基因工程技术制备和鉴定抗TNF-α蛋白Fab抗体

目的 利用基因工程技术制备人源性抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白的可溶性Fab抗体,并鉴定其抗原结合活性及特异性.方法 用固相化的TNF-α蛋白从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选出表达抗TNF-α蛋白Fab抗体的阳性克隆,经酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG高效可溶性表达,SDS-PAGE及Western blot分析鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性.结果 成功筛选并表达了人源性抗TNF-α蛋白的Fab抗体,在非还原SDS-PAGE中形成相对分子质量47 kD的条带;Western blot分析证实表达的蛋白即Fab抗体.ELISA筛选出2株抗体(TA-04,TA-13)具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与小牛血清白蛋白无交叉反应.结论 成功表达并鉴定了人源性抗TNF-α蛋白的可溶性Fab抗体,构建了一种基因工程抗体的有效制备途径.为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础.     

抗人γ—精浆蛋白VH单域抗体基因的构建表达及空间构象分析

目的 扩增出抗人γ－精浆蛋白（γ－Sm）单克隆抗体（mAb）的重链可变区（VH）单域抗体基因,并进行原核表达及空间构象分析。方法 从分泌抗γ－Sm mAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA,经RT－PCR扩增VH单域抗体基因,将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX－4T－1中进行表达,并利用计算机软件对表达产物进行空间构象分析。结果 VH单域抗体基因全长363bp,含起始码和终止码。将其克隆到pGEX－4T－1内,转化大肠杆菌DH5α,获得高效表达,表达量占全菌总蛋白质的38％,以包涵体形式存在。经初步纯化和复性后,用谷胱甘肽（GST）亲和色谱纯化,再经凝血酶水解获得抗γ－SmVH单域抗体。竞争结合抑制实验证明,该表达产物具有前列腺癌细胞亲和活性。空间构象分析结果显示,该抗体具有完整的抗原结合位点。结论 构建成功抗γ－Sm的VH单域抗体,为进一步临床应用奠定基础。     

鼠源性抗HBV-TP可变区抗体基因的克隆及原核表达

目的:扩增鼠源性抗HBV末端蛋白(HBV-PT)mAb轻、重链可变区(VL,VH)基因,构建sFv原核表达载体并于大肠杆菌中表达.方法:从鼠源抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞(E3)中提取细胞总RNA,逆转录成cDNA,以鼠源简并性引物PCR扩增抗体的VL和VH基因,克隆到pGEM-T Easy载体,测序并对其结构进行分析.选择序列正确的克隆,分别构建VL及VH的PBV220原核表达载体,42℃诱导表达,Western blot鉴定表达产物.结果:经测序证实,所克隆的VL基因为363 bp,VH基因为375 bp,两者序列与鼠抗体的同源性均大于80%.构建了鼠抗HBV-PT抗体基因VL及VH的PBV220原核表达载体,并在大肠杆菌中获得表达.表达产物经SDS-PAGE及Western印迹分析与羊抗鼠IgG产生特异反应.结论:抗HBV末端蛋白轻、重链可变区基因的克隆及表达为进一步探讨HBV感染患者的免疫治疗奠定了基础.     

人HMGB1的制备及功能鉴定

目的在克隆人HMGB1(high mobility group box-1)全长cDNA的基础上,用大肠杆菌进行表达并鉴定其生物学活性.方法用RT-PCR方法扩增人HMGB1 cDNA,克隆至载体pUC19行序列测定后,再构建于原核表达载体pQE-80L并转化大肠杆菌DH5α,以IPTG诱导HMGB1蛋白表达,Ni2 -NTA和多粘菌素B亲和层析柱进行纯化后,用培养的人单核细胞系THP1检测重组蛋白活性.结果构建了人HMGB1蛋白的重组表达质粒pQE-80L/HMGB1,获得了纯度约96%的纯化蛋白产物,该蛋白能刺激THP1细胞产生TNF-α.结论成功制备了具有生物学活性的人HMGB1蛋白纯品,为进一步的功能研究奠定了基础.     

