微管骨架在登革病毒感染ECV304细胞中作用的初步研究

目的研究登革病毒在与ECV304细胞相互作用过程中细胞微管骨架的变化,以及微管在病毒释放过程中的作用.方法用2型登革病毒感染ECV304细胞株,间接免疫荧光双染色技术观察微管和病毒抗原的分布;应用colcemid破坏微管骨架,检测细胞内外病毒滴度的变化,以明确微管是否参与病毒的复制.结果登革病毒感染后ECV304细胞微管骨架的排列发生明显的变化,表现为3种类型:无序排列;围绕核形成环状结构;微管结成束状形成线状突触.间接免疫荧光双染色结果显示登革病毒抗原与微管共染,分布在微管组织中心.感染后8 h,药物组上清中的病毒滴度高于一般感染组,而细胞内的病毒滴度低于一般感染组.结论登革病毒感染引起ECV304细胞微管的排列发生变化,可能是病毒感染造成了微管解聚,后者促进病毒的释放;药物的添加,加剧了对微管的破坏程度,从而进一步促进了病毒的释放.     

小鼠胚胎干细胞磁标记共振成像的研究

目的 应用超顺磁氧化铁（SPIO）标记小鼠胚胎干细胞（ESC）,并行磁共振成像,为心肌细胞移植体内示踪作初步准备。方法 小鼠ESC及其分化的心肌细胞与SPIO孵育后行电镜分析、细胞内铁含量测定、[Ca^2＋]共聚焦测定和MR成像。结果 铁颗粒分布在胞质吞饮小泡内;使用转染技术的铁摄取高于未使用组;T2WI和T2^＊ WI扫描序列均见标记细胞呈信号下降,程度随标记浓度的增加而增强;T2^＊ WI图像信号强度变化更大。标记心肌细胞在T2^＊ WI序列也呈显著的低信号改变。结论 SPIO可有效标记ESC及其分化的心肌细胞,对细胞活性和分化能力无明显影响。常规1．5TMR仪可进行标记细胞成像。     

超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞的磁共振成像研究

目的:探讨超顺磁性氧化铁纳米粒子(Superparamagnetic iron oxide,SPIO)体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的适当浓度和不同标记浓度对细胞的生物学活性影响,以及经MR成像的特征等.方法:选取第5代细胞进行不同浓度SPIO标记,运用光学显微镜观察铁颗粒在细胞内的位置、分布及标记率;选取适当浓度标记量,使用1.5T磁共振进行T1wI、T2WI、T2*WI扫描,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析.结果:标记后的铁颗粒均位于细胞质内;含量在25～50μg Fe/ml的培养液是SPIO标记干细胞的安全浓度,在此浓度阈值标记后孵育24 h即可有效标记细胞97%～100%;SPIO标记的MSCs在T1WI,T2WI及T2*WI序列信号均降低.结论:SPIO可以简便标记MSCs.并且在适当浓度下对MSCs的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可有效显像磁性标记的干细胞,为下一步活体试验奠定基础.     

探讨不同浓度 SPIO 对人成纤维细胞标记率和细胞活力影响及其MRI的实验研究

目的:探讨不同浓度超顺磁性氧化铁纳米粒子( Super-paramagnetic iron oxide,SPIO)体外标记人成纤维细胞 (Human fibroblast cells,Hfbs) 的磁性标记率、对细胞生长活力的影响,以及体外磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI) 成像的特征.方法:将单纯 SPIO(铁浓度为 200 μg/ml )、不同浓度的SPIO-多聚赖氨酸复合物分别与培养基混合( 铁的终浓度分别为 150、100、50、25 μg/ml,PLL 终浓度为 7.5 μg/ml ),加入 Hfbs 共同培养 12、24、48、72 h 后收集细胞.采用台盼蓝排除试验检测细胞活性和普鲁士蓝染色法检测细胞铁分布.运用光学显微镜、透射电镜观察铁颗粒在细胞内的位置、计算其标记率;MR 扫描观察细胞信号强度变化情况.结果:SPIO-多聚赖氨酸复合物组细胞标记率显著高于单纯 SPIO 标记组 (P<0.05 ), 台盼蓝排除试验显示,100 μg Fe/ml 及其以下浓度组细胞活力与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05 ).普鲁士蓝染色显示每个标记细胞胞质内可见多少不等的蓝染铁颗粒,电镜显示铁颗粒集中于内涵体和溶酶体中;含量在 25～50 μg Fe/ml 的培养液是 SPIO 标记干细胞的安全浓度,在此浓度阈值标记后孵育 18～24 h 即可有效标记细胞 95%～100% ;MR扫描显示标记细胞信号强度明显降低.结论:自制合成的 SPIO-多聚赖氨酸复合物可以简便、安全的标记人成纤维细胞.并且在适当浓度 25 μg Fe/ml 标记细胞不仅标记效率高,而且对细胞活力无明显影响,SPIO 标记细胞明显降低MR扫描下的细胞信号强度.     

TGFβ1对人血管内皮细胞整合素β3及粘着斑激酶表达的影响

目的　观察转化生长因子 β1 ( TGFβ1 )对培养的人血管内皮细胞表面整合素 β3 表达及粘着斑激酶 ( focal adhesion kinase,FAK)活性的影响。方法　采用细胞 - EL ISA和免疫沉淀 -蛋白质酪氨酸激酶活性测定法。结果　 1ng/ m l、5 ng/ ml及 10 ng/ ml浓度的 TGFβ1 分别作用于培养的人血管内皮细胞 ( ECV30 4) 6、2 4和 48小时后 ,其细胞表面整合素 β3 蛋白的表达均增加 ( P<0 .0 5 ) ,且呈剂量依赖性。 5 ng/ m l和 10 ng/ m l的 TGFβ1 作用于培养的 ECV30 46小时和 2 4小时后 ,细胞中 FAK活性明显增高 ( P<0 .0 5 )。结论　 TGFβ1 促进血管内皮细胞表面整合素 β3 的表达和 FAK活性增高 ,可能是单核细胞和内皮细胞之间粘附功能增加 ,血管增生的机制之一     

肌动蛋白磷酸化在溶血磷脂酸致乳腺癌细胞迁移中的作用

目的:研究肌动蛋白磷酸化在溶血磷脂酸(LPA)致乳腺癌细胞(MDA-MB-231)肌动蛋白细胞骨架重构及细胞迁移中的作用.方法:10 μmol/L LPA孵育MDA-MB-231细胞4 h,用Transwell法检测细胞迁移速度;用Western blot及免疫印迹技术检测细胞内骨架组分及胞浆组分中肌动蛋白的分布改变;用二维电泳法分离并比较细胞内骨架组分及胞浆组分中磷酸化和非磷酸化的肌动蛋白含量.结果:10 μmol/L浓度的LPA可明显增加MDA-MB-231细胞迁移速度.LPA处理后细胞内F-肌动蛋白含量明显增加,而肌动蛋白总量并未出现明显变化.此外,LPA处理还可明显升高细胞内胞浆组分中磷酸化的肌动蛋白量;在骨架组分中,肌动蛋白仅以磷酸化的形式存在,且含量在LPA刺激前后无明显差异.结论:LPA可促进乳腺癌细胞的迁移能力及细胞骨架发生聚合,其作用可能与其改变细胞胞浆中肌动蛋白的磷酸化水平有关.     

超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的探讨应用超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxid,SPIO）标记间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）的有效性、安全性及可靠性。方法分离、培养SD大鼠MSCs,通过流式细胞仪分析鉴定表面抗原CD34、CD44。选取第4代MSCs,在铁（Fe）浓度为25、50、75μg.ml-1和多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine,PLL,0.75μg.ml-1）的DMEM/F12培养液中,孵育48h,作为3个实验组。通过普鲁士蓝染色、流式细胞仪检测、台盼蓝染色及MTT细胞增殖活性检测SPIO,探讨不同SPIO浓度对MSCs标记效率、免疫学表型、细胞活性及增殖的影响。结果经Fe浓度为25、50、75μg.ml-1SPIO标记后,普鲁士蓝染色标记效率均在99%以上;3个实验组细胞表面均表达CD44,阳性细胞率为超过98%。与对照组相比,Fe浓度为25、50μg.ml-1的SPIO标记的MSCs活细胞比率均在96%左右,细胞增殖活性差异无统计学意义,而Fe浓度为75μg.ml-1时,活细胞比率约为93%,对细胞的增殖有明显的抑制作用（P〈0.05）。培养4周,细胞内检测不到SPIO。结论全骨髓直接贴壁法可以成功分离、培养MSCs。超顺磁性氧化铁在PLL介导下,能高效地标记MSC,且在合适的浓度范围不会影响MSCs的免疫学表型、细胞活性及增殖能力等生物学特性。细胞内的SPIO,大约在4周左右,即可被完全降解。     

