抑制性消减杂交技术检测骨髓CD34^＋细胞基因差异表达

目的 检测、比较骨髓和动员外周血2种来源不同的CD34^ 细胞基因表达的差异。方法 从-健康供者分别获取骨髓和动员外周血，分离出CD34^ 细胞，利用抑制性消减杂交技术检测。比较该2种来源不同的CD34^ 细胞基因表达差异。结果 在骨髓CD34^ 细胞中共有21个基因高表达。主要涉及2类：（1）与细胞周期S期，G2期和M期转化相关的基因；（2）C/EBP（CCAAT/增强子结合蛋白）转录因子家族。结论 骨髓和外周血CD34 细胞在基因表达上具有明显的不同，大部分骨髓CD34^ 细胞处于S期，G2期和M期，提示骨髓CD34^ 细胞比外周血CD34^ 增殖活跃。     

脐血CD34^＋细胞免疫表型的分析

应用免疫磁珠法分离脐血ＣＤ３４＾＋细胞，以比较ＣＤ３４＾＋细胞亚群及各系相关抗原的变化。经过分离，ＣＤ３４＾＋细胞由１．４７±０．７７％升至５７．３９±１６．１７％，分离后ＣＤ３４＾＋ＣＤ３８＾－细胞占ＣＤ３４＾＋细胞的比率为７．８２±４．７９％ＣＤ３４＾＋。细胞纯化同时可减少ＣＤ３＾＋细胞达１４．１２±９．１８倍，ＣＤ１５＾＋细胞减少１６．４２±２１．４７倍；Ｂ系（ＣＤ１９）、巨核系（ＣＤ４１）     

脐血CD34^＋细胞分离方法比较

目的：比较不同方法分离脐血单个核细胞（MNC）及纯化CD34＋细胞效果。方法：采集脐血48份，在室温下保存12、24、48小时，分别用密度离心法和羟乙基淀粉（HES）沉淀法分离脐血MNC，再用免疫磁珠法纯化CD34^＋细胞，以台盼蓝拒染法检测细胞存活率。结果：脐血在室温下保存48小时分离MNC和CD34^＋细胞数最多．其次为12小时，在24小时分离所得最低（P〈0．05）；HES沉淀法较密度离心法分离所得MNC和CD34^＋细胞数明显增多（P〈0．05）；6组细胞存活率差异无统计学意义（P〉0．05）；免疫磁珠法纯化CD34^＋细胞可达（88±5）％的纯度。结论：HES沉淀法优于密度离心法，且48小时分离为优，免疫磁珠法纯化CD34＋细胞可提高纯度：各种方法对细胞存活率无明显影响。     

人脐血CD34^＋细胞的分离纯化及电镜观察

采用ＭＡＣＳ吸附单克隆抗体－磁珠分离系统对人脐血ＣＤ３４＾＋细胞进行了分离及透射电镜观察，结果显示：ＣＤ３４＾＋细胞为形态，大小不均一的单个核细胞群体，细胞直径介于５￣１０ｕｍ，其中少数细胞胞体大而圆，细胞核圆，核膜凹陷浅，核染色质细而弥散，核周胞质少，游离核糖体较多，线粒体少且形态特殊，即线粒体嵴内间隙较大，此形态特征与造血干细胞之间的关系尚有待进一步研究证实。     

小剂量G-CSF联合GM-CSF动员外周血CD34^＋细胞

OBJECTIVE: To study the efficacy of combined use of low-dose granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) in mobilizing hematopoietic stem/progenitor cells. METHODS: Twenty adult patients with malignant hematologic diseases were paired using statistical methods, and the 10 pairs were divided into 2 equal groups. For non-Hodgkin lymphoma, the treatment regimen adopted intravenous infusion of cytoxan (2 g/d for 1 or 2 d) and VP16 (0.2 g/d for 1 to 3 d), while for acute non-lymphocytic leukemia, Ara-C (2 g/d for 1 to 3 d) and VP16 (0.2 g/d for 1 to 3 d) were used. When the while blood cell count (WBC) was below 1.0 x10(9)/L, G-CSF and GM-CSF were administered subcutaneously at the same dose of 2.5 microg/d.kg in the 10 patients in the experimental group, while the patients in the control group received only 5 microg/d.kg G-CSF, both for 5 to 6 d. After WBC>5.0 x 10(9)/L, the peripheral blood mononuclear cells (PBMNC) were separated by CS-3000 pluse separator and CD34+ cells were determined by flow cytometry. RESULTS: The purity of the isolated PBMNC was 95%-99%. In the experimental group, the mean number of CD34+ cells acquired was 9.4 x 10(6)/kg ranging from 8.4 x 10(6) to 10.2 x 10(6)/kg, and granulocyte-macrophage colony-forming unit (CFU-GM) was 42.4 x 10(4)/kg on average ranging from 21.9 x 10(4) to 72.8 x 10(4)/kg, as compared with 4.8 x 10(6)/kg [(4.1-8.3) x10(6)/kg] for CD34+ cells and 28.1 x 10(4)/kg [(7.1-60.2) x 10(4)/kg] for CFU-GM in the control group (P<0.05). No obvious difference was observed between the two groups in terms of the adverse effects of the treatment (P>0.05). CONCLUSION: Combined use of G-CSF and GM-CSF can be more effective than the exclusive use of GM-CSF for mobilizing CD34+ cells.     

