含野生型p53cDNA重组逆转录病毒的制备

目的：制备野生型p53cDNA重组体的复制缺陷型逆转录病毒。方法：设计引物PCR扩增野生型p53cDNA，用T－A克隆的方法克隆入质粒载体pGEM-T,转化JM109，提取pGEM-T/p53重组体，双酶切得到野生型p53cDNA,然后再克隆人逆转录病毒表达载体pLXSN,转化感受态大肠杆菌 JM109，筛选pL(p53cDNA)SN重组体，脂质体法转染包装细胞AM12，G－418（geneticin)筛选，收集病毒液。结果：通过PCR和重组质粒酶切筛选出重组阳性克隆，收集含pL(p53cDNA)SN重组体的逆转录病毒。结论：含pL(p53cDNA)SN重组体的复制缺陷逆转录病毒可用于转染真核细胞等进一步研究。     

雄激素受体反义RNA逆转录病毒载体的构建及其鉴定

目的　构建雄激素受体 (AR)反义RNA逆转录病毒载体pL AR SN并进行包装和鉴定。方法　PCR扩增ARcDNA片段并将之反向插入到逆转录病毒载体pLXSN ,用脂质体法转染PA31 7细胞 ,提取转染细胞基因组DNA和培养上清中重组逆转录病毒RNA ,用PCR和RT PCR法进行鉴定 ,NIH 3T3细胞测定病毒滴度。结果　限制性内切酶分析证明pL AR SN含有反向插入的ARcDNA目的片段 ;培养上清中病毒滴度为 2 .34× 1 0 5 CFU/ml,PCR和RT PCR分别从转染细胞基因组DNA和培养上清中的重组逆转录病毒RNA中扩增出了插入的目的片段。结论　成功构建了AR反义RNA逆转录病毒载体并包装出了高滴度的重组逆转录病毒。     

ZNF217肿瘤基因shRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对ZNF217肿瘤基因的shRNA表达载体,以用于后续的RNAi研究.方法 依据设计shRNA的原则,针对人ZNF217的mRNA序列,设计并合成编码的shRNA的两条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至PGenesil-1质粒,构建重组体PGenesil-ZNF217,进行测序鉴定,然后转染重组体至HO-8910细胞中.转染24 h后流式细胞仪检测转染率.结果 酶切及测序证实质粒PGenesil-ZNF217构建成功,转染24 h的HO-8910细胞发出绿色荧光.结论 成功构建的针对人ZNF217基因shRNA表达质粒PGenesil-ZNF217转染进人卵巢癌细胞株HO-8910细胞,为后续研究以及卵巢癌的基因治疗奠定了基础.     

FasL基因转染Hela细胞体外诱导淋巴细胞凋亡的作用

目的 应用FasL基因转染具有上皮细胞特性的Hela细胞，探讨FasL基因的表达对诱导同种异体淋巴细胞凋亡的作用，为解决同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥问题提供一条研究途径。方法 PLNCX2-FasL质粒转化大肠杆菌，抽提纯化的PLNCX2-FasL质粒用限制性内切酶xho Ⅰ，Not Ⅰ酶切，琼脂糖凝胶电泳得到755bp大小的目的条带。紫外灯下切割回收目的条带并抽提纯化得到FasL基因，用xhoⅠ，Not Ⅰ酶切PCDNA3．1质粒载体并在相同位点插入FasL基因，T4酶连接，构建PCDNA3．1-FasL重组质粒。脂质体转染法将PCDNA3．1-FasL基因转染Hela细胞，G418筛选；经过免疫细胞化学法，RT-PCR鉴定后，进行单项淋巴细胞混合试验，检测FasL基因对诱导淋巴细胞凋亡的作用。结果 表达FasL基因的Hela细胞的淋巴细胞刺激指数较对照组转染空白质粒的Hela细胞下调，仅达到对照组刺激指数的17．0l％。结论 FasL基因转染上皮细胞可诱导淋巴细胞凋亡，为研究避免同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥提供了一种可行的方法和设想。     