Fca受体在人支气管平滑肌细胞的表达与功能研究

目的 探讨Fca受体在人支气管平滑肌细胞的表达特征及其功能.方法 采用RT-PCR和免疫荧光技术,从基因和蛋白水平检测Fca受体在人支气管平滑肌细胞的表达;以Fura-2/AM为细胞内钙离子荧光指示剂,观察IgA对人支气管平滑肌细胞内钙离子浓度的影响.结果 RT-PCR和免疫荧光染色方法、均检测到Fca受体在人支气管平滑肌细胞的表达.slgA与人支气管平滑肌细胞孵育90min后,细胞内Ca2 浓度明显增高,差异具有显著性(P＜0.05).mlgA与人支气管平滑肌细胞孵育90min后,细胞内Ca2 浓度无明显改变(P＞0.05).结论 Fca受体在人支气管平滑肌细胞存在表达,slgA使人支气管平滑肌细胞内钙离子浓度增高.     

流体剪切力和细胞骨架阻断对肌动蛋白丝的影响

目的：探讨流体剪切力对成骨细胞细胞骨架的影响.方法：实验分为3组,Ⅰ组（流体剪切力）,Ⅱ组（流体剪切力＋细胞松弛素D,Cytochalasin D）,Ⅲ组（流体剪切力＋噻氨酯哒唑,Nocodazole）.分别对Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ组施加12dyne/cm2流体剪应力,应力作用时间分别为：0,10,30,60min.采用激光共聚焦显微镜、免疫荧光显微镜技术和免疫荧光染色方法对小鼠成骨细胞骨架进行形态学观察、F-肌动蛋白表达的荧光定量分析.结果：细胞在不同时间点受到同一剪切应力后,细胞的排列方向发生改变,细胞内的F-肌动蛋白排列同应力方向一致,随着应力时间延长到1h,F-肌动蛋白变得厚而丰富,F-肌动蛋白的荧光强度同0时段剪切力组相比明显增强（P〈0.01）.当加入细胞松驰素D后,细胞内F-肌动蛋白结构发生改变,在力的作用下,细胞内微丝断裂明显,随着拉伸时间的延长,微丝断裂更为明显,F-肌动蛋白的荧光强度同0时段剪切力组相比显著减弱（P〈0.01）.加入噻氨酯哒唑后,在剪切力作用下细胞内微管断裂,F-肌动蛋白丝完整且边缘呈锯齿状改变,它的荧光强度同0时段剪切力组相比也有明显减弱（P〈0.05）.结论：不同时间点受到同一剪切应力对细胞骨架微丝、微管结构产生一定的影响,微丝解聚和重排以及微管断裂与否在细胞力传导中起重要作用.     

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法研究

目的:使用超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIO)对成肌细胞进行体外标记,探讨SPIO标记方法及SPIO对细胞的影响.方法: 常规方法进行成肌细胞培养,应用脂质体包被的SPIO标记成肌细胞,用光镜及电镜观察标记效率及对细胞增殖的影响,台盼蓝染色及JC-1观测SPIO对细胞活力的影响.结果: 普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒,单纯SPIO标记有效率为50%,脂质体包被的SPIO标记有效率为100%,电镜也观测到细胞内的SPIO颗粒.SPIO标记对细胞无毒性,不影响细胞的增殖及活性.结论: 脂质体包被SPIO标记成肌细胞方法简单、高效、无毒,可用于磁共振对标记细胞进行活体内外无创动态示踪研究.     

胎牛血清促进色素上皮衍生因子在皮肤角质形成细胞和成纤维细胞中的表达

目的:探讨表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞中色素上皮衍生因子(PEDF) 表达的影响因素.方法:体外培养角质形成细胞和成纤维细胞,并以10%FBS(胎牛血清)刺激,通过免疫荧光和Western blot检测PEDF的表达.结果:PEDF大多位于细胞浆中,但在细胞核中也有少量表达.细胞浆中PEDF并非均质型分布,而是呈细颗粒状集聚.10%FBS促进角质形成细胞和成纤维细胞中PEDF的集聚和表达,而且这一分布形式不受组胺和佛波肉豆蔻醋酸(PMA) 的影响.结论:10% FBS促进角质形成细胞和成纤维细胞中PEDF的集聚和表达.     

