支架的体外复合培养

目的观察蚕丝素多孔支架对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）吸附作用及支架对hUCMSCs形态、功能及活性的影响,为脂肪组织工程支架选择提供实验依据。方法将hUCMSCs制成细胞悬液接种在蚕丝素多孔支架,荧光倒置相差显微镜、扫描电镜和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察hUCMSCs的吸附和生长情况。结果培养1～2d后可见hUCMSCs与蚕丝素多孔支架充分附着。培养5～7d细胞生长增殖十分活跃,10d左右时,蚕丝素多孔支架孔中hUCMSCs成片状融合。荧光倒置相差显微镜和扫描电镜见细胞与支架黏附良好并有大量基质分泌,且活性指标与正常培养的hUCMSCs比较差异无统计学意义（P〉0．05）。结论蚕丝素多孔支架对hUCMSCs具有良好的吸附作用,并能维持其正常形态、功能及活性,蚕丝素多孔支架是hUCMSCs三维立体培养时的良好天然支架。     

新型生物可降解材料与骨髓间充质干细胞生物相容性研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(MSCs)与第3代聚羟基烷酸酯(PHA)类聚酯:3-羟基丁酸、3-羟基己酸无规嵌段共聚物[p(3HB-co-3HH)]的生物相容性,以及材料植入体内的组织相容性. 方法将培养的人MSCs分别接种于细胞载体p(3HB-co-3HH)上,通过相差显微镜和电镜,以及HE、Von Kossa染色和Ⅰ型胶原表达等分析,了解细胞载体复合物体外立体培养2周、或裸鼠体内植入后经过培养的MSCs在支架材料上生长、扩增和分泌基质等与材料的相容性. 结果 p(3HB-co-3HH)具有良好的亲水性及细胞亲和力,材料表面不需特殊处理(如卵磷脂、多聚赖氨酸包埋等),可以作为种子细胞的载体,接种的MSCs能够在材料中均匀分布,贴壁生长良好,维持骨髓干细胞表型.在培养体系中加入成骨诱导分化试剂后,贴壁生长的MSCs可向成骨细胞分化并分泌基质,表达Ⅰ型胶原. 结论 p(3HB-co-3HH)具有良好的生物相容性和细胞亲和性,是较好的可降解的高分子生物材料.     

骨髓间充质干细胞与聚乳酸-羟基乙酸支架材料相容性研究

目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)及其分化的神经样细胞与聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)支架材料的相容性,并探讨两者复合修复周围神经损伤的效果.方法 (1)在体外,通过荧光显微镜、流式细胞仪、扫描电镜等技术观察BMSCs在PLGA上的生长及分化成神经样细胞的情况;(2)在体内,取右侧坐骨神经损伤的SD大鼠,随即分为4组,分别移植单纯PLGA、BMSCs-PLGA、神经样细胞-PLGA及直接缝合神经,术后斜板试验观察4组动物下肢功能情况;60d后处死大鼠,取神经标本做病理切片.结果 (1)在体外,BMSCs在PLGA上生长良好,与同期培养板里面的细胞比较,吸光度值(A)差异无统计学意义(P＞0.05);(2)在体内,BMSCs及其神经样细胞复合PLGA后能修复损伤的坐骨神经,促进大鼠下肢运动功能的恢复.术后3周,各组大鼠斜板试验的角度分别是:直接缝合组(38.32 ±5.51)度、单纯PLGA组(40.27 ±2.74)度、BMSCs-PLGA组(45.14±3.43)度、神经样细胞-PLGA组(60.56±4.70)度,且神经样细胞-PLGA组显著高于其他组(P＜0.01);病理切片显示支架与宿主神经组织有良好的生物相容性.结论 BMSCs能诱导分化生成神经样细胞,而PLGA与两者有良好的生物相容性.     

人脐带间充质干细胞应用研究进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于中胚层的一种具有自我更新多向分化潜能的成体干细胞,存在于全身结缔组织和器官间质中.人脐带间充质干细胞成功克服了骨髓间充质干细胞含量低、受年龄影响大等诸多限制,而且具有来源广泛、免疫原性低等优点.Mitchell[1]首次自脐带华尔通氏胶中成功地分离出成纤维样细胞并证实其具有多能干细胞的分化潜能以后,对于脐带来源的MSCs便引起了人们的广泛关注.近年来实验研究表明脐带间充质干细胞在组织工程、神经系统、肝脏疾病、心血管系统、免疫疾病、肿瘤疾病等方面取得了巨大的进展.本文主要在脐带间充质干细胞应用方面予以综述.     