FasL基因转染Hela细胞体外诱导淋巴细胞凋亡的作用

目的应用FasL基因转染具有上皮细胞特性的Hela细胞,探讨FasL基因的表达对诱导同种异体淋巴细胞凋亡的作用,为解决同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥问题提供一条研究途径.方法 PLNCX2-FasL质粒转化大肠杆菌,抽提纯化的PLNCX2-FasL质粒用限制性内切酶Xho I,Not I酶切,琼脂糖凝胶电泳得到755 bp大小的目的条带.紫外灯下切割回收目的条带并抽提纯化得到FasL基因,用Xho I,NotI酶切PCDNA3.1质粒载体并在相同位点插入FasL基因,T4酶连接,构建PCDNA3.1-FasL重组质粒.脂质体转染法将PCDNA3.1-FasL基因转染Hela细胞,G418筛选;经过免疫细胞化学法,RT-PCR鉴定后,进行单项淋巴细胞混合试验,检测FasL基因对诱导淋巴细胞凋亡的作用.结果表达FasL基因的Hela细胞的淋巴细胞刺激指数较对照组转染空白质粒的Hela细胞下调,仅达到对照组刺激指数的17.01%.结论 FasL基因转染上皮细胞可诱导淋巴细胞凋亡,为研究避免同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥提供了一种可行的方法和设想.     

大鼠FasL基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统的建立

目的 建立真核细胞表达的大鼠FasL基因重组慢病毒载体三质粒包装细胞系统，为进一步研究转FasL基因在同种异体器官移植中诱导免疫耐受、保护移植物的作用奠定基础。方法 制备完整的重组慢病毒载体三质粒系统：转移质粒（pL0134-FasL），包装质粒（ΔNRF）及包膜蛋白质粒（VsV-G）。脂质体法将三质粒共转染包装细胞293T，72h后收集病毒上清，Western-blot法检测293T细胞的FasL蛋白表达。结果 转染后的293T细胞表达FasL蛋白。结论 成功建立重组慢病毒载体的三质粒包装细胞系统。     

Cyclin E干扰RNA对人卵巢癌HO-8910细胞蛋白质组表达的影响

目的使用RNA干扰技术阻断人卵巢癌HO-8910细胞中Cyclin E的表达,分析Cyclin E表达受抑制后产生的一些效应,采用双向凝胶电泳和质谱技术分析鉴定转染前后细胞内差异表达的蛋白质,探讨Cyclin E在人卵巢癌细胞增殖中的作用,以期为人卵巢癌发生、发展、诊断与治疗提供有价值的资料。方法构建质粒表达载体pU6-Cyclin E-siRNA,同时设立阴性对照组和空白对照组。采用脂质体转染法稳定转染卵巢癌HO-8910细胞,G418筛选阳性克隆细胞;噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长曲线的改变;RT-PCR法比较转染前后Cyclin E mRNA的表达量的变化;双向凝胶电泳-图像分析-质谱技术-数据库搜索,比较转染前后蛋白质组表达的变化,鉴定差异显著的蛋白点。结果 1)成功构建了Cyclin E干扰RNA的重组质粒并获得稳定转染组细胞HO-8910-Cyclin E siRNA。2)稳定转染组HO-8910-Cyclin E siRNA细胞与阴性对照组HO-8910-neo细胞和空白对照组相比,细胞生长速度减慢,Cyclin E mRNA表达水平降低。3)通过双向电泳-图像分析-质谱技术得到稳定转染组低表达蛋白5个,经数据库搜索分别是锌指蛋白ZFP-36、波形蛋白、肿瘤拒绝抗原gp96、未知蛋白、DNA校正蛋白酶Ⅱ。结论Cyclin E干扰RNA干扰后卵巢癌HO-8910细胞Cyclin E基因的表达明显降低,细胞增殖能力减弱。差异表达的蛋白质参与细胞的增殖、细胞信号转导调节,并与肿瘤的发生、发展、诊断密切相关。     