干细胞的磁性标记及肝内活体磁共振示踪

目的:探讨超顺磁性氧化铁(SPIO)标记骨髓干细胞的方法和标记细胞在肝脏内的磁共振活体成像特点和衰减规律.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,用SPIO标记细胞并在超声引导下局部注入兔肝脏内,然后经磁共振T1WI, T2WI和FFE序列进行移植细胞团的成像示踪.结果:体外标记的骨髓干细胞见黑色铁颗粒位于细胞胞质内,标记后细胞的生长曲线与正常细胞一致. 标记的移植细胞团在肝内T1WI, T2WI和FFE序列上均呈低信号,以FFE图像信号减低最为明显并有面积增大效应. 标记细胞的信号减低区在T1WI, T2WI和FFE序列图像上分别至注射后30, 30 和45 d仍和注射前信号差异有统计学意义(P＜0.05),并分别持续至注射后38, 38 和60 d低信号才消失.结论:SPIO可以简便、有效地标记骨髓干细胞,且对细胞的活性没有影响;MRI可对标记后的移植细胞进行活体内示踪,并可长期动态观察,这对进一步的实验研究和疗效观察研究具有重要意义.     

大鼠问充质干细胞对肝肿瘤趋向性及其间质的影响

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)在体内对肝肿瘤微环境的趋向性以及BMSC对肝肿瘤间质的影响.方法获取大鼠BMSC,分离、培养、扩增.应用超顺磁氧化铁(SPIO)颗粒标记细胞,普鲁士蓝染色鉴定.应用walker-256细胞株肝内种植制备大鼠肝肿瘤模型.实验分为两个实验组,(1)肿瘤成块后BMSC干扰组:肝内种植walker-256细胞6～8 d后,磁共振(MR)观察肝内成瘤后,大鼠尾静脉植入磁性标记的BMSC;(2)肿瘤成块前BMSC干扰组:肝内种植walker-256细胞3 d后,MR观察肝内未成瘤的大鼠,于尾静脉植入磁性标记的BMSC;一个单纯肝内种植肿瘤细胞的对照组.实验组分别在BMSC移植前及移植后5、10及15 d行MR扫描,每次成像后处死若干大鼠,取出肝脏及肿瘤组织分别行HE染色、普鲁士蓝染色,取BMSC移植后第10天的实验组大鼠及相应对照组大鼠组织行血管内皮生长因子(VEGF)、CD31、vWF免疫组化染色.结果 BMSC普鲁士蓝染色表明BMSC的磁标记率达90％.移植后第5、10天,实验组MR扫描T<,2>WI显示肿瘤边缘出现结节状低信号,移植后第15天无明显低信号,对照组肿瘤信号无明显变化.普鲁士蓝染色显示移植后5、10及15 d肿瘤边缘及瘤内有蓝染的BMSC颗粒.移植后第10天,两个实验组的VEGF、CD31、vWF的表达均高于对照组(F=34.03,P<0.01;F=84.24,P<0.01;F=7.08,P<0.05).结论 大鼠BMSC在活体内对肝肿瘤有明显的趋向性,并在肝肿瘤内促进血管内皮的生成.     

纳米磁性探针转染大鼠外周血内皮祖细胞的磁共振成像实验研究

目的 建立稳定的体外分离培养、诱导分化大鼠外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs),及应用纳米磁探针体外标记EPCs的方法,磁共振(MR)进行标记细胞成像.方法 抽取SD大鼠外周血,应用Ficoll密度梯度离心的方法获得单个核细胞,同时应用VEGF和bFGF 诱导,使之向内皮细胞分化,以免疫细胞化学鉴定贴壁细胞的内皮标志.制备Fe2O3-arginine复合物,对EPCs进行磁探针标记,应用MR进行细胞群成像.结果 经VEGF和bFGF诱导后的EPCs的内皮标志CD31、CD34、Flk21和vWF在不同时段呈阳性表达.普鲁士蓝染色可见铁颗粒位于细胞质内,标记率接近100%;磁共振成像(MRI)显示标记的细胞群信号强度的变化较未标记细胞群信号降低.结论 大鼠外周血中含有EPCs,在体外特殊诱导环境下,可定向分化为内皮样细胞.Fe2O3-arginine可以有效标记EPCs构建纳米生物探针,临床应用型1.5T MR可在体外进行标记细胞群成像.     

