组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原的原核表达及初步临床应用

目的 通过克隆人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,构建重组表达质粒,获得具有免疫活性的纯化重组蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌DH5 α和BL21(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA法.同时用该方法检测30名正常献血者,30例SLE,30例类风湿关节炎(RA),10例原发性干燥综合征(SS),75例PM/DM患者血清中抗Jo-1抗体.结果 经重组质粒测序和酶切结果证实,Jo-1目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;经SDS-PAGE检测显示,表达产物在相对分子质量55 000处有一明显的蛋白表达条带;WB分析表明,重组蛋白具有人Jo-1抗原反应性;间接ELISA法检测标本血清结果显示,PM/DM组中抗Jo-1抗体的阳性率为28%,非PM/DM组(疾病对照组及正常对照组)均为阴性,其差异均有统计学意义(x2=31.84,均P＜0.01).结论 成功克隆了人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,其可在大肠杆菌中表达,且重组自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化融合蛋白建立的间接ELISA法检测PM/DM抗Jo-1抗体具有较好的特异性.     

人聚角微丝蛋白基因克隆表达及其抗体在类风湿关节炎诊断中的价值

目的 通过克隆人聚角微丝蛋白(filaggrin)基因,构建重组表达质粒,获得具活性的纯化重组蛋白,建立人AFA间接ELISA检测法,以评价AFA在RA诊断中的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化,建立间接ELISA检测AFA方法,并用于检测114例RA患者、56例SLE患者、32例OA患者及40名健康体检者血清中抗人AFA;分析AFA和抗CCP抗体诊断RA的相关性.结果 扩增出321 bp人filagrin基因片段,构建了具有正确序列的质粒载体pET-28a(+)-filaggrin,转化大肠杆菌Rosettagami(DE3)中经诱导产生高水平的表达产物.经SDS-PAGE分析,在相对分子质量为14 000处出现新生蛋白带.用Ni-NAT树脂纯化后得到具有活性的纯化人filaggrin重组蛋白.间接ELISA检测标本血清结果显示,RA组AFA检测吸光度(A)值为0.473±0.248,与SLE组、0A组及健康对照组的A值(分别为0.160±0.088、0.050±O.018、0.121±0.040)两两组间比较,差异具有统计学意义(t值分别为12.004、14.464、18.078,P均<0.01).AFA在RA组、SLE组及OA组阳性率分别为48.2%、5.4%和3.1%.RA组AFA阳性率与SLE组、OA组及健康对照组比较,差异有统计学意义(x~2=67.088,P<0.01).AFA与抗CCP抗体对RA的诊断呈正相关(r=0.42,P<0.05).AFA与抗CCP阳性一致率为70.1%,114例患者中有10例患者抗体CCP阴性,而AFA检测结果为阳性.AFA对RA诊断的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为48.2%、96.9%、93.2%和67.9%.结论 用纯化fitaggrin融合蛋白建立的间接ELISA检测抗人AFA的方法,对RA诊断具有较好敏感度和特异度,AFA与抗CCP抗体共同检测可提高检测阳性率.     

巨细胞病毒gp27蛋白表达及其ELISA方法的建立

目的构建高表达巨细胞病毒（CMV）gp27蛋白的重组质粒及工程菌,获取纯化的gp27蛋白抗原。方法采用PCR技术,克隆表达CMV gp27重组蛋白,利用产物建立IgM捕获ELISA方法,鉴定其抗原性。结果表达纯化的gp27蛋白纯度〉95%,经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测50份抗巨细胞病毒IgM阳性血清和30份阴性血清,捕获ELISA法阳性检出率98.0%,阴性检出率100%,与意大利SORIN公司试剂盒检测结果比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;其中1份CMV-IgM阳性血清1∶32稀释后仍能与抗原反应,表明gp27蛋白抗原表位有较好的抗原特异性。结论高效表达纯化的gp27蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测巨细胞病毒抗体。     

