^125I标记激素与蛋白质类物质的标记率测定方法探讨

我们在研究＾１２５Ｉ标记胰岛素、超氧化和岐化酶（ＳＯＤ）和牛血清白蛋白（ＢＳＡ）等一些激素、蛋白质类物质的同时，对４种测定方法进行实验比对，提出采用简单、方便、省时的ＴＣＡ沉淀法测定标记率较为适宜。标记率是评价一个标记方法好坏和标记条件选择是否恰当的重要指标＾［＾１］，通过它还能较为简便地计算出被标记物的比活度＾［２］。通常，＾１２５Ｉ标记物的标记率测定采用淋洗分离时标记产品峰计数率与诸峰计数率之     

抗ProGRP(31-98) scFv的131I标记及生物分布研究

目的 研究抗胃泌素释放前体（ProGRP（31-98）单链抗体（scFv）的131I标记方法,并对其标记后的稳定性、免疫活性及生物分布进行分析.方法 采用氯胺T法碘化标记制备131I-anti-ProGRP（31-98）scFv,凝胶柱层析法分离纯化标记产物,利用纸层析法测定标记物的标记率、放化纯度和稳定性,采用细胞结合分析法比较131I-anti-ProGRP（31-98）scFv对小细胞肺癌细胞株NCI-H446和肺腺癌细胞株A549的免疫结合率.将131I-ProGRP（31-98）scFv注射入动物体内,研究其在实验动物体内的分布情况.结果 131I-anti-ProGRP（31-98）标记率为（93.35±0.67）％,标记产物纯化后即刻放化纯度为（98.49±1.21）％.131I-anti-ProGRP（31-98）scFv对人小细胞肺癌NCI-H446和肺腺癌A549细胞株的免疫结合率分别为（85.36±1.45）％和（21.02±2.16）％,且差异有统计学意义（P＜0.05）.131I-anti-ProGRP（31-98）scFv在实验动物体内主要通过肾脏和肝脏代谢,血液清除快.结论 131I-anti-ProGRP（31-98） scFv的标记率高,且有良好的稳定性和免疫活性,在实验动物体内主要通过肝脏和肾脏代谢,血液清除快.     

放射性3,3’-二碘甲腺氨酸（（131）I-T2）的合成

目的：获得放射性3,3’-二碘甲腺氨酸（131I-T2）,为下一步硫酸化得到3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物（131I-T2S）作准备。方法：采用氯胺T法以131I标记3-单碘甲腺氨酸（3-T1）,凝胶柱层析法及纸层析法分离、纯化。测定标记率、放射化学纯度和标记物稳定性,并鉴定标记物的免疫活性。结果：131I标记率为65.1%±4.5%（n=5）,标记物的放化纯度为96.5%±1.1%（n=5）。经-20℃储存10d后放化纯度仍〉90%。结论：氯胺T法可获得较高碘标记率及较稳定的标记物。     

一种基于酶标纳米金探针的蛋白质检测方法

目的研究酶标纳米金探针的制备条件,并构建利用酶标纳米金探针检测蛋白质的检测体系,实现对蛋白质的高灵敏度检测。方法首先标记捕获抗体的磁珠探针、抗原及标记检测抗体和辣根过氧化物酶（Streptavidin—peroxidase,SA．HRP）的纳米金探针（AuNP probes）进行免疫反应形成三明治结构,然后利用磁力分离器收集三明治结构,再加入四甲基联苯胺（Tetrabenzidine,TMB）溶液发生酶促显色反应,最后在450nm处进行分光光度检测,从而间接测定蛋白质含量。结果通过一系列优化实验建立检测体系,具体为：纳米金探针重悬液确定为50mmol Tris（pH7．8,1．25％蔗糖,0．2％BSA,0．05％PEG,0．05％PVP,0．15％Tween20）：检测体系中纳米金的最适加入量为3μl;2步孵育最适时间依次为1h和45min。使用该方法检测并绘制癌胚抗原（CEA）标准曲线,表明CEA浓度在250pg／ml—25ng／ml区间时线性关系良好,R^2为0．991。通过灵敏度实验表明该检测体系的最低检测灵敏度为25pg／ml,而传统ELISA方法的检测灵敏度仅为1．65ng／ml。结论酶标纳米金探针检测体系实现了通过普通光学仪器进行高灵敏度蛋白质检测的目标,是一种很有发展前景的蛋白质检测技术。     