转移抑制基因BRMS1对卵巢癌细胞侵袭能力的影响

目的研究转移抑制基因BRMS1对高转移性人卵巢上皮癌细胞(HO-8910PM)侵袭能力的影响。方法脂质体介导将重组真核表达质粒pcDNA3.0-BRMS1转染HO-8910PM细胞;RT-PCR检测转染前后细胞中BRMS1mRNA的表达;Boyden小室法检测细胞侵袭能力。结果与未转染细胞(HO-8910PM)和pcDNA30空质粒转染细胞(HO-8910PM-vect)相比,BRMS1基因转染细胞(BRMS1.c2)侵袭穿透Matrigel基质膜的细胞数降低70.6%(P<0.001)。结论BRMS1基因能抑制卵巢癌细胞HO-8910PM的侵袭能力,为进行卵巢癌基因治疗提供了实验依据。     

IL-18真核表达载体的构建及其在HO-8910细胞株的表达

目的:通过构建人白细胞介素18(IL-18)真核表达载体,观察其在HO-8910细胞株的表达情况。方法:应用分子克隆技术将IL-18基因插入pCI真核表达载体,应用脂质体介导法转染人卵巢癌HO-8910细胞株。转染分3组,空白组:人卵巢癌HO-8910细胞株+脂质体;对照组:卵巢癌HO-8910细胞株+pCI;实验组:卵巢癌HO-8910细胞株+pCI-hIL-18。以RT-PCR方法分别检测3组的IL-18表达情况。结果:成功构建pCI-hIL-18真核表达载体并转染HO-8910细胞株,RT-PCR、ELISA显示转染pCI-hIL-18重组质粒组在转染的细胞内获得表达。结论:IL-18基因能够转染到HO-8910细胞株中并获得表达。     

活性氧介导紫花牡荆素诱导卵巢癌HO-8910细胞调亡

目的:探讨紫花牡荆素(Casticin,CAS)诱导人卵巢癌HO-8910细胞凋亡是否涉及活性氧生成和线粒体膜去极化。方法:体外培养HO-8910细胞。AnnexinⅤ/PI双染色流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率;H2DCFH-DA探针FCM检测细胞活性氧生成;Rh123探针FCM分析细胞线粒体跨膜电位。结果:CAS诱导HO-8910细胞凋亡率增高,呈剂量依赖性。CAS以浓度依赖方式增高HO-8910细胞内活性氧水平。CAS处理细胞的Rh123平均荧光强度显著降低,表明CAS具有诱导细胞线粒体膜去极化作用。N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)部分拮抗CAS诱导细胞凋亡,并能减弱CAS诱导活性氧生成和线粒体膜去极化作用。结论:CAS诱导卵巢癌HO-8910细胞凋亡作用机制可能与促进细胞活性氧生成介导的线粒体膜去极化相关。     

Gene expression profile differences in high and low metastatic human ovarian c ancer cell lines by gene chip

目的：用基因芯片技术研究高低转移人卵巢癌细胞系（HO-8910PM和HO-8910）基因表达谱差异,筛选与转移相关的基因。方法：按一步法分别抽提高低转移人卵巢癌细胞和对照正常卵巢组织的总RNA并纯化mRNA;分别将等量的高低转移人卵巢癌细胞及对照组织的mRNA逆转录合成以Cy5和Cy3标记的cDNA一链做探针,分别混合后在2张含有4096条双点人类全长基因的芯片上进行杂交。经洗片后用ScanArray3000扫描仪扫描芯片荧光信号图像,用ImaGene3.0软件对扫描图像进行数字化处理,计算机分析高低转移人卵巢癌细胞系之间及与正常卵巢上皮基因表达谱差异。结果：人卵巢癌细胞系HO-8910细胞与正常卵巢上皮比较差异3倍以上共有355个基因。高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM细胞与正常卵巢上皮比较差异3倍以上共有323个基因。高转移人卵巢癌细胞系HO-8910PM与母系HO-8910比较差异2倍以上共有165个基因,其中两株细胞系比较差异3倍以上共有21个基因。结论：两株人卵巢癌细胞系与正常卵巢上皮细胞基因表达谱存在差异,提示这些基因与卵巢癌的发生和发展及高转移特性有关。本实验说明利用基因芯片对基因表达谱的检测可以为人体卵巢癌的基因诊断、治疗和预防提供新的方向。     

