丙型肝炎病毒体外感染肝癌细胞株HepG2的初步研究

目的 研究人肝癌细胞株HepG2对丙型肝炎病毒（HCV）的易感性，建立细胞感染模型。方法 将人肝癌细胞株HepG2与慢性丙型肝炎患者血清共同温育6-8h，收集不同时相点标本，用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR)法分别检测细胞内或上清液中正负链RNA，免疫组织化学法检测细胞内HCV NS3，NS5特异性抗原的表达情况，以及原位杂交法检测细胞内HCV负链RNA。结果 接种感染血清3-35d，可在细胞内或培养上清液中检出HCV正负链RNA；HCVNS3，NS5特异性抗原能在感染细胞内稳定表达，阳性物质位于胞浆中；原位杂交法证实细胞内存在负链RNA，也位于胞浆中，结论 人肝癌细胞株HepG2不但对HCV易感，而且可以稳定地支持HCV体外复制。     

人肝癌细胞株7721HCV体外感染模型的建立

目的建立接近体内自然感染状态并能稳定支持HCV体外长期复制的感染细胞模型。方法将慢性丙型肝炎患者的血清与人肝癌细胞系7721共同孵育8小时后,分别以反转录-聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞和/或培养上清中的HCV正、负RNA、HCV抗原的表达及HCV-RNA在感染细胞内的定位。结果感染血清和细胞共同孵育后的第2～65天,从细胞内和培养上清中均可间断地检测出HCV正、负RNA,即使其间细胞传代4次HCV NS_3抗原、NS_5抗原在细胞内能稳定表达,原位杂交显示HCV RNA阳性物质多位于细胞浆。结论 7721细胞不但对HCV易感,而且可以稳定地支持HCV的体外长期复制,此模型可以用于HCV感染、复制机理的研究、抗病毒药物的评价及保护性抗体/疫苗的初步筛选。     

EBV转化B淋巴细胞中丙型肝炎病毒抗原表达的免疫组化研究

观察丙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）体外转化培养后其中是否仍有丙型肝炎病毒（HVC）存在。用EB病毒感染患者HCV阳性PBMC7并使其转化,获得永生化B细胞（EBVTB）。而后,用套式RT-PCR检测培养细胞和上清中的HCV RNA,用免疫组化SP法观察HCV抗原在细胞中的表达,HCV在传代细胞中持续存在,而培养细胞中的HCVRNA负链和培养上清中的HCV间断阳性,免疫组化发现HCVNS3、NS5和C抗原分布于胞细胞膜和核膜周围也可见阳性着色,细胞核阴性。HCV可以在体外EB病毒转化B细胞系中较长时间存在和复制。     

HCV RNA在外周血单个核细胞中的复制与丙肝慢性化及复发的关系

通过对外周血单个核细胞（PBMC）中正链及负链HCV RNA的检测来探讨HCV在PBMC中的复制与丙肝慢性化及复发的关系。应用巢式RT—PCR对71例慢性丙型肝炎患者的血清和PBMC进行正负链HCV RNA的检测,其中15例干扰素治疗。并对10例正常人的血清和PBMC进行了HCV RNA检测。71例慢性丙型肝炎患者血清中正链HCV RNA阳性率73．2％,负链HCV RNA阳性率为0,PBMC中正链HCV RNA阳性率为60．5％,负链HCV RNA阳性率为38．0％。15例干扰素治疗患者在治疗后血清正链HCV RNA转阴率为73．3％,PBMC中正链HCV RNA转阴率为45．5％,负链转阴率为71．4％。正常对照组血清及PBMC中HCV RNA阳性率为0。这说明HCV RNA在PBMC中的复制与丙肝慢性化及复发存在一定的关系。干扰素治疗丙肝具有一定疗效,但不能彻底清除病毒。     

初步探讨丙型肝炎病毒体外感染的致病机理

目的:初步探讨原代培养肝细胞对HCV的易感性,并在此基础上观察HCV感染后肝细胞形态学的变化。方法:用HCV RNA阳性血清与培养肝细胞共同孵育后,收集不同时相点标本,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、分别细胞内或上清中正负链RNA,免疫组化检测细胞内HCV NS3、NS5抗原的表达以及原位杂交检测细胞内HCV负链RNA,同时在电镜下观察细胞形态学变化。结果:接种感染血清后第3～5d,即可在细胞内或培养上清中检出HCV正负链RNA;感染肝细胞内可见HCV NS3、NS5抗原表达,阳性物质位于胞浆中;原位杂交法证实细胞内存在负链RNA,也位于胞浆中;光镜下未发现感染细胞形态学变化,电镜下发现胞浆内含有大量的脂肪空泡、多泡体,并可见疑似病毒样结构。结论:HCV不但能感染树鼩肝细胞,而且在体外能直接致细胞病变。     