血管紧张素在培养乳鼠心肌细胞肥大发生中的作用

本实验用~3H-TdR和~(14)C-uR双标记掺入和单个心肌细胞(MC)平均蛋白质含量测定,以及图像分析系统直接测定单个MC体积等方法,就血管紧张素Ⅰ、Ⅱ(AⅠ、AⅡ)对培养乳鼠MC的DNA、RNA和蛋白质合成的影响及其在心肌肥大发生中的作用进行了初步研究。结果表明:AⅠ(3×10~(-9)M)和AⅡ(5×10~(-10)M)     

17β-雌二醇对培养的乳鼠心肌细胞肥大的影响

目的观测17β-雌二醇（17β-estradiol,E2）对肾上腺素（PE）诱导的乳鼠心肌细胞肥大的影响并探讨其机制。方法以培养的乳鼠心肌细胞为模型并分组给药,用计算机图像分析软件测量心肌细胞表面积,[^3H]标记亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白质合成速率,免疫细胞化学方法检测心肌细胞原癌基因c-fos蛋白表达,半定量RT-PCR检测心肌细胞肥大特征性胚胎型基因β-肌球蛋白重链（pMHC）、α-骨骼肌肌动蛋白（α-skA）和心房肽（ANP）的mRNA表达。结果17β-雌二醇明显抑制肾上腺素诱导的心肌细胞表面积和蛋白质合成速率的增加;17β-雌二醇减弱肥大心肌细胞c-fos蛋白表达;17β-雌二醇降低pMHC、α-skA的mRNA表达,但增加ANPmRNA表达。结论17β-雌二醇可抑制心肌细胞肥大,其作用机制可能与抑制原癌基因c-fos的蛋白表达,逆转收缩蛋白基因（β-MHC和α-skA）向胚胎型转化及促进ANPmRNA表达有关。     

限盐对慢性肾衰大鼠的心脏蛋白质组的影响

目的构建低盐饮食条件下慢性肾衰大鼠的心脏蛋白质谱，探索限盐对慢性肾衰大鼠的心脏蛋白质组的影响。方法采用5／6肾切建立慢性肾衰大鼠模型，设为假手术组（Sham组，6只）和慢性肾衰组（CRF组，6只），术后第10周低盐（0．02％NaCl）饮食干预14d，然后取心脏左室游离壁进行蛋白提取及酶解和肽段同位素标记相对和绝对定量技术（iTRAQ）标记，最后经毛细管高效液相色谱分离后用Q—Exactive质谱仪进行蛋白质质谱分析。结果运用iTRAQ技术对低盐饮食条件下慢性肾衰大鼠的心脏蛋白质组进行了研究，共鉴定了1833种蛋白，构建了心脏蛋白质谱；其中226种蛋白发生了差异性改变，主要具有结合、催化活性等生物功能，涉及代谢、转运、生物过程的调节、应激等。结论成功构建了低盐饮食条件下慢性肾衰大鼠的心脏蛋白质谱。     

GLP-2对大鼠颅脑外伤后肠粘膜免疫功能的影响

目的研究高血糖素样肽-2（Glucagon-like peptide-2,GLP-2）对大鼠颅脑外伤后胆汁中分泌型IgA（sIgA）、肠粘膜T细胞及其亚群以及肠粘膜蛋白质和DNA含量的影响。方法制作大鼠弥漫性脑创伤模型,连续腹腔注射GLP-2,7d后收集大鼠胆汁测定sIgA、采集门静脉血测定血内毒素及制备小肠粘膜标本,检测小肠粘膜蛋白质、DNA含量和小肠上皮内淋巴细胞的T细胞及其亚群。结果颅脑外伤组大鼠小肠粘膜蛋白质和DNA含量以及胆汁中sIgA显著下降（P〈0.01）,小肠粘膜CD4^＋、CD4^＋/CD8^＋较对照组显著降低（P〈0.05）;而GLP-2组大鼠小肠粘膜蛋白质和DNA含量以及胆汁中sIgA明显增加（P〈0.01）,小肠粘膜CD4^＋、CD4^＋/CD8^＋较颅脑外伤组增加（P〈0.05）,门静脉血内毒素也显著减少（P〈0.01）。结论GLP-2能够改善大鼠颅脑外伤后肠粘膜免疫功能,从而减轻内毒血症。     

海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠(ACA)微胶囊的蛋白质通透性研究

本研究用激光共聚焦扫描显微镜CLSM观察荧光标记蛋白在微胶珠/囊上的吸附和渗透现象.考察了微胶囊类型、海藻酸钠粘度和壳聚糖分子量对微胶珠/囊通透性的影响.结果表明,蛋白质在膜上是先吸附后渗透的过程;AC膜具有不对称性;不同类型微胶珠/囊的通透性依次为海藻酸钠（A）微胶珠＞海藻酸钠-壳聚糖（AC）微胶囊＞海藻酸钠-壳聚糖-海藻酸钠（ACA）微胶囊;海藻酸钠粘度越高,壳聚糖分子量越大,微胶珠/囊的通透性越低.为制备低通透率即具有较好酶屏障功能的ACA蛋白质口服控释载体提供了直观的实验依据.     

188Re-7E11C5.3抑制前列腺癌细胞增殖

目的：探讨铼-188（188Re）标记前列腺特异膜抗原单克隆抗体7E11C5.3（188Re-7E11C5.3）对前列腺癌细胞系LNCaP的体外抑制作用。方法：采用2-巯基乙醇直接还原法制备188Re-7E11C5.3标记物，纸层析法测定标记率和放化纯度，直线回归外推法测定免疫活性分数。四唑盐（MTT）法测定其体外细胞毒作用。结果：188Re-7E11C5.3的标记率为（93.16±2.18）%，放化纯度为（95.62±0.48）%，免疫活性分数为（74.86±1.86）%。188Re-7E11C5.3对LNCaP细胞的生长抑制作用明显强于188Re标记的正常鼠IgG（mIgG）和游离188ReO^-₄，其半数有效抑制浓度（IC₅₀）分别为（23.38±3.73）×10⁷ Bq/L，（59.21±8.02）×10⁷ Bq/L和（68.89±10.91）×10⁷ Bq/L。结论：188Re-7E11C5.3能有效抑制体外培养LNCaP细胞的增殖，可用于前列腺癌的放射免疫治疗。     

人血红蛋白时间分辨荧光免疫分析试剂的研制及初步应用

目的建立人血红蛋白（Hb）时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）试剂,探讨在大便潜血（FOB）检测中的应用。方法采用固相双抗体夹心法建立检测Hb的TRFIA方法,并对该试剂的各项性能指标进行评价。结果自制试剂盒的最低检测量为0．8ng／mL或32ng（Hb）／g（粪便）,线性范围为0．8—1000ng／mL或32—40000ng（Hb）／g（粪便）。分析内和分析间变异系数分别为3．4％-8．9％和5．2％-13．4％。与羊、鸡、牛、猪、兔、狗Hb不发生交叉反应。90份临床确诊标本用本试剂盒和胶体金免疫层析（GICA）试剂同时测试,TRFIA法的敏感性和特异性均为100％．GICA法的灵敏度和特异性分别为95．6％、100％。结论Hb—TRFIA试剂盒各项指标均达到临床检测要求,适用于临床上大便潜血Hb的检测。     

促甲状腺激素生物素-链亲和素TRFIA定量检测法的建立

用Eu3＋标记链亲和素（SA）,分别用两株识别人促甲状腺素（human thyroid stimulating hormone,hTSH）的单克隆抗体包被96微孔板并生物素化,建立了高灵敏的hTSH生物素-链亲和素（BAS）时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）检测法。本法的灵敏度为0.02mIU/L;批内CV为2.7%~3.5%,批间CV为3.2%~3.8%;平均回收率为100.26%;与电化学发光免疫分析技术（ECLIA）比对,相关系数达0.9544,线性方程为Y=1.3133X-32.297;与ECLIA临床测定值也呈明显相关;正常值范围为0.33~3.09mIU/L。本文建立的hTSH-BAS-TRFIA具有灵敏度高,特异性强,稳定性好,测定范围宽,检测时间短和非放射性等优点,具有良好的应用价值。     

乙肝病毒前S1抗原时间分辨荧光免疫分析试剂盒的研制

目的利用时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术建立乙型肝炎病毒前S1抗原的检测试剂盒。方法应用双抗体夹心法建立乙肝preS1抗原TRFIA检测试剂盒,对试剂盒的各项性能指标进行评估。结果对280份血清样本进行检测并与国产酶联免疫法试剂盒对比,结果显示自制试剂盒的特异性更好：200份正常人血清样本检测结果表明,该试剂盒的cutoff值=阴性对照荧光值×4．5。用自制质控品检测分析内和分析间的精密度分别为3．4％～7．8％,6．9％-8.4％;检测HBsAg及HBeAg无交叉反应。结论试剂盒各项指标均达到临床检测要求,TRFIA法精密度和特异性有较大提高,可替代酶免法试剂盒。     

Detection of hepatitis B virus PreS1 antigen using a time-resolved fluoroimmunoassay

The hepatitis B virus (HBV) PreS1 antigen is expressed at the distal most region of the envelope protein and contains the hepatocyte receptor-binding site. The presence of the HBV PreS1 antigen in serum and liver of HBsAg-positive patients is a new marker used for diagnosing HBV infection, and is indicative of viral replication. Our objective is to establish a method of time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA) with higher sensitivity and broader detection range for detecting serum HBV PreS1 antigen. Eu(3+) labeling of antibodies was performed with respective labeling kits, and Eu(3+) fluorescence intensity was measured with an auto DELFIA1235 TRFIA analyzer. The established method was evaluated for its performance. Serum specimens (574 in total) from Wuxi People's Hospital were analyzed for PreS1 antigen using the TRFIA and ELISA. The precision, specificity, and sensitivity of the TRFIA were clearly better than ELISA. The detection limit was 0.01?ng/mL. The average recovery rate for PreS1 antigens was 103.3%. There was significant correlation between the PreS1 antigen results obtained by TRFIA and ELISA in 374 serum samples with HBV >10(3)?IU/mL (χ(2)?=?25.04, p?相似文献   

游离雌三醇时间分辨免疫荧光分析法的建立

目的建立游离雌三醇（uE3）时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）方法。方法采用竞争抑制一步法建立检测uE3的TRFIA分析方法，并对该试剂的各项性能指标进行评价。结果该方法的灵敏度为0．14nmol／L，线性范围为0．14—120nmol／L，回收率为97．7％。分析内和分析间变异系数分别为1．6％-4．1％和4．4％-8．8％。与E2、孕酮和睾酮的交叉反应率分别为0．24％、0．36％和0．40％。149份血样用本试剂与进口的同类试剂同时检测，其相关系数为0．925。结论试剂盒各项指标均达到临床检测要求，可替代国外同类产品试剂盒。     

血清胰岛素TRFIA的建立

目的 建立血清胰岛素( Ins)时间分辨荧光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA).方法 采用一株Ins-MAb包被于固相微孔板上,另一株Ins-MAb用DTTA- Eu3+标记作为示踪剂采用Victor 1420荧光仪测定,.并对本法进行评价.结果 本法的标准曲线范围...     