抗前列腺特异抗原重链可变区单域抗体基因的构建及表达

目的：扩增出抗前列腺特异抗原（PSA）单克隆抗体（MAb)的重链可变区（VH）单域抗体基因,并在大肠杆菌中表达。方法从分泌抗PSAmAb的杂交瘤细胞系E4B7中提取总RNA,经RT－PCR扩增VH单域抗体基因,将其克隆到融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中进行表达。结果VH单域抗体基因全长363bp,含起始码和终止码,将其克隆到pGEX-4T-1内,转化大肠杆菌DH5α,获得高效表达,表达量占全菌总蛋白质的38％,以包涵体形式存在,经初步纯化和复性后,用谷胱甘肽（GST）亲和色谱纯化,再经凝血酶水解获得抗PSA VH单域抗体,竞争结合抑制实验证明,该表达产物具有前列腺要和活性。结论构建成功抗PSA的VH单域抗体,为进一步临床应用奠定基础。     

肿瘤坏死因子-α转换酶基因金属蛋白酶区的克隆及表达

目的: 克隆和构建含有肿瘤坏死因子-α转换酶金属蛋白酶区(metallopro teinase dom ain of human tumor necrosis factor-αconve rting enzyme,TACEmp)基因表达载体,并在大肠埃希菌中高效表达。方法: 用RT-PCR方法,从THP-1细胞中扩增出TACEmp基因片段,插入表达载体pET-DsbAmut,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定;转化到大肠埃希菌BL21中进行诱导表达,通过SDS-PAGE电泳分析表达产物。结果: 克隆TACEmp基因并构建重组表达载体pET-DsbAmut-TACEmp转化入BL21,IPTG诱导后获得高效表达的TACEmp融合表达蛋白。结论: 利用分子伴侣融合蛋白技术使TACEmp在原核表达系统中获得了高效可溶性表达。     

抗转铁蛋白受体单链抗体原核表达载体的构建和表达

目的 构建抗转铁蛋白受体(TfR)单链抗体原核表达载体，为进一步研究其效应奠定基础。方法 从抗TfR单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆载体pGEM-T-VH和pGEM-T-VL中扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因，用重叠延伸PCR的方法，在VH和VL基因间引入连接短肽(Linker)，构建VH-Linker-VL的单链抗体(single chain Fv，scFv)基因。经NcoⅠ和NotⅠ酶切后亚克隆到原核分泌型表达载体pUCl9／119上，转化和筛选后，阳性细菌经IPTG诱导表达。间接免疫荧光法(IFA)及抗体封闭试验鉴定其抗体活性。结果 凝胶电泳可见重叠延伸PCR扩增产物约700bp条带，SDS-PAGE鉴定表达产物的分子量为27kD左右，与scFv的理论值一致，IFA及抗体封闭试验证明表达产物有抗人TfR的活性。结论 本研究成功地构建并表达了抗人TfR scFv，为抗人TfRscFv的应用奠定了基础。     

蛋白激酶SGK2α在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备

目的 该研究通过SGKα基因的克隆、原核蛋白表达以及纯化,制备抗SGK2α抗体,为进一步研究SGK2α蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体PGEX-4T-3构建重组质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白:以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗SGK2α多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价,免疫印迹法检测抗体的特异性.结果 构建了PGEX-4T-3-SGK2α原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得GST-SGK2α融合蛋白,蛋白纯度在90%以上;利用GST-SGK2α融合蛋白制备多克隆抗体,抗体效价阳性且具有较强的特异性.结论 利用原核表达的GST-SGK2α融合蛋白成功地制备了抗SGK2α多克隆抗体,可用于免疫组织化学和免疫印迹检测以及功能研究.     

人源抗-HBs Fab与IFN-α融合蛋白的克隆与原核表达

目的:构建人源单克隆抗-HBs Fab-IFN-α表达载体,探讨该融合蛋白原核表达的可行性及其生物学活性.方法:用PCR体外扩增目的基因IFN-α,单酶点插入已含人源抗-HBsFab基因的载体,插入点位于轻链基因3‘未端,利用酶切、PCR鉴定筛选正确插入的阳性克隆,转化大肠杆菌,挑选单克隆表达、纯化目的蛋白,用ELISA方法检测融合蛋白IFN-α的抗原性及其抗体亲和性,用WISH细胞检测IFN-α生物学活性.结果:利用插入了人源抗-HBs Fab基因及IFN-α基因的pBAD/gⅢA原核表达系统,成功表达了具生物活性的λ轻链与IFN-α的融合蛋白,其既具有与抗-HBs Fab相近的HBsAg的亲和力,又具有干扰素的活性.结论:λ轻链与IFN-α融合蛋白的成功表达表明,应用原核系统能够同时表达某些特异抗体和其介导的部分生物活性因子,是一种经济、有效的方法,为特异抗体及其介导融合蛋白的制备和临床应用提供了线索.     

人源化抗CD3单链抗体在大肠杆菌中的GST融合表达

目的为构建新一代的小分子、高效的基因重组抗CD3/抗胶质瘤双特异性抗体提供一个合适的构件.方法从质粒pZZ3中克隆出人源化抗CD3抗体的VH、VL基因后,构建人源化抗CD3单链抗体基因,将其克隆入表达载体pGEX-5Xl中后转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达.结果SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量为55kd,与其理论推算值相符.表达形式均以包涵体为主,表达量占菌体总蛋白的30%左右.Westem blot证实,诱导后菌体总蛋白在55kd处出现特异性显色印迹.结论人源化抗CD3单链抗体可以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,为构建人源化双特异性抗体奠定了基础.     

抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4人/鼠嵌合Fab抗体片段的制备及功能鉴定

目的:构建日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的人/鼠嵌合Fab(cFab)抗体片段,并对cFab抗体片段结合活性进行鉴定.方法:用抗体框架区的通用引物PCR扩增抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的VH及VL基因,测序分析其核苷酸序列.将测序正确的鼠源VH、VL分别与人IgG1的CH1、CL通过Overlap PCR扩增Fd及全长L,再利用Overlap PCR以Fd和全长L基因为模板扩增cFab基因.将cFab基因片段克隆至载体pComb3XSS中构建表达载体pComb3XSS-Fab,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导进行蛋白可溶性表达.通过Western blot和ELISA方法对cFab抗体片段进行检测.结果:构建出抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab表达载体,Western blot结果证实在大肠杆菌Top10F'中表达出cFab可溶性抗体片段,ELISA结果显示cFab抗体片段与可溶性虫卵抗原(SEA)有较好的结合活性.结论:表达、纯化了抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab抗体片段,cFab抗体片段具有与亲本抗体相同的抗原结合能力,为制备抗日本血吸虫人源化免疫毒素提供了技术贮备.     

FcεR Ⅰ受体α亚基的重组表达、单克隆抗体的制备及特异性鉴定

目的 通过基因重组的方法表达IgE高亲和力受体FeεR Ⅰα亚基,并用重组蛋白制备单克隆抗体.方法 用RT-PCR的方法从过敏性疾病病人外周血嗜碱性粒细胞调取FcεR Ⅰα蛋白基因,经T-A克隆、亚克隆至pET28a( )原核表达载体,将重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR(DE3),IPTG诱导表达FeεR Ⅰα亚基蛋白,通过Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白;并用其免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,用细胞免疫荧光法对单克隆抗体的特异性进行鉴定.结果 成功调取了人IgE高亲和力受体FcεRⅠα亚基的基因,且测序正确;构建原核表达质粒FcεR Ⅰα-pET28a( );成功建立4株稳定分泌抗FcεR Ⅰα亚基的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为G101、C22、G113、G42.通过细胞免疫荧光实验证实,4株单克隆抗体均能特异性结合人嗜碱性粒细胞表面的FcεR Ⅰα亚基.结论 成功利用基因重组技术制备了FcεR Ⅰα亚基蛋白,制备了4株效价高、特异性好的抗FcεR Ⅰα亚基单克隆抗体,为FeεR Ⅰα亚基及其抗体在过敏性疾病中的生物学功能研究奠定了基础.     

可溶性肿瘤坏死因子-α的高效表达及其抗体的制备

为了制备TNF-α特异性抗体，用PCR的方法克隆出TNF-α片段的编码基因并将之插入PET-28a（+）原核表达载体，成功地在大肠杆菌中获得50%～60%的高效表达。经SDS-PAGE电泳，切下TNF-α特异条带，直接免疫大白兔，制备出TNF-α特异性抗体，抗体的效价可达1∶6400。利用该抗体成功地检测出mTNF-NIH3T3细胞膜上的跨膜型TNF-α的表达情况。结果表明制备出的抗体具有较高的特异性，对TNF-α的免疫检测具有重要应用价值。     

抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区基因的克隆与鉴定

目的 克隆抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区（VH）基因.方法 从分泌抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2的杂交瘤细胞中提取总RNA,通过RT-PCR扩增重链可变区基因.凝胶回收纯化后与pMD-18T载体连接,重组载体转化于宿主菌DH5α,挑取菌落PCR鉴定后测序并进行分析.测序正确的质粒经EcoRI和XhoI酶切、纯化后的产物和原核表达载体pRSET A在SolutionI作用下连接,转化BL21（DE3）对重组质粒进行表达.经Tricine-十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测重链可变区表达产物的表达水平,用ELISA检测表达产物能否与日本脑炎病毒结合.结果 确定了2F2VH基因序列,长度为354 bp,编码118个氨基酸,第22位和第96位残基是维持抗体结构的半胱氨酸,含有特异性CDR1、CDR2和CDR3区域,符合鼠源性免疫球蛋白基因的特征.ELISA检测结果显示原核表达的2F2重链可变区产物可与日本脑炎病毒特异性结合.结论 获得了抗日本脑炎病毒单克隆抗体2F2重链可变区基因.     

人层粘连蛋白α4链LG4-5组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的利用基因工程技术克隆、表达人层粘连蛋白α4链LG4-5组件(human laminin alpha4 LG4-5 module,hLNα4LG4-5)蛋白并制备其特异性多克隆抗体.方法采用RT-PCR方法从人胎盘组织扩增hLNα4LG4-5的cDNA片段,T/A克隆法将其插入pMD-18T载体进行测序.采用DNA重组技术构建原核表达载体pET-28a-LG4-5,用BL21(DE3)/pET系统表达hLNα4LG4-5融合蛋白,以SDS-PAGE鉴定所表达的融合蛋白.用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗hLNα4LG4-5多克隆抗体,Western印迹法检测抗体的特异性.结果成功克隆了hLNα4LG4-5的cDNA片段,12%SDS-PAGE电泳检测显示,经IPTG诱导后BL21(DE3)/pET28a-LG4-5总蛋白中出现一条分子质量为42×103的新蛋白带,制备了效价为1:10 240的hLNα4LG4-5多克隆抗体,Western印迹分析证实可检测到特异性目的蛋白带.结论克隆并原核表达了hLNα4LG4-5蛋白,制备了特异性抗hLNα4LG4-5的多克隆抗体,为进一步研究LG组件在疾病发生中所起的作用打下了基础.     

人源性MIF cDNA的克隆及其原核高效表达的研究

目的克隆人MIF cDNA并构建其高效原核表达载体,表达和纯化得到高纯度的可溶性hMIF蛋白.方法经RT-PCR从人乳腺癌细胞株MDA-MB453中扩增到hMIF cDNA,并克隆到原核表达载体pET11b中.测序验证后将其转入大肠杆菌BL21中表达,最后经离子交换和疏水层析法纯化hMIF蛋白.结果克隆到的hMIF cDNA与Genebank已发表的序列完全一致,纯化得到的产物经Western blotting鉴定证实为hMIF蛋白.结论应用基因重组技术成功构建了pET11b/hMIF重组质粒,在大肠杆菌中实现了高效表达;纯化到高纯度的可溶性hMIF蛋白,为治疗性抗hMIF抗体的研究创造了条件.     