丙型肝炎病毒感染细胞模型的实验研究

目的：建立接近体内自然感染状态，并能长期稳定复制的丙型肝炎病毒（HCV）感染细胞模型。方法：在含10％小牛血清的RPMI1 640培养基、37℃、5％ CO2条件下于培养瓶中培养人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721及胎肝细胞株L02细胞，L02培养基加胰岛素0．2μ/ml,用HCV阳性血清感染HepG2、SMMC 7721、L02细胞，3株细胞均每隔3d换液，消化、传代1次，连续培养60d，用套式逆转录－聚合酶链反应（nested RT-PCR)检测培养细胞及上清液中正、负链HCV RNA。结果：HepG2、SMMC7721细胞在感染后2－30d,L02细胞在感染后3－30d于细胞中可以间断检出HCV正链RNA；3株细胞的细胞内HCV负链RNA均在感染后3－30d可以间断检出，检出率与正链RNA接近。3株细胞以HepG2细胞中HCV RNA正、负链检出率较高，并在第31－60天仍可间断检出HCV RNA正、负链，但复制程度逐渐减弱。HepG2、SMMC 7721及L02 3株细胞的培养上清液中HCV正链RNA感染后也呈间断阳性，检出率与细胞内正链RNA基因一致。培养上清液中均未检出HCV负链RNA。结论：HepG2、SMMC 7721及L02细胞均对HCV易感，并能支持HCV长期稳定的复制。因此HepG2细胞是较为理想的HCV体外感染细胞模型。     

慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞中负链HCV RNA的检测及意义

19例临床诊断慢性丙型肝炎患者,检测其外周血单个核细胞中丙型肝炎病毒(HCV)RNA的存在及复制状态。所选检测对象血清标本抗-HCV及HCV RNA均为阳性。采用逆转录-套式PCR法检测其外周血单个核细胞中HCV正、负链RNA,结果19例患者外周血单个核细胞中14例HCV正链RNA阳性;6例HCV负链RNA阳性。实验结果证实部分慢性丙型肝炎患者外周血单个核细胞中存在HCV复制,表明肝细胞并非为HCV感染与复制的唯一场所。HCV感染慢性化与其外周血单个核细胞中存在HCV复制可能有一定关系。     

末梢血单个核细胞被HCV感染

我们调查了丙型肝炎患者末稍血单个核细胞(PBMC)被HCV感染的情况。用逆转录——套式PCR法检测了HCV RNA正、负链。22例受试者的PBMC中检出HCV RNA正链12例(54.5％),其中5例(22.7％)负链也阳性。结果提示,在丙肝患者的PBMC中存在着HCV的活动性感染和复制,表明了HCV的肝细胞外感染。     

丙型肝炎患者血清和外周血单个核细胞中HCV RNA检测及意义

采用套式PCR检测38例急性丙型肝炎和36例慢性丙型肝炎患者血清和外周血单个核细胞(PBMC)中HCV RNA。结果显示74例丙型肝炎患者血清HCV RNA阳性68例,PBMC阳性44例;急性丙型肝炎患者PBMC中HCV RNA阳性15例(39.5％),慢性丙型肝炎患者PBMC中阳性29例(80.5％);3例血清HCV RNA阴性,而PBMC中HCV RNA阳性;8例患者血清抗-HCV阴性,而血清HCV RNA阳性。结果显示,在部分丙型肝炎患者的PBMC中存在HCV RNA,慢性丙型肝炎患者PMBC中HCV RNA检出率显著高于急性丙型肝炎患者(P<0.01)。提示PBMC可能为HCV肝外贮存和复制场所,PBMC中的HCV感染在丙型肝炎慢性化和慢性肝损害中可能起一定作用,血清HCV RNA检测可能有助于抗-HCV阴性丙型肝炎的诊断。     

丙型肝炎病毒体外感染胎肝细胞的初步研究

目的：探索原代培养胎肝细胞对丙型肝炎病毒（HCV）的易感性,旨在建立较为稳定实用的细胞感染模型。方法：研究血清与培养肝细胞共同孵育6－8h后,收集不同时相点标本,用逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）分别检测细胞内或上清液中正负链RNA,免疫组化检测细胞内HCV NS3,NS5特异性抗原的表达情况,以及原位杂交检测细胞内HCV负链RNA。结果：接种感染血清3d后,即可在细胞内或培养上清液中检出HCV正负链RNA,间断检出至感染后第17天,HCV NS3,NS5特异性抗原可在感染细胞内表达,阳性物质位于乐中,原位杂交法证实细胞内存在负链RNA,也位于胞浆中,结论：原代培养的胎肝细胞对HCV不但易感,而且稳定地支持HCV复制。     

hTERT基因转染人表皮干细胞的可行性研究

目的观察外源性人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因转染体外培养的人表皮干细胞的可行性。方法采用脂质体转染法,将质粒pIRES2-EGFP—hTERT转人体外培养的人表皮干细胞,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与培养。应用RT-PCR法和Western blot法检测hTERT mRNA及其蛋白的表达。结果转染组hTERT mRNA及其蛋白的表达强于非转染组。结论外源性hTERT基因转染体外培养的人表皮干细胞具有可行性。     