不同粒径和浓度超顺磁性氧化铁MR信号特征的实验研究

目的:研究超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide,SPIO) 对周围质子的弛豫时间的影响,探讨不同颗粒、浓度SPIO的MR信号特征. 方法:对不同粒径及浓度的SPIO颗粒进行磁共振扫描,记录各个粒径和浓度的SPIO颗粒的MR T1、T2、T2~*值,评价其信号特征.结果:①不同粒径的SPIO颗粒T1值与浓度呈负相关线性关系;②当SPIO浓度较低时,随粒径减小T2和T2~*值则上升明显;当SPIO浓度较高时,随粒径减小上升渐趋缓慢;③lg(T2)与SPIO颗粒粒径和浓度之间存在线性依存关系.结论:SPIO颗粒对MR信号的影响以T1和T2效应为主;T2值可作为SPIO颗粒MR成像的主要检测指标;SPIO粒径大小、浓度和T2值三者之间存在着特定的线性关系.     

仙草提取物对小鼠脾淋巴细胞DNA氧化损伤保护作用的研究

目的:观察仙草提取物对原代培养脾淋巴细胞H2O2所致DNA氧化损伤的保护作用。方法:原代培养24 h的脾淋巴细胞悬液,随机分为6组,其中4组细胞用不同浓度的仙草提取物溶液预先处理60 m in,再加入50μm o l/L的H2O2,H2O2染毒组直接加入相同浓度的H2O2,空白对照组加入等量的PBS溶液,6组细胞共同在4℃下染毒20 m in,收获细胞同时进行单细胞凝胶电泳,最后用激光共聚焦显微镜拍摄图像,计算DNA迁移的细胞率和总彗星长度。结果:H2O2可致原代培养脾淋巴细胞DNA的严重损伤,而仙草提取物能不同程度地降低H2O2诱导产生的DNA损伤,在10、50、100μg/m l的浓度下,彗星细胞出现率从阳性对照组的100%分别降低为88%、60%和36%(P分别<0.05、0.01、0.01),总彗星长度也从对照组的(49.56±6.94)μm,逐渐降低为(41.14±5.64)μm、(38.89±9.81)μm、(28.62±4.66)μm(P分别<0.05、0.01、0.01)。结论:仙草提取物具有显著的抗氧化功能,能在一定浓度范围内保护细胞免受氧自由基对DNA的氧化损伤。     

SPIO标记骨髓间充质干细胞移植入心肌梗死大鼠的示踪研究

目的探讨超顺磁性氧化铁微粒(SPIO)体外标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)及体内示踪移植入大鼠心肌梗死心脏的BMSCs的能力。方法使用左旋多聚赖氨酸-SPIO共培养方式标记BMSCs。采用普鲁士蓝染色观察细胞内铁颗粒,流式细胞术检测细胞活力,将经过SPIO标记的干细胞移植入心肌梗死大鼠心脏,应用1.5TMRI系统行磁标记干细胞成像。超声心动图检测各组心脏的左室射血分数(EF),左室舒张末期内径(LVIDd),左室收缩末期内径(LVIDs)及短轴缩短率(FS)。结果普鲁士蓝染色显示,SPIO标记的BMSCs细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒,标记效率为(99.81±1.57)%;与正常未标记细胞相比较,细胞的活力差异无统计学意义(P0.05)。标记了SPIO的BMSCs体内MRI成像时显示,细胞移植区域信号缺失,对应区域病理切片普鲁士蓝染色可见胞浆内染色阳性的细胞。超声心动图显示,PBS组FS移植前后没有明显变化,BMSC组FS从移植前的(23.1±1.88)%上升到第1周的(31.28±4.15)%。BMSC组EF在移植前是(51.13±5.07)%,第1周时上升到(60.12±8.40)%。结论 SPIO能成功地标记BMSCs,且对BMSCs的活力无明显影响。BMSCs移植后能改善心梗大鼠的心功能。SPIO标记的BMSCs移植后在大鼠体内的分布、迁移过程可用MRI进行检测评价。