超顺磁氧化铁标记对干细胞转铁蛋白受体和铁蛋白轻链基因及蛋白表达的影响

目的研究超顺磁氧化铁（SPIO）标记对大鼠脂肪干细胞（ADSCs）转铁蛋白受体（TfR）和铁蛋白轻链（Fn-L）基因及蛋白表达的影响。方法实验通过医院伦理委员会的批准。标记组（实验组）采用多聚赖氨酸（PLL,终质量浓度为1.5μg/mL）介导SPIO（终质量浓度为50μg/mL）标记ADSCs。在2、4、8、16、24、96、168、336、504、672 h,分别用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）和WesternBlot实验定量检测实验组和未标记组（对照组）TfR和Fn-L基因及蛋白表达水平。结果 PLL-SPIO标记ADSCs后,实验组Fn-L mRNA（2、4、8、16、24、96、168、336 h）及蛋白（16、72、96、168 h）（P均〈0.05）表达水平会暂时性升高,至标记后一定时间,Fn-L mRNA（504、672h）及蛋白（336、504、672h）表达水平两组间差异无统计学意义（P均〉0.05）;实验组TfR mRNA（2、4、8、16、72、96、168、336 h）及蛋白（24、96 h）（P均〈0.05）表达水平会暂时性减低,至标记后一定时间,TfRmRNA（504、672 h）及蛋白（168、336、504、672 h）表达水平两组间差异无统计学意义（P均〉0.05）。结论在一定浓度内,PLL-SPIO标记ADSCs,对Fn-L和TfR基因及蛋白表达仅产生暂时性影响;从而为细胞内标记过程的安全性提供了实验依据。     

孕妇血清标记物在出生缺陷干预措施中的应用

目的探讨孕妇血清标记物应用在孕早、中期进行产前唐氏筛查中控制出生缺陷的意义。方法用时间分辨荧光免疫法测定孕妇早、中期个体血清中的妊娠相关血浆蛋白A（PAPP-A）、甲胎蛋白（AFP）、游离人类绒毛膜促性腺激素β亚单位（FhCGβ）及游离雌三醇（uE3）水平,再采用随机配套的Wallac1T、2T专用风险分析软件进行数据计算分析。结果通过对珠海市妇幼保健院常规产检的10604名孕早、中期的孕妇进行产前筛查,在高风险人群中检出DS儿10例、18三体综合征2例、神经管缺陷5例。结论合理利用多种孕妇血清标记物在孕早、中期进行产前筛查,对提高DS筛查的检出率、降低假阳性率、减少创伤性的产前诊断都有着积极意义,从而在对出生缺陷进行有效干预方面具有重要的实用价值。     

NSE时间分辨荧光免疫分析法的建立

采用夹心法建立神经元特异烯醇化酶（NSE）时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）来测定血清中NSE的含量。以NSE单克隆抗体E1包被板,双功能螯合剂异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸络合Eu3＋及标记NSE单克隆抗体E7,发光增强系统为以β-二酮体为主的增强液。采用平衡饱和法建立NSE-TRFIA,数据采用双对数函数数据处理程序处理。本方法的连续批内和批间CV分别为2.4%和4.8%,平均回收率为102.6%,灵敏度为0.31ng/mL,可测范围为0.31～320ng/mL,ED20、ED50和ED80分别为20.72ng/mL、57.23ng/mL和157.25ng/mL。本方法与AFP、CEA均无交叉反应。Eu3＋标记抗体-20℃保存8个月免疫反应基本无损失,同批试剂连续8个月应用分析结果稳定。临床应用检测结果与E170所测值高度相关。实验结果表明,本文所建立的NSE-TRFIA的灵敏度、特异性、准确度等均符合临床应用要求。