端粒酶逆转录酶激活脐静脉内皮细胞端粒酶活性

目的　探讨外源性端粒酶逆转录酶 (hTERT)能否激活人脐静脉内皮细胞端粒酶活性 ,为建立体外人脐静脉内皮细胞系奠定基础。方法　用逆转录病毒转染法 ,将编码hTERT片段逆转录病毒载体与VSV G共转染 2 93 GP2 细胞 ,产生病毒上清液 ,感染原代分离的人脐静脉内皮细胞 (hUVEC) ,以嘌呤霉素筛选。观察细胞生长曲线、第Ⅷ因子、CD34、β 半乳糖苷酶染色、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)等指标。 结果　细胞生长曲线显示培养至 30代的转染细胞生长速度基本与原代培养脐静脉内皮细胞一致但快于原代培养传至第 10代内皮细胞 ;RT PCR结果转染细胞有特异扩增 ;衰老指标 β 半乳糖苷酶染色显示转染后细胞胞浆内着染阳性细胞数明显少于第 10代内皮细胞。结论　外源性hTERT转入原代培养人脐静脉内皮细胞 ,可重现其端粒酶活性 ,从而阻止人脐静脉内皮细胞老化     

肝癌组织中丙型和乙型肝炎病毒基因状况研究

采用逆转录巢式ＰＣＲ技术检测了５１例ＨＣＣ患者的肝癌及癌周肝组织中ＨＣＶＲＮＡ正负链，同时以巢式ＰＣＲ技术检测了这些组织中的ＨＢＶＤＮＡ。结果，１１．８％（６／５１）检出组织中ＨＣＶＲＮＡ正链：其中５例在癌周肝组织，２例在癌组织中检测出ＨＣＶＲＮＡ负链，由于负链ＲＮＡ为ＨＣＶ的复制中间体，不释放到细胞外，其检出ＨＣＶ感染与ＨＣＣ关系的研究提供了进一步的病因证据，组织中ＨＢＶＤＮＡ检出率高达９２．２     

Evidence for in vitro replication of hepatitis C virus genome in a human T-cell line.

A human T-cell line, MOLT-4, either uninfected or infected with murine retroviruses, was tested for its susceptibility to hepatitis C virus (HCV) infection. The cell cultures were inoculated with a serum containing HCV and then examined for the presence of viral sequences by cDNA/PCR. In murine retrovirus-infected MOLT-4 (MOLT-4 Ma) cells, intracellular minus-strand viral RNA, a putative replication intermediate, was first detected 3 days after inoculation, and the maximum signal was seen on day 7. When the cells were continuously subcultured in fresh medium, HCV sequences were intermittently detected in cells over a period of 3 weeks. In MOLT-4 cells free of retroviruses, replication of minus-strand HCV RNA appeared less efficient than in MOLT-4 Ma cells. The presence of minus-strand viral RNA in MOLT-4 Ma cells inoculated with HCV was confirmed by in situ hybridization with a strand-specific RNA probe. Immunofluorescence tests with antibodies specific for HCV core and NS4 antigens showed that MOLT-4 Ma cells were positive for viral antigen 7 days after inoculation. Thus, it appears likely that the HCV genome can replicate in the human T-cell line MOLT-4.     

人滋养层细胞培养上清液及裂解液中丙型肝炎病毒的检测

目的应用改良的分离、纯化方法对孕早期人绒毛滋养细胞进行原代培养,利用HCV阳性血清对滋养细胞进行体外感染,探讨HCV在体外培养条件下对细胞的感染及HCV在细胞中的复制状态。方法采用胰蛋白酶消化法消化正常人妊娠孕早期胎盘组织,以35%、45%2个Percoll密度梯度进行分离纯化、并免疫组化鉴定,获得纯度较高的滋养层细胞,应用HCV阳性且高载量的血清进行体外感染,应用免疫荧光染色检测滋养层细胞中HCV NS5表达,通过细胞裂解液裂解感染后细胞,应用荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测感染后细胞培养上清和细胞内的HCV RNA,以观察HCV的感染及复制情况。结果该法分离纯化的滋养层细胞生长良好,特异性角蛋白-7阳性,纯度高。原代滋养层细胞在与HCV阳性血清共同孵育后均未出现明显的细胞病变,感染后48 h在滋养层细胞细胞浆中可见HCV NS5表达,感染后分别于24、48、72、96、120 h收集的培养上清和感染后细胞内均可以检测到HCV RNA。排除了培养洗涤液HCV污染,进一步检测其细胞裂解液中HCV,结果检测HCV阳性。结论利用改良后人胎盘滋养层细胞的体外培养系统,HCV阳性血清能在体外感染原代培养的人滋养层细胞,HCV可在滋养层细胞中复制。