抗鼻咽癌单克隆抗体BAC5单链抗体原核表达载体的构建和表达

[目的]构建抗鼻咽癌单克隆抗体BAC5单链抗体的原核表达载体并观察其表达,为开展抗鼻咽癌单链抗体的进一步研究奠定基础.[方法]应用RT-PCR技术,扩增出鼻咽癌单克隆抗体BAC5的轻链、重链可变区基因,通过一段编码肽的序列进行连接,构建BAC5单链抗体表达载体pET22b-scFv,导人BL21(DE3)表达菌,并进行诱导表达.SDS-PAGE凝胶电泳鉴定融合蛋白的表达.[结果]克隆基因序列符合小鼠轻、重链可变区基因特征;pET22b-scFv表达质粒拼接正确;表达产物以包涵体形式为主.[结论]成功构建了能表达BAC5单链抗体的原核表达载体.     

人源化抗CD3单链抗体在大肠杆菌中的GST融合表达

目的 为构建新一代的小分子、高效的基因重组抗CD3/抗胶质瘤双特异性抗体提供一个合适的构件。方法 从质粒pZZ3中克隆出人源化抗CD3抗体的VH、HL基因后,构建人源化抗CD3单链抗体基因,将其克隆入表达载体pGEX-5X1中后转化大肠杆菌,以IPTG诱导表达。结果 SDS-PAGE分析表明,表达产物分子量为55kd,与其理论推算值相符。表达形式均以包涵体为主,表达量占菌体总蛋白的30%左右。Western blot证实,诱导后菌体总蛋白在55kd处出现特异性显色印迹。结论 人源化抗CD3单链抗体可以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,为构建人源化双特异性抗体奠定了基础。     

抗炭疽毒素保护性抗原单克隆抗体的制备及功能分析

目的:原核表达炭疽杆菌保护性抗原PA10蛋白,制备单克隆抗体,并进行功能分析?方法:人工合成炭疽杆菌保护性抗原PA10编码基因并克隆入pUC57载体,酶切鉴定后,将PA10编码基因插入原核表达载体pColdⅡ中,测序验证正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和低温条件下诱导蛋白表达,SDS-PAGE验证产物;用HiTrap IMAC HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步验证?以纯化获得PA10重组蛋白为抗原,常规程序免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,并检测所制备抗体的中和活性?结果:获得的PA10重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,最终获得了4株特异性的单克隆抗体(分别命名为2G8?5A8?7B3? 9C9)?经体外炭疽毒素保护试验证实,其中1株单抗(7B3)具有较强的中和活性,其保护率可高达96%?结论:本文成功构建并表达炭疽杆菌保护性抗原PA10,制备了具有中和活性的抗PA单克隆抗体,为构建人源化的抗PA中和抗体奠定基础,从而有望用于炭疽病的治疗?     

幽门螺杆菌Tipα重组蛋白的表达?纯化及鉴定

目的:克隆幽门螺杆菌(H.polyri,HP)的Tipα基因,构建含有Tipα的重组载体,在大肠杆菌表达并纯化以获得Tipα蛋白。方法:从HP的26695菌株扩增位于HP0596的Tipα基因,将Tipα基因与pET28a载体(His标签)同时经BamHI和XhoI酶切、纯化及连接后,构建含有Tipα的重组载体pET28a-Tipα,重组载体转化至大肠杆菌并表达,表达产物以Ni-NTA亲和层析纯化,Western blot进一步鉴定。结果:克隆Tipα基因,经测序证实与Genbank对比,二者同源性为100%。大肠杆菌表达产物,纯化后SDS-PAGE显示相对分子量为23 ku。Western blot证实纯化产物与抗Tipα抗体特异性结合。结论:成功克隆并表达出HP的Tipα蛋白,为进一步研究Tipα的功能奠定基础。