骨髓间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架体外相容性研究

[目的]研究骨髓间充质干细胞与去细胞肌肉生物支架体外相容性,进一步探讨联合二者移植修复脊髓损伤可能性.[方法]采用改良化学方法制备去细胞肌肉生物支架并复合冷灭菌方法灭菌,密度梯度离心法体外分离、贴壁法培养BMSCs,注射法接种第3代细胞于支架.[结果]H-E常规染色观察支架内部呈平行走行,Masson染色示支架内平行结构主要为胶原纤维,几乎没有肌纤维.接种BMSCs于支架并孵育14 d后,Hoechest 33342荧光标记计数显示大量存活细胞,扫描电镜可见细胞贴附于支架内表面生长.[结论]去细胞肌肉生物支架具有规则的内部结构是细胞移植理想载体.BMSCs能与去细胞肌肉生物支架体外相容并存活至少2周,为进一步体内联合移植修复脊髓损伤提供实验支持.     

人脐带间充质干细胞与蚕丝蛋白支架构建组织工程脂肪的研究

目的：将体外以人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）与蚕丝蛋白支架初步构建的组织工程脂肪移植到大鼠体内,观察其演变过程。方法：hUCMSCs与蚕丝蛋白支架复合培养10天后,进行成脂诱导;6周后将其移植到Wi st ar大鼠后肢肌肉内,同时,以同体积支架材料作为对照;分别于移植后4周和8周取材,行油红O染色、HE染色以及扫描电镜观察。结果：hUCMSCs与蚕丝蛋白支架复合培养及成脂诱导6周后,见大量成脂样细胞生成,并与支架牢固粘附。移植4周,移植物体积略小,质稍硬,表面有透明薄膜形成,膜中分布新生血管网;油红O染色见支架内新生脂肪组织及细胞呈橙红色;HE染色显示支架网眼内有新生脂肪组织,并可见少量炎性细胞浸润;扫描电镜见支架网眼内有球形、表面光滑的脂肪细胞。移植8周,移植物体积进一步缩小,质变软,表面薄膜内血管网丰富;油红O染色见支架中着橙红色组织较前明显增多,部分呈片状融合;HE染色显示新生脂肪明显增多,仍有少量炎性细胞浸润;扫描电镜显示脂肪细胞较前增生明显。对照组同样可见炎性细胞浸润,未见新生脂肪组织生成,支架材料8周时较4周时降解更加明显。结论：随着时间推移,蚕丝蛋白支架网眼内脂肪细胞逐渐增多,支架材料在体内呈现逐步降解趋势,说明体内环境有利于组织工程化脂肪的进一步形成。同时,也提示支架材料在组织相容性方面尚存不足。     

人脐带间充质干细胞治疗脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种十分严重的综合性损伤,病情恢复十分困难。对病人的身心健康造成严重伤害,已成为新的影响人类生命质量的重要原因之一。SCI目前治疗方法很多,但干细胞移植最受大家宠爱。MSC最初的临床研究是1995年由Lazarus等     

人脐带间充质干细胞用于衰老相关疾病治疗的研究进展

随着干细胞移植技术的发展,通过输入干细胞进行抗衰老治疗或治疗退行性疾病成为人们研究的热点。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)是一种存在于脐带沃顿胶以及血管周围组织中的独特前体细胞,具有自我更新和多向分化潜能。目前大量科学研究显示HUCMSCs通过再生和修复衰老的细胞、组织和器官达到抗衰老作用。该文对HUCMSCs的生物学特性、组织再生修复作用和抗衰老治疗机制的研究进展进行了详细回顾,并对目前HUCMSCs临床前研究现况进行了总结,提示HUCMSCs是一种具有良好应用潜力和价值的干细胞类型。     

低氧对人脐带间充质干细胞成脂肪分化的影响

目的：研究低氧（2%O2）对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）成脂肪分化的影响,为脂肪组织工程种子细胞的筛选提供实验依据。方法：培养条件有低氧（2%O2）、常氧（20%O2）、10%FBS完全培养基（GM）、10%FBS成脂培养基（DM）;将第3代hUCMSCs根据培养条件分为3组,对照组（常氧＋GM5天,常氧＋DM2周）、实验组1（低氧＋GM5天,低氧＋DM2周）、实验组2（低氧＋GM5天,常氧＋DM2周）;在诱导后2周分别进行油红O染色并观察其成脂效率。结果：与对照组相比,实验组1脂肪样细胞数量明显减少,实验组2脂肪样细胞数量明显增加。结论：将hUCMSCs预先进行低氧处理再转换为常氧培养可显著提高其成脂分化能力。     

人脐血间充质干细胞的分离培养及其多向分化潜能的实验研究

目的 研究人脐血间充质干细胞(MSCs)分离培养的生物学特性及其向成骨、成脂诱导分化的能力.方法 从人脐血中分离扩增MSCs,显微镜下观察其形态及生长情况,绘制生长曲线,电镜下观察超微结构,流式细胞仪检测细胞表面标志物;成骨、成脂诱导后以碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色鉴定MSCs成骨分化潜能,油红O染色鉴定成脂分化潜能.结果 人脐血MSCs为成纤维细胞样,漩涡状贴壁生长排列,传至第110代细胞形态无明显变化;电镜下显示为低分化细胞;细胞表面不表达CD34和CD45,强表达CD29、CD44和CD90;成骨诱导后可检测到ALP表达及钙化结节形成;成脂诱导后可检测到脂滴形成.结论 人脐血中可分离出MSCs,与其他来源的MSCs具有类似的生物学特性及多向分化潜能,脐血有可能成为骨组织工程种子细胞的来源.     

脐带间充质干细胞在遗传性痉挛性截瘫中的应用

目的观察脐带间充质干细胞（UC-MSC）治疗遗传性痉挛性截瘫（HSP）的临床疗效及安全性。方法2010年9月及2011年4月,分别给予一HSP家系父子2人行UC-MSC鞘内注射治疗,两个疗程,每次1×106 cells/Kg,每周1次,4次为1个疗程。采用改良的Ashworth肌张力分级标准（MAS）、国际合作共济失调评分量表（ICARS）及日常生活量表（ADL）,对患者治疗前后神经功能、日常生活能力进行评定。结果第一疗程结束1个月与治疗前比较,2人MAS分级、ICARS及ADL评分均降低,两人行走站立稳定性及言语流利程度较治疗前改善;第二疗程结束后1个月与该疗程治疗前比较,2人ICARS及ADL评分降低,儿子肌张力进一步降低,父亲双上肢共济失调减轻。2人治疗后均未见明显不良反应发生。末次治疗结束后随访20个月,父、子俩分别于第二疗程治疗结束7个月及8个月后,症状继续加重。结论 UC-MSC鞘内注射治疗是安全的,可在一定时间内一定程度上减轻患者临床症状,提高患者生活质量,延缓疾病进展,但疗效不能持久。     

Sox9诱导人脐血干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨Sox9基因对脐血干细胞向软骨细胞分化的影响。方法 体外分离培养人脐血干细胞,采用脂质体转染Sox9载体质粒,观察转染后细胞形态的变化,免疫组化染色观察collagenⅡ、aggrecan的表达,RT-PCR检测collagenⅠ、collagenⅡ、aggrecan的m RNA水平变化,Western blot检测collagenⅡ的表达变化。结果 Sox9对脐血干细胞形态无明显影响,与传统方法诱导组相比,Sox9转染后可明显促进脐血干细胞向软骨细胞分化。结论 Sox9对脐血干细胞的软骨分化有很强的调控作用,脐血干细胞可作为组织工程软骨一种良好的种子细胞。     

脐带间充质干细胞治疗多系统萎缩小脑型的安全性及疗效研究

目的观察脐带间充质干细胞(UC-MSCs)鞘内注射,治疗多系统萎缩小脑型(MSA-C)的安全性及临床疗效。方法自2009年12月至2012年4月,对40例MSA-C患者给予UC-MSCs鞘内注射治疗,每次每Kg体重给予1×106个细胞,1次/周,4次为1个疗程。本组中29例治疗1个疗程,9例患者治疗2个疗程,2例患者治疗3个疗程。采用世界神经病联合会国际合作共济失调评分量表(ICARS)及日常生活量表(ADL)对患者治疗前后的神经功能进行评定。治疗后对患者进行随访。结果 40例MSA-C患者共53个疗程,其中47疗程有效(有效率88.68%)。11例接受多疗程治疗的患者中,9例在后续疗程中疗效进一步提高。治疗结束1个月后ICARS及ADL均比治疗前明显降低(P<0.01)。治疗有效患者多表现为行走、站立不稳,运动迟缓,上肢精细动作障碍,书写困难,构音障碍,眼球运动障碍等临床症状得到改善。治疗后常见的不良反应有头晕(4例)、腰痛(1例)、头痛(2例)、发热(2例),均在1~3 d内消失。随访27~55个月(中位随访时间40个月),无治疗相关的副作用发生,有效患者疾病稳定时间为2~13个月(平均5.88±2.86个月),之后疾病再次出现进展。结论 UC-MSC鞘内注射治疗是安全的,可在一定程度上改善MSA-C患者的临床症状,多疗程治疗有助于多数患者神经功能的进一步改善,延缓疾病进展。     

脐带间充质干细胞治疗脊髓小脑性共济失调及多系统萎缩小脑型临床分析

目的观察脐带间充质干细胞(UC-MSC)鞘内注射,治疗脊髓小脑性共济失调(SCA)及多系统萎缩小脑型(MSA-C)的临床效果。方法 2009年10月至2010年9月,对14例SCA及10例MSA-C患者,给予UC-MSC鞘内注射治疗,每次1×106 cells/kg,1次/周,4次为1个疗程。其中3例SCA患者接受2个疗程,余均接受1个疗程。采用世界神经病联合会国际合作共济失调评分量表(ICARS)及日常生活量表(ADL)对患者治疗前后神经功能进行评定,分值越高表示神经功能缺损越严重。结果本组患者治疗后1个月与治疗前比较,ICARS及ADL明显降低(P0.01)。除1例SCA患者治疗无效外,其余患者均有效,表现为行走和站立不稳、运动迟缓、上肢精细动作障碍、书写困难、构音障碍等临床症状得到改善。治疗后常见不良反应有头晕(4例)、腰痛(2例)、头痛(1例),但均在1～3 d内自行消失。结论 UC-MSC鞘内注射治疗是安全的,可以一定程度地改善SCA及MSA-C患者的临床症状,提高患者生活质量。     

脐血间质干细胞经肌源性诱导后细胞内游离钙的变化

目的研究3种不同的肌源性诱导方法对脐血间质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）进行诱导后细胞内Ca2＋调控系统分化的影响。方法 2007年1月至2010年4月上海交通大学医学院附属新华医院采用5-氮杂胞嘧啶核苷（5-azacytidine,5-aza）、心肌裂解液和心肌诱导液分别诱导犬脐血MSCs。采用激光共聚焦显微镜检测5-aza、心肌裂解液和心肌诱导液诱导的细胞、心肌细胞和MSCs内Ca2＋荧光探针Fluo-3/AM结合的Ca2＋,每份细胞选取2~5个视野,每一种细胞观察记录30个视野,取每1 min摄得的10张图象的平均荧光强度值,以光密度值（OD）反映细胞内游离Ca2＋浓度;并连续监测细胞内游离Ca2＋浓度的变化。结果经3种方法诱导后细胞内游离Ca2＋浓度均高于心肌细胞内游离Ca2＋浓度（F=59.400,P=0.000）。5-aza、心肌裂解液和心肌诱导液诱导的细胞内游离Ca2＋浓度差异有统计学意义（F=18.988,P=0.000）。5-aza诱导的细胞内游离Ca2＋浓度与心肌裂解液诱导的细胞比较差异无统计学意义（OD 1 076.88±44.65 vs.1 040.90±37.48,P=0.186）,但其浓度高于心肌诱导液诱导的细胞（OD 1 076.88±44.65 vs.973.91±46.49,P=0.001）,心肌裂解液诱导的细胞内游离Ca2＋浓度高于心肌诱导液诱导的细胞（OD 1 040.90±37.48 vs.973.91±46.49,P=0.001）。3种诱导方法诱导后的细胞内游离Ca2＋呈自发性波动,与心肌细胞相似,但其频率和幅度有明显差异。5-aza、心肌裂解液诱导后的MSCs在KCl刺激下能使细胞内Ca2＋瞬时释放,心肌诱导液诱导后的MSCs对KCl也有反应,但不能诱发Ca2＋释放,而是使Ca2＋释放时间延长。结论 5-aza诱导、心肌裂解液和心肌诱导液诱导对MSCs的Ca2＋调控系统有分化作用,3种方法的效果不同,其产生差异的原因和效果的优劣需进一步实验阐明。     

单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植对再生障碍性贫血的临床观察及其促进造血机制的初步疗效研究