姜黄素对人卵巢癌细胞株HO-8910增殖和凋亡的影响

目的:探讨姜黄素对体外培养人卵巢癌HO-8910细胞增殖和凋亡的影响。方法:选用人卵巢癌细胞株HO-8910进行体外培养至对数生长期,以0~80μmol/L姜黄素(5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L)分别处理HO-8910细胞24、48、72h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验测定细胞的生长抑制率;流式细胞仪检测不同浓度药物对细胞凋亡率的影响;免疫组化法检测PCNA在细胞中的表达,评价细胞的增殖状态。结果:姜黄素对HO-8910细胞增殖抑制率随药物浓度增加及作用时间延长有升高趋势,呈时间剂量依赖性。姜黄素作用24h随浓度的升高PCNA阳性表达逐渐降低。流式细胞仪分析证实随着浓度的升高细胞凋亡率和膜受损率均提高。结论:姜黄素对人卵巢癌细胞株HO-8910的生长有显著的抑制作用,并能诱导其凋亡。     

紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡及基因调控的研究

目的 探讨紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡的基因调控机制。方法 用紫杉醇诱导卵巢癌细胞HO-8910细胞凋亡，采用荧光染色，透射电镜，流式细胞仪，蛋白免疫印迹等方法进行检测和观察。结果 卵巢癌细胞在紫杉醇作用下，首先表现为G2／M期阻滞，一定时间后出现细胞凋亡。凋亡抑制基因bcl-2在细胞凋亡过程中低表达而促凋亡基因bax呈高表达。结论 紫杉醇可诱导卵巢癌细胞凋亡，bcl-2和bax基因在紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡中可能起着重要的调控作用。     

miRNA-200c在上皮性卵巢癌细胞株及肿瘤组织中的表达变化及意义

目的观察上皮性卵巢癌细胞株及肿瘤组织microRNA-200c(miR-200c)的表达水平,探讨其可能的临床价值。方法采用Real-time RT-PCR技术比较人卵巢癌母细胞系(HO-8910)、卵巢癌高转移能力变异细胞株(HO-8910PM)及HO-8910细胞团簇中miR-141、miR-200c的表达差异。同法测定上皮性卵巢癌(n=83)、交界性卵巢肿瘤(n=13)及正常卵巢组织(n=8)中miR-141、miR-200c的表达,并分析卵巢癌不同临床病理特征下二者的表达差异。结果与HO-8910、HO-8910PM相比,HO-8910细胞团簇中miR-200c表达下调(P<0.05);正常卵巢组织、卵巢交界性肿瘤、卵巢癌中miR-141、miR-200c表达依次上调(P<0.05)。转移性卵巢癌、低分化卵巢癌及透明细胞卵巢癌中miR-200c表达下调(P<0.05)。miR-200c高表达患者预后优于miR-200c低表达者(P<0.05)。结论 miR-200c表达下调与卵巢癌进展相关,可能提示卵巢癌预后不良。     

拓扑替康对人卵巢癌细胞株端粒酶活性表达的影响

目的 :探讨拓扑替康对卵巢癌细胞端粒酶活性表达的影响。方法 :用TRAP ELISA法检测浓度为 2 60 0 0 μg·L-1 的盐酸拓扑替康 (和美新 )作用于卵巢癌HO 8910细胞株不同时间后端粒酶活性的改变 ,并以流式细胞检测法同步检测细胞凋亡及细胞周期改变。结果 :随着拓扑替康作用时间的延长 ,HO -8910细胞株的凋亡率逐渐增加 ,而端粒酶活性逐渐降低。当作用达 60h后 ,细胞凋亡达 47.62 %时端粒酶活性呈阴性。结论 :端粒酶活性抑制不是拓扑替康诱导卵巢癌细胞凋亡的直接原因 ,但临床监测端粒酶活性表达有助于对盐酸拓扑替康抗卵巢癌的疗效进行客观评价。     

CXCL12/CXCR-4对卵巢癌高低转移细胞的作用机制探讨

目的探讨趋化因子CXCL12及其受体CXCR-4对人卵巢浆液性囊腺癌高低转移细胞株HO-8910PM及HO-8910增殖、迁移作用的差异。方法采用流式细胞术分析HO-8910PM及HO-8910细胞中CD44、CD49e、E-cad-herin的表达差异;RT-PCR检测CXCR-4在HO-8910PM及HO-8910细胞中的转录水平差异;比较不同浓度CXCL12对HO-8910PM及HO-8910细胞增殖、迁移能力及对其表面相关黏附分子表达水平的影响。结果流式细胞术检测显示HO-8910PM及HO-8910细胞均表达CD44（97.6%vs 96.2%）,E-cadherin在前者不表达（6.5%）,后者高表达（92.5%）;CXCR-4在HO-8910PM中高表达（93.3%）,在HO-8910中不表达（5.7%）;CXCL12上调HO-8910PM中CD49e的表达（27.6%vs 83.2%,P〈0.05）,并且可促进细胞的增殖和移行。结论趋化因子CXCL12及其受体CX-CR-4在卵巢癌的增殖及侵袭转移中具有重要作用。     

RNA干扰OPN对人卵巢癌细胞HO-8910PM体外增殖的影响

目的观察骨桥蛋白(OPN)基因沉默对卵巢癌细胞系HO-8910PM细胞的影响,为探索卵巢癌基因治疗提供理论依据。方法以脂质体法将已构建的骨桥蛋白特异性小干扰RNA真核表达载体(pSilencer3.1/OPN-shRNA)转染卵巢癌细胞HO-8910PM,48h后用Western blotting技术检测重组质粒组、空质粒组和空白对照组中卵巢癌细胞内骨桥蛋白的表达情况;采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法连续5天测定转染后细胞的增殖情况并绘制曲线图。结果 pSilencer3.1/OPN-shRNA转染卵巢癌细胞株HO-8910PM后48h骨桥蛋白表达下降,差异有统计学意义(同空质粒组、空白对照组相比P<0.05);空质粒组与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。重组质粒组同空质粒组、空白对照组比较其增殖于第1天差异无统计学意义(P>0.05),第2～5天差异有统计学意义(P<0.05);空质粒组与空白对照组比较,第1～5天其增殖差异均无统计学意义(P>0.05)。结论构建的骨桥蛋白特异性小干扰RNA真核表达载体可以抑制卵巢癌细胞HO-8910PM中骨桥蛋白的表达。骨桥蛋白可能与卵巢癌细胞HO-8910P...     

三氧化二砷对卵巢癌细胞抑制作用及机制的研究

目的：探讨三氧化二砷（As2O3）对卵巢癌细胞HO-8910体外生长的影响及其相关机制.方法：用倒置显微镜对细胞进行观察,用免疫细胞化学染色法检测p53基因表达.结果：（1）三氧化二砷作用浓度在0～12.0 μmol/L时,随着剂量的增加对卵巢癌细胞抑制作用增强.（2）卵巢癌细胞p53基因表达增强.结论：较高浓度三氧化二砷对卵巢癌细胞株HO-8910细胞有生长抑制作用并呈剂量-时间依赖效应 As2O3作用引起卵巢癌细胞HO-8910细胞凋亡的机制与p53基因表达增强有关.