重组日本血吸虫亲环素B的克隆、表达及免疫分析

目的克隆、表达日本血吸虫亲环素B(SjCyPB)基因,鉴定并分析重组蛋白的免疫性。方法根据Genbank中日本血吸虫序列设计一对特异性引物,以日本血吸虫cDNA为模板扩增SjCyPB基因,酶切后连接到表达载体pET28,构建pET28a(+)-SjCyPB重组质粒,转化入感受态大肠杆菌BL21/DE3后对质粒进行双酶切和测序鉴定。IPTG诱导表达后,经亲和层析纯化重组蛋白。采用Western Blotting分析鉴定重组蛋白的抗原性。将纯化的重组蛋白免疫大鼠,获得免疫血清,ELISA检测抗SjCyPB特异性抗体滴度。结果构建的pET28a(+)-SjCyPB重组质粒经双酶切和测序鉴定证实SjCyPB基因成功连接到pET28a(+)质粒中。经原核表达后获得纯化的重组蛋白,Western Blotting结果显示,该重组蛋白可与感染日本血吸虫的兔血清结合形成明显的条带。采用ELISA检测重组蛋白免疫后大鼠免疫血清的特异性IgG抗体滴度为1∶51 200。结论成功克隆了日本血吸虫CyPB基因,并获得大量纯化的重组蛋白,重组SjCyPB具有免疫原性和抗原性。     

风疹病毒E1蛋白克隆表达及应用

目的 构建表达风疹病毒蛋白抗原的重组质粒及工程菌,获得纯化的E1蛋白抗原,用于检测风疹病毒特异性抗体IgM.方法 克隆表达风疹病毒E1重组蛋白,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定其抗原性及实用性.结果 表达纯化的E1蛋白经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测53份抗风疹病毒IgM阳性血清和67份阴性血清,用酶标记E1蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率98.1%,阴性检出率100%,与意大利SORIN公司试剂盒检测结果比较,无统计学意义(P＞0.05);其中1份风疹病毒(IgM)阳性血清1∶16稀释后仍能与抗原反应,初步表明E1蛋白抗原表位有较好的抗原特异性.结论 高效表达纯化的E1蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测风疹病毒抗体.     

酶切与PCR联用合成梅毒抗原TpN17全长DNA及其表达活化和ELISA检测

目的在大肠埃希菌中重组表达梅毒密螺旋体TpN17抗原，用其建立梅毒诊断血清学方法。方法酶切与PCR联用。合成全长TpN17基因，亚克隆后克隆到pET-HIS质粒并转化到大肠杆菌BL21株中表达。亲和层析纯化。纯化rTpN17包被微孔板，ELISA方法检测临床8份梅毒阳性血清和4份阴性血清。结果获得了重组表达并纯化的TpN17，ELISA检测结果表明重组蛋白能被梅毒患者阳性血清所识别．特异性100％．灵敏度100％。结论证明了该重组蛋白具有良好的免疫反应性，可用于梅毒感染的血清学检测。     

酶切与PCR联用合成梅毒抗原TpN17全长DNA及其表达活化和ELISA检测

目的在大肠埃希菌中重组表达梅毒密螺旋体TpN17抗原，用其建立梅毒诊断血清学方法。方法酶切与PCR联用。合成全长TpN17基因，亚克隆后克隆到pET-HIS质粒并转化到大肠杆菌BL21株中表达。亲和层析纯化。纯化rTpN17包被微孔板，ELISA方法检测临床8份梅毒阳性血清和4份阴性血清。结果获得了重组表达并纯化的TpN17，ELISA检测结果表明重组蛋白能被梅毒患者阳性血清所识别．特异性100％．灵敏度100％。结论证明了该重组蛋白具有良好的免疫反应性，可用于梅毒感染的血清学检测。     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位基因片段的克隆表达及其检测自身免疫性肝炎的价值

目的 克隆去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein reeeptor,ASGPR)H1亚单位显性表位435 bp基因片段,构建表达重组质粒,进行表达、纯化,以获得具有免疫活性的ASGPR蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测自身免疫性肝炎(AIH)中抗ASGPR抗体的价值.方法 将ASGPRH1亚单位糖类识别区(CRDH1)435 bp的基因片段定向克隆至真核表达载体PEGH,经D-半乳糖诱导表达,表达产物用谷胱甘肽凝胶珠(Glutathione Sepharose4B)亲和纯化,并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(WB)及蛋白质谱(MALDI-TOF)进行免疫活性鉴定,应用表达蛋白建立ELISA法.同时用该方法检测45例AIH、30例SLE、30例类风湿关节炎(RA)、10例原发性干燥综合征(SS)患者、30名健康献血者的抗ASGPR抗体阳性率.结果 经重组质粒测序结果证实,CRDHl/PEGH目的 基因已正确插入真核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;SDS-PAGE检测表达产物为l条相对分子质量42 500的蛋白表达条带.质谱蛋白肽指纹数据通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对,与ASGPR H1亚单位蛋白同源性为98.34%,WB分析表明,重组蛋白具有人ASGPR抗原反应性;间接ELISA检测血清结果显示,AIH组中抗ASGPR抗体的阳性率为35.6%(16/45),非AIH组均为阴性,差异有统计学意义(χ2=31.85,P<0.01).结论 成功克隆的ASGPR H1基因可在啤酒酵母菌中成功表达,且重组的自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化蛋白建_上的间接ELISA检测AIH抗ASGPR抗体具有较好的特异性.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位基因克隆表达及临床应用

目的 获得重组表达的人幽门螺杆菌（Hp)尿素酶B亚单位蛋白（UreB),并将其运用于Hp感染的临床检测。方法 应用聚合酶链反应（PCR）技术从临床分离的Hp菌株基因组中扩增出编码UreB的基因（ureB),将其克隆于质粒PinPoint^TMXa-Ⅲ上进行序列分析和蛋白表达,通过亲和层析得到纯化的重组UreB蛋白并用于113例消化性溃疡患者Hp感染的酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测。结果 克隆的ureB基因核苷酸序列与GenBank公布的序列相比较,同源性为96.44%,推定氨基酸序列同源性为99.65%。纯化的重组UreB蛋白相对分子量约为66000,纯度为90%以上,并保持较好的免疫原性。应用纯化的重组UreB蛋白联合ELISA法检测113例消化性溃疡患者Hp感染的灵敏度和特异性分别为92.0%、98.5%。结论 重组UreB蛋白作为抗原用于ELISA法检测Hp感染,保持了较高的灵敏度和特异性,可用于Hp感染的临床检测与诊断、疗效判定及流行病学研究。     

重组抗原联合用于弓形虫病IgG免疫诊断的研究

目的以纯化的重组弓形虫RH株主要表面抗原SAG1、次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HXG-PRT）和腺苷激酶（AK）作为诊断抗原，建立间接ELISA法检测抗弓形虫IgG抗体。方法诱导表达本实验室保种的SAG1／pET28a／BL21、HXGPRT／pET28a／BL21和AK／pET28a／BL-21，获得rSAG1、rHXGPRT和rAK三种重组抗原。分别用不同浓度的上述抗原包被聚苯乙烯酶标板，检测疑似弓形虫感染者血清。结果混合重组抗原ELISA法的最佳rSAG1包被浓度为500ng／ml、rHXGPRT和rAK均为200ng／ml；人血清稀释度为1：20；血清1：200稀释仍示阳性；特异性试验的抑制率为72．36％，变异系数11．2％。结论成功表达了弓形虫三种重组诊断抗原，并应用组合抗原（rSAG1＋rHXGPRT＋rAK）建立了ELISA检测方法，具有高度特异性和敏感性，本试剂具有弓形虫病辅助诊断价值。     