目的 探讨单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗再生障碍性贫血的初步疗效。方法 选取2012年12月至2014年12月间我院收治的5例再生障碍性贫血患者为研究对象,给予患者单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗。术后观察患者回输的MNC、CD34+细胞数,GVHD发生率,血象恢复时间,SDF-1α、G-CSF、IL-6、GM-CSF、TPO、IL-11、SCF等细胞因子变化情况,以及骨髓有核细胞磷酸化ERK1/2蛋白改善情况,并统计并发症发生情况。结果 5例患者均获得造血重建,移植后血小板恢复时间平均为15 d,血细胞恢复时间平均为10.4 d。3例患者发生Ⅲ度a GVHD,3例患者发生局限性c GVHD,经治疗后均好转,4例患者恢复良好,1例患者术后73 d死于真菌性肺炎。移植后患者血清SDF-1α、G-CSF、IL-6、GM-CSF、TPO以及SCF水平明显改善(P<0.05);治疗后骨髓有核细胞磷酸化ERK1/2蛋白明显高于治疗前(P<0.05);1例患者EB病毒血症,2例出血性膀胱炎,2例真菌性肺炎。结论 单倍体造血干细胞联合脐带间充质干细胞移植治疗再生障碍性贫血疗效显著,能够明显改善患者骨髓造血微环境,安全且并发症低,值得进一步开展临床应用研究。     

冻存对人脐血间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察冻存复苏对人脐血（human umbili calcord blood）间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）生物学特性的影响。方法体外分离、培养人脐血MSCs，传代后，将第3代的MSCs加入含10％二甲基亚砜（DMSO）和90％胎牛血清的细胞冻存液中，-196℃液氮保存4周，观察比较冻存前及冻存复苏后MSCs的形态、增殖及多向分化能力。结果冻存前及冻存复苏后，MSCs形态无明显差别，均呈典型的梭形，MSCs贴壁生长；MSCs生长曲线相似，冻存复苏后的细胞生长曲线略有下降，但差异无统计学意义（P〉0．05）；MSCs经脂肪诱导液诱导2周后，细胞浆中出现脂肪细胞所特有的脂肪滴，经0．5％油红0染色，脂肪滴染为红色，说明MSCs有向脂肪细胞分化的能力；Mscs经成骨诱导液诱导4周后，VonKossa染色可见黑色的矿化结节沉积，钙结节的形成为成骨细胞特有，说明Mscs有向成骨细胞分化的能力。提示冻存复苏后Mscs经诱导仍然可以向脂肪细胞和成骨细胞分化，与冻存前无明显差异。结论人脐血MSCs经冻存复苏后，其生物学特性可获良好保持。     

人脐带间充质干细胞向血管内皮祖细胞诱导分化的实验研究

目的探讨人脐带间充质干细胞定向诱导分化为血管内皮祖细胞的可行性,为构建组织工程血管瓣膜内皮化提供新的细胞来源。方法无菌条件下取剖宫产新生儿脐带,复合胶原酶消化法获取脐带间充质干细胞进行培养,以流式细胞仪检测脐带间充质细胞的表面标志。取扩增3～6代的脐带间充质干细胞用VEGF和b-FGF诱导分化。用免疫荧光法鉴定内皮祖细胞的标志。结果脐带间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮样细胞,表达CD34、CD133和vWF,且Dil-acLDL实验阳性。结论脐带间充质干细胞可以诱导分化为血管内皮祖细胞,可为构建组织工程血管瓣膜提供新的种子细胞来源。     

长期体外培养对人脐血间充质干细胞成骨分化潜能的影响

目的观察体外长期培养对人脐血间充质干细胞（Human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells,UCB-MSCs）成骨分化潜能的影响,探讨其作为组织工程骨种子细胞的可行性。方法流式细胞技术观察长期体外培养的UCB-MSCs细胞表面抗原表达的变化规律,并通过Alizarin Red染色及碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白含量和钙离子含量的检测观察长期体外培养对UCB-MSCs成骨特性的影响。结果第10代之前的UCB-MSCs能够高表达间充质干细胞表面标志物,7代之前的细胞体外增殖能力不随传代次数而发生明显变化。Alizarin Red染色及碱性磷酸酶活性、骨钙蛋白含量和钙离子含量的检测显示8代之前的UCB-MSCs仍能保持较强的成骨分化能力。结论7代之前的UCB-MSCs能保持稳定的体外成骨分化特性,有望成为较理想的组织工程骨种子细胞。