CD34^＋细胞与骨髓增生异常综合征患者生存率的关系

目的 探讨CD34^ 细胞与骨髓增生异常综合征（MDS）患者生存率的相关性。方法 应用免疫组化SAP法对56例MDS患者骨髓细胞CD34抗原进行检测,并随访3－5年,同时定期门诊复诊及住院治疗。结果 56例中,CD34^-33例,CD34^ 23例,随访3－5年后,阴性组10例（30．3％）转为急性白血病（AL）,阳性组14例（60．9％）转为AL,差异有显著性（P＜0．01）。17例RAEB患者中,CD34^-中数生存期47月,CD34^ 者16月,3年生存率前者69％,后者21．1％。12例CD34^ 高表达RAEB－T患者中,转化成AL时间明显缩短。结论 CD34^ 患者具有高危转为AL,CD34^ 高表达RAEB－T短期内转化为AL,提示预后不佳。     

冠状动脉支架置入后CD34^＋骨髓源性细胞动员对再狭窄的影响

背景：最近，越来越多的证据表明骨髓干细胞可分化为血管细胞。假设血管损伤后的炎症反应可触发骨髓中内皮和平滑肌祖细胞的动员。方法和结果：检测40例接受冠状动脉支架置入患者的循环血CD34^＋单核细胞、中性粒细胞表面整合素Mac-1的激活以及血浆粒细胞集落刺激因子水平。置入裸金属支架后，CD34^＋细胞增加，术后第7天达到最高峰。与支架置入前的基线水平相比的最大变化，在发生再狭窄患者中较之无再狭窄患者中更显著（332％±108％郴148％±49％，P〈0．05）。[第一段]     

体内外诱导CD34^34＋细胞生成血管内皮细胞的方法及其组织工程学运用

目的：本实验设计从骨髓中提取CD34^34 细胞作为血管内皮细胞干细胞,经诱导生成血管内皮应用于组织工程学器官重建术。方法：利用免疫磁珠法从骨髓中提纯的CD34^34 细胞在体外经血管内皮细胞生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF)诱导;在动物实验中,CD34^34 细胞经Dil标记后于Matrigel混合涂于裸鼠背部皮肤缺损处,表面 胸膜组织。结果：细胞经诱导可转化生成血管内皮细胞,Ⅷ：Ag,CD31^ 染色阳性,并可在重组基底膜（Matrigel)中形成三维毛细血管网状结构,体内实验结果可见CD34^34 细胞参与并加速胸膜下毛细血管网形成,短时期内重建血供系统确保胸膜组织存活。对照组（单纯覆Matrigel与胸膜）胸膜缺血坏死。结论：可利用CD34^34 细胞替代毛细管内皮细胞重建正常组织毛细血管网,与器官实质细胞共同组织成复合组织,运用于组织工程化器官重建术,为解决组织工程器官替代品血供问题提供新思路。     

骨髓增生异常综合征中骨髓CD34~+、CD34~-细胞凋亡和增殖的实验研究

目的:分析骨髓增生异常综合征(MDS)患者骨髓CD34+细胞和CD34-细胞凋亡和增殖情况,从该角度探讨MDS的发病机制。方法:流式细胞术分析20例高危MDS、20例低危MDS患者及10例正常对照者骨髓CD34+细胞的比例,CD34+细胞和CD34-细胞凋亡、增殖的百分率,计算各组中的凋亡/增殖(A/P)比。结果:(1)MDS患者CD34+细胞的比例明显高于对照组,其中高危组CD34+细胞的比例明显高于低危组(P<0.05),而低危组与对照组比较无显著差异;(2)CD34+,CD34-细胞的凋亡率在MDS低危组中均为最高,明显高于MDS高危组和对照组,在低危组中,CD34-细胞的凋亡率(80.36±1.82)%明显高于CD34+细胞(54.75±2.18)%(P<0.05),而在高危组中,CD34+,CD34-细胞的凋亡率无显著差异;(3)CD34+细胞的增殖率在MDS高危组中最高,明显高于低危组和对照组,而CD34-细胞的增殖率在MDS高危和低危组间无显著差异,在高危组中,CD34+细胞的增殖率(50.67±3.37)%明显高于CD34-细胞的(30.99±1.96)%(P<0.05);(4)无论CD34+,CD34-细胞的A/P值在MