Smad3基因siRNA表达载体的构建及沉默效应

背景：研究提示抑制Smad3可望抑制纤维增生和胶原的大量产生。 目的：构建针对Smad3基因的siRNA表达载体,观察RNA干扰对增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的抑制作用。 方法：根据siRNA设计原则,设计3条针对Smad3基因的siRNA靶序列,分别合成两条互补的寡核苷酸链,退火后与载体pRNAT-U6连接,然后进行酶切鉴定和DNA序列测定。用脂质体包裹转染增生性瘢痕成纤维细胞,荧光定量PCR和Western blot方法检测Smad3基因的表达情况。 结果与结论：测序分析结果显示：克隆入pRNAT-U6载体的针对Smad3基因的siRNA的双链寡核苷酸片段插入正确;荧光定量PCR和Western blot检测显示：转染的增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因的表达水平明显降低,尤以AGA CAG ACT GTG ACC AGT A(1156)为靶序列的siRNA沉默作用最强,抑制效率于转染后48 h可达45%。证实实验构建的沉默增生性瘢痕成纤维细胞Smad3基因表达的siRNA载体获得成功。     

Beclin1基因siRNA慢病毒载体构建和鉴定

本研究通过慢病毒载体(pRNAT-U6.2/Lenti)构建靶向Beclin1基因的RNA干扰(RNAi)重组体,用以建立Beclin1基因稳定沉默的非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞株。PCR鉴定结果显示3个扩增的阳性片段均已插入pRNAT-U6.2/Lenti载体;测序结果证明3个重组慢病毒载体pRNAT-U6.2/Lenti-si356、pRNAT-U6.2/Lenti-si423和pRNAT-U6.2/Lenti-si684的插入序列完全正确;重组慢病毒载体感染A549细胞后,RT-PCR和Westernblot检测结果均证实3组重组体感染的细胞内Beclin1mRNA和蛋白表达都受到不同程度的抑制,Beclin1mRNA的沉默效率分别为35.56%、89.22%和66.78%。结果显示成功构建了Beclin1基因的RNAi病毒重组载体,并建立了其稳定表达的NSCLC A549细胞株,为探讨Beclin1基因对NSCLCA549细胞生物学行为的影响提供了新的细胞模型。     

ATF-2基因RNA干扰表达载体的构建及鉴定

目的:构建活化转录因子2(ATF-2)基因RNA干扰的真核表达载体,观察其对HepG2肝癌细胞株增殖及凋亡的影响。方法:根据ATF-2 mRNA序列,合成两条寡聚DNA片段,退火后克隆入质粒载体PBA-siU6,DNA测序鉴定重组质粒PBA-siATF-2。脂质体介导质粒转染HepG2细胞。Westernblot法检测ATF-2蛋白表达;MTT方法检测细胞增殖率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率。结果:ATF-2基因RNA干扰载体经测序分析证实插入64 bp序列正确无误;Westernblot法显示干扰组细胞内ATF-2蛋白表达量明显降低;ATF-2基因的下调导致HepG2细胞增殖阻滞和凋亡发生。结论:成功构建了ATF-2基因RNAi真核表达载体,下调HepG2细胞ATF-2基因表达,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。     

MKRN1基因siRNA重组腺病毒载体构建及功能鉴定

目的 构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体,并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响,为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具.方法 人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列,用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA;在HEK293细胞中包装成重组腺病毒,感染表达MKRN1的HeLa细胞株,用RT-PCR法及Western 印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响,用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化.结果 成功构建了MKRN1的siRNA重组腺病毒载体;MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达,并显著上调细胞中端粒酶的活性.结论 构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性,从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具.     

Bcl-2 siRNA表达载体的构建及生物活性鉴定

目的: 构建bcl-2特异性siRNA真核细胞表达载体，并初步观察其对膀胱癌细胞生长的影响。方法： 根据GenBank 提供的bcl-2 cDNA序列，设计双链小干扰RNA（siRNA），再转化为能表达其小发卡结构RNA（shRNA）的DNA 序列，并与含U6启动子的pGenesil-1质粒定向连接，构建真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555。经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。转染T24细胞，采用半定量RT-PCR观察重组质粒对bcl-2 mRNA表达的影响；用MTT法观察重组质粒对T24细胞体外生长的抑制作用。结果: 构建了bcl-2 siRNA的真核表达载体pGenesil-1545、pGenesil-1555，并经限制性内切酶酶切和DNA 测序证实与设计完全一致。转染T24细胞72 h后，RT-PCR显示bcl〖STBX〗-2〖STBZ〗基因表达下调接近80％；MTT发现T24细胞的体外生长受到明显抑制。结论: bcl-2的特异性siRNA真核细胞表达载体成功构建，有效沉默 bcl-2在膀胱癌细胞中的表达，抑制了癌细胞的生长。     

PTTG基因siRNA载体的构建与鉴定

目的构建针对垂体腺瘤细胞系AtT20的高效率沉默PTTG基因的shRNA表达载体。方法合成特异性干扰PTTG基因的小发卡RNA(shRNA)片段,并与pGenesil2载体连接,构建PTTG干扰载体(pGenesil2-PTTG shRNA)。利用脂质体将其转染AtT20细胞,分为正常细胞对照组、阴性对照组和3个shRNA干扰组(pGenesil2-PTTG siRNA1、2及3),应用半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot法分析转染后AtT20细胞中PTTG的mRNA和蛋白表达水平。结果酶切证实PTTG-shRNA表达载体构建成功;转染效率可达75%左右。转染pGenesil2-PTTG shRNA后,3个干扰组的AtT20细胞中PTTG的mRNA和蛋白表达水平均较正常对照组显著降低(P<0.01)。结论成功构建了能高效沉默PTTG的RNAi表达载体;且pGenesil2-PTTG siRNA高效地抑制了垂体腺瘤细胞AtT20细胞中PTTG綦因的表达。     

Pokemon基因siRNA逆转录病毒重组表达质粒的构建及鉴定

目的针对Pokemon基因对于许多肿瘤抑制基因和原癌基因上游的作用,将其作为RNAi的靶基因,构建表达这些siRNA的重组逆转录病毒表达质粒。方法利用Ambion公司的网上设计工具设计针对Pokemon肿瘤基因的4条siRNA序列,并化学合成4对互补的siRNA的DNA片段。将此双链DNA片段克隆到pSilencer 5．1-H1 Retro vector的Bam HⅠ和HindⅢ位点,构建其逆转录病毒重组表达质粒。结果表达人类Pokemon基因的siRNA逆转录病毒重组表达质粒构建成功。结论我们成功构建了人类Pokemon基因的重组逆转录病毒重组表达质粒,为下一步Pokemon基因的RNA干扰提供了实验依据,并且开辟了肿瘤基因治疗的新思路。     

MEKK3基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对胃腺癌AGS细胞MEKK3的表达抑制

目的 构建人MEKK3基因的小干扰RNA(siRNA)重组腺病毒载体表达载体,观察其在胃腺癌AGS细胞中对MEKK3的表达抑制.方法 设计并合成针对人MEKK3基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以MluⅠ及XhoⅠ克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,得到的质粒用PmeⅠ线性化后在大肠埃项菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组.卡那霉素筛选后,用PacⅠ酶切鉴定.鉴定正确的质粒经PacⅠ酶切、乙醇沉淀后转染293A细胞,包装得到具有感染能力的pAd-MEKK3-siRNA重组腺病毒.病毒体外转导人胃腺癌AGS细胞,Western印迹法检测其对MEKK3蛋白表达的抑制.结果酶切和测序鉴定表明3个MEKK3 siRNA重组腺病毒表达载体正确无误.Western印迹检测结果显示3个pAd-MEKK3-siRNA重组腺病毒表达载体中有两个可有效地抑制胃腺癌AGS细胞中MEKK3基因的表达,其中以pAd-MEKK3-siRNA3的抑制作用最显著,有效率达89 %.结论 成功构建了针对MEKK3基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究MEKK3基因在人胃腺癌AGS细胞中的作用和功能奠定了基础.     

P27特异性siRNA重组腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的 构建针对P27的siRNA腺病毒载体及相应的对照病毒载体,并鉴定重组腺病毒在小鼠胰岛中对内源性p27基因表达的影响.方法 合成针对p27的siRNA的靶DNA序列及相应的阴性对照序列,连接至pShuttle-H1质粒中,然后用Not Ⅰ和Hind Ⅲ限制性内切酶将H1-siRNA片段从pShuttle-H1-siRNA质粒上双酶切下来,克隆至空载pAdTrack穿梭质粒上,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染QBI-293A细胞,包装得到pAd-P27-siRNA和pAd-NC重组腺病毒.用病毒体外感染小鼠胰岛,Western印迹法检测P27蛋白表达水平.结果 重组腺病毒载体经测序鉴定正确,制备的病毒感染效率高,能有效抑制小鼠胰岛中P27的表达.结论 成功构建了针对P27的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究P27在胰岛β细胞生长中的作用提供了基础.     

含TK自杀基因真核表达载体的构建和鉴定

基因治疗恶性肿瘤是当前国内外研究的热点之一，其中以药物敏感基因治疗系统最引人注目。药物敏感基因(drug sensitive gene)又称为“自杀基因”(suicide gene)，可以编码某些病毒或细菌的酶类，从而催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体转变为具有毒性的代谢产物，干扰细胞DNA的合成，选择性地杀死快速增殖的肿瘤细胞，而对正常组织无毒、副作用。     

大鼠NgR特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的将siRNA技术应用于NgR（Nogo受体）,构建出有效的NgR特异性siRNA慢病毒载体。方法按照E1bashir等设计原则和siRNA的要求,设计、合成4对siRNA,并将其与双酶切慢病毒载体pGCSIL-GFP连接,转化,挑取阳性克隆进行PCR鉴定,阳性克隆送测序。结果4对NgR特异性siRNA与双酶切慢病毒载体pGCSIL-GFP连接成功。结论4对NgR特异性siRNA慢病毒载体的构建成功,为进一步合成病毒载体及观察NgR特异性RNA干扰抑制大鼠NgR mRNA表达对脑白质损伤的修复作用奠定了基础。     

转录因子Twist的siRNA筛选、腺病毒构建及功能检测

目的 筛选特异性沉默人的Twist基因的siRNA序列,构建siTwist腺病毒并在MG63及143B骨肉瘤细胞中进行功能鉴定.方法 体外退火获得4组siTwist双链DNA序列,克隆至含有Twist基因的pSOS-Twist质粒中获得pSOS-siTwist质粒,脂质体转染HEK293细胞,GFP检测筛选有功能的siTwist片段,将筛选出的siTwist序列构建腺病毒,感染143B骨肉瘤细胞.通过RT-PCR、Western 印迹检测Twist的表达.siTwist与Twist腺病毒共感染MG63骨肉瘤细胞,细胞计数及细胞侵袭实验检测siTwist对Twist的抑制作用.结果 在HEK293细胞中,4组siTwist中有2组GFP的表达明显降低,且siTwist腺病毒能抑制143B骨肉瘤细胞中内源性的Twist表达,Twist腺病毒能促进MG63骨肉瘤细胞的增殖和转移,而两组siTwist与Twist共感染组MG63细胞的增殖及迁徙率均明显低于Twist组(P<0.05).结论 筛选出两对特异性沉默Twist基因的siRNA片段,并成功构建腺病毒,转染细胞后能有效抑制内源性和外源性的Twist表达,为研究Twist在骨肉瘤细胞增殖和转移中的作用及具体机制提供了有效的分子工具.     

小鼠Hsp27基因siRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

Hsp27是小分子量热休克蛋白亚家族的重要成员之一,主要参与细胞内蛋白质的折叠、抗凋亡、甾体激素合成、氧化应激及信号通路等生理过程。为进一步研究其生理与病理生理功能,本文构建了针对小鼠Hsp27基因的小分子干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体,并在AD-293细胞中与Hsp27超表达载体共同转染,观察其对Hsp27表达的影响。根据siRNA靶序列的设计要求,设计并合成针对小鼠Hsp27的siRNA靶DNA序列,克隆至穿梭载体pShuttle-H1中,与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组,转染AD-293细胞,包装得到含siHsp27的重组腺病毒,在体外与Hsp27超表达载体共转AD-293细胞。通过酶切鉴定、序列测定和Westernblot鉴定,确定小鼠Hsp27siRNA重组腺病毒载体构建成功,且该重组腺病毒能降低67％的Hsp27蛋白表达。本文构建的针对小鼠Hsp27基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究Hsp27基因的功能奠定了基础。     

细胞周期蛋白E siRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的构建细胞周期蛋白E(Cyclin E)小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,并检测其抑制乳腺癌细胞株MCF-7中Cyclin E表达的效果。方法根据基因文库中Cyclin E的cDNA序列,设计并合成两段siRNA,分别转入到pGENESIL-1质粒中,并对重组质粒(命名为pGENESIL/Cyclin E-1和pGENESIL/Cyclin E-2)进行测序鉴定。脂质体介导下转染MCF-7细胞株,RT-PCR检测转染后Cyclin E的表达。结果Cyclin E siRNA真核表达载体构建成功,测序结果显示插入片段的方向和序列与预想一致。RT-PCR检测显示Cyclin E的表达显著降低。结论Cyclin E siRNA真核表达载体的成功构建为进一步研究以Cyclin E为靶位点对乳腺癌进行基因治疗奠定了重要的实验基础。     

人β-神经生长因子基因真核细胞表达载体的构建与鉴定

目的构建人β-神经生长因子基因(β-NGF)的真核细胞表达载体,为运用进行基因治疗和细胞移植的研究奠定基础。方法采用RT-PCR方法从人脑肿瘤旁组织的mRNA中扩增人β-神经生长因子的基因片段,将目的基因、真核表达载体pcDNA3同时经HindⅢ和Apa双酶切、纯化、连接、转化及筛选而构建重组载体pcDNA3-β-NGF;经酶切和测序对重组体进行分析和进一步鉴定。结果RT-PCR产物琼脂糖电泳结果显示：在预期位置有阳性条带。重组载体经酶切、测序等分析插入的基因片段为表达β-NGF的基因。结论人β-NGF基因重组真核细胞表达载体pcDNA3-β-NGF构建成功,为进一步开展β-NGF基因治疗脑部疾患、脊髓损伤修复等研究奠定基础。     

PEX慢病毒载体构建及其在293FT细胞中的分泌表达

目的 构建含人MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒,并在293FT细胞中分泌表达PEX蛋白.方法 利用RT-PCR、基因重组等技术,构建含MMP-9信号肽-MMP-2-PEX片段的重组慢病毒表达载体pBPLV-signal-PEX,在脂质体介导下与包装质粒(pLP1、pLP2)、包膜质粒(pLP/VSVG)共转染293FT细胞,包装产生慢病毒并进行滴度测定.慢病毒感染2931;3"细胞后,Western印迹法检测293FI"细胞培养上清中PEX的表达.结果 酶切和DNA测序表明慢病毒表达载pBPLV-signal-PEX构建正确,四质粒共转染293FT细胞成功获得慢病毒;慢病毒感染293FT细胞后,在细胞培养卜清中可检测到PEX蛋白的表达.结论 成功构建了含人PEX的重组慢病毒,在体外有效感染293fT细胞并持续分泌表达目的 蛋白,为进一步研究PEX在肿瘤侵袭与转移中的作用提供实验基础.     

Construction and Expression of Eukaryotic Expression Vector and Plasmid Expressing siRNA of Human Protection of Telomeres 1

1 IntroductionThe POT1 (protection of telomeres 1) protein binds the single-stranded overhang at the ends of chromosomes in diverse eukaryocytes. It is essential for chromosome end-protection in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, and it is involved in regulation of telomere length in human cells. Human POT1 had been identified in 2001 year. Its amino terminal is highly conservative in eukaryocytes. Since Pot1 can bind internal loops and directly adjacent DNA-binding sites, it is…     

HBsAg真核表达质粒的构建和鉴定

目的 构建HBsAg真核表达质粒。方法 用PCR的方法从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因，并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3．1( )，构建成重组质粒pcDNA3.1—S；然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定结果经酶切和DNA序列测定鉴定，证实重组质粒构建正确。结论 真核表达质粒pcDNA3．1—S构建成功。     

Construction and Expression of Eukaryotic Expression Vector and Plasmid Expressing siRNA of Human Protection of Telomeres 1

1 Introduction The POT1 (protection of telomeres 1 ) protein binds the single-stranded overhang at the ends of chromosomes in diverse eukaryocytes. It is essential for chromosome end-protection in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, and it is involved in regulation of telomere lengthin human cells. Human POT1 had been identified in 2001year. Its amino terminal is highly conservative in eukaryocytes. Since Pot1 can bind internal loops and directly adjacent DNA-binding sites, it is likely to fully coat and protect both G-strand overhangs and the displaced G strand of a T-loop. It also participates in the regulation of telomere maintenance by telomerase or of chromosome by other enzymes. But its biological function and mechanism are still unknown. hPOT eukaryotic expression vector(pcDNA3- hPOT1 ) and 3 kinds of siRNA expression vectors(pmU6-shDNA1, pmU6-shDNA2 and pmU6-shDNA3)had been constructed. And there were overexpression and RNA silence in HeLa cells.