人血清IgG类抗LDH-C4抗体的ELISA检测及其意义

目的建立检测人血清IgG类抗精子特异性乳酸脱氢酶(LDH-C4)抗体的ELISA法,探讨人血清抗LDH-C4抗体与免疫性不育的关系。方法以重组人LDH-C4(rhLDH-C4)作为包被抗原,建立人血清IgG类抗LDH-C4抗体检测的间接ELISA方法。应用该方法检测74例健康人群(正常生育组)和177例不育人群(不育组)血清IgG类抗LDH-C4抗体。结果初步建立了检测人血清IgG类抗LDH-C4抗体的间接ELISA方法。不育组血清IgG类抗LDH-C4抗体阳性率(30.51%)显著高于正常生育组(9.46%)(P0.01),女性不育组阳性率(31.46%)与男性不育组(29.55%)差异不显著(P0.05)。结论人血清中存在着IgG类抗LDH-C4抗体,此类抗体可能与免疫性不育有密切关系。     

血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体检测法的建立与应用

目的 建立血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的ELISA法,探讨其在类风湿关节炎(RA)患者中的应用价值.方法 以自提可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白(soluble chicken collagen type Ⅱ,SCC Ⅱ)作为包被抗原,优化实验条件,建立抗Ⅱ型胶原蛋白抗体间接ELISA法.对124例RA病人和54例健康人血清抗II型胶原蛋白抗体进行检测.结果 血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的检测条件为:SCCⅡ包被浓度为20 μg/ml;以含10%羊血清的缓冲液进行封闭、稀释血清和酶标抗体;采用双波长(450nm/630 nm)进行测定.RA患者和健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体阳性率分别为19.35%(24/124)和1.85%(1/54),两组有明显的统计学差异(P<0.01).结论 以SCCⅡ为包被抗原检测抗Ⅱ型胶原蛋白抗体可作为判断RA患者病情的一个辅助诊断指标.     

梅毒螺旋体硫氧还原蛋白TP0100的原核表达和鉴定

目的构建梅毒硫氧还原蛋白TP0100基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达重组蛋白,并评价其在梅毒血清学诊断中的价值。方法构建pET-28b-TP0100重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21（DE3）后诱导表达。经镍柱纯化,重组蛋白通过质谱和Western blot进行鉴定。以重组蛋白为抗原建立酶联免疫吸附试验（ELISA）间接法,并检测临床收集的梅毒血清。结果成功构建表达载体pET-28b-TP0100,测序结果表明质粒中的插入序列与GenBank中TP0100的基因序列相同。重组蛋白表达约占菌体总蛋白的40%,相对分子质量约为23×103。质谱和Western blot分别证实重组蛋白的酶解片段来自于TP0100蛋白,重组蛋白能与梅毒TPPA阳性血清发生特异性反应。ELISA检测20份梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）阳性血清和20份TPPA阴性血清,与TPPA方法的符合率分别为95%（19/20）和100%（20/20）。结论重组硫氧还原蛋白TP0100能够与梅毒患者阳性血清发生特异性反应,是一个潜在的梅毒血清学诊断抗原。     

MgPa重组蛋白在生殖支原体血清学诊断中的应用

[目的]表达、纯化生殖支原体 （Mycoplasma genitalium,Mg） 黏附蛋白（MgPa）优势表位基因（MgPa＇,1075-1364aa）,探讨MgPa＇重组蛋白在Mg血清学诊断中的应用.[方法]IPTG诱导表达重组质粒pET-30a（＋）/MgPa＇,SDS-PAGE和免疫印迹鉴定表达结果;Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,间接酶联免疫吸附试验（Enzyme link immunosorbent assay,ELISA）检测人血清中特异性IgG抗体.[结果]SDS-PAGE检测诱导产物显示有一分子量约为37 000的特异蛋白带,免疫印迹检测其只与Mg抗血清发生特异反应;在311例有临床症状性传播疾病（STD）患者中用PCR法筛查出Mg阳性42例,阳性率13.5%（42/311）.重组蛋白用作ELISA包被抗原检测Mg阴阳性血清,重组蛋白能和Mg感染者阳性血清特异性结合,重组蛋白有良好的免疫反应性.[结论]表达的MgPa＇重组蛋白具有较好的免疫反应活性,可望用于生殖支原体的血清学诊断.     

血清中TIGAR的ELISA建立及初步临床试验

目的建立肿瘤蛋白53（TP53）诱导的糖酵解和凋亡的调控子（TIGAR）的定量酶联免疫吸附试验（ELISA）,并探讨血清中TIGAR定量测定在肿瘤患者诊断中的临床应用。方法构建TIGAR原核表达载体并诱导蛋白表达,纯化蛋白后免疫家兔获得多克隆抗体,以此兔抗TIGAR多克隆抗体为包被抗体,以生物素-辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（SA-HRP）检测系统,建立TIGAR定量检测的双抗体夹心ELISA。测定40例肿瘤患者及40名对照者的血清TIGAR含量,并探讨其与肿瘤的关系。结果建立的TIGAR定量ELISA拟合曲线的相关系数（r）=0.99,肿瘤患者血清TIGAR含量高于对照组,差异有统计学意义（S=954.5,P〈0.01）。结论本研究成功建立了TIGAR定量ELISA,血清TIGAR含量测定对某些肿瘤的研究和临床检测可能有一定价值。     

抗烯醇化酶抗体检测对侵袭性念珠菌病的诊断价值

目的 利用白念珠菌烯醇化酶重组蛋白质为抗原,建立测定人血清中抗白念珠菌烯醇化酶IgG类抗体的ELISA法,评估其在侵袭性念珠菌病(IC)诊断中的应用价值.方法 收集各类确诊IC患者(66例)和白念珠菌定植者(32例)血清,用重组白念珠菌烯醉化酶包被ELISA微孔板,测定血清中的抗烯醇化酶抗体,确定cut off值并对方...     

三种抗双链DNA抗体检测法诊断价值比较

[目的]比较间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验和免疫印迹法检测抗双链DNA抗体对系统性红斑狼疮的诊断价值。[方法]实验组为74例SLE患者,非系统性红斑狼疮疾病组为40例非自身免疫病患者,对照组为40例健康体检者,采用间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验和免疫印迹法检测来三组血清中的抗双链DNA抗体,并比较分析三种检测方法对抗双链DNA抗体的灵敏度、特异性。[结果]间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验和免疫印迹法检测ds—DNA抗体的灵敏度分别为36．5％,62．2％,28．4％,特异性分别为98．8％,93．8％,100．0％,均高于非自身免疫病组及健康对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。[结论]间接免疫荧光法作为抗双链DNA抗体检测的经典方法较为直观,但需要荧光显微镜及较为丰富判断经验的技术人员,该方法具有较高度特异性,其敏感度不是很高;ELISA法灵敏度高,操作简单,重复性好,易于自动化,标准化,但特异性较差;免疫印迹法具有高度的特异性,敏感性较差。     

抗异质性胞核核糖核蛋白A2/RA33抗体酶联免疫吸附法的建立及临床应用

目的 探讨酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗异质性胞核核糖核蛋白A2(hnRNPA2)／类风湿关节炎(RA)33抗体在不同风湿性疾病患者中的阳性率及对RA早期诊断的意义。方法 以纯化的重组蛋白hnRNPA2为抗原，用ELISA检测RA179例、系统性红斑狼疮(SLE)14l例、其他弥漫性结缔组织病(CTD)97例、血清阴性脊柱关节病(SPA)30例、骨关节炎(0A)10例、关节痛／关节炎59例、正常对照40名，比较抗hnRNPA2／RA33抗体在各组人群中的阳性率，并评价其与RA患者临床和实验室检查指标间的关系及早期诊断的价值。结果 抗hnRNPA2／RA33抗体在RA患者中的敏感性为36．9％、特异性为87．1％，在SLE、其他CTD、SPA和OA患者中阳性率分别为19．2％、7．2％、6．8％和0。抗hnRNPA2／RA33抗体在早期RA患者中的阳性率为43．3％。结论 以纯化的重组蛋白hnRNPA2为抗原的ELISA是检测抗hnRNPA2／RA33抗体，早期诊断RA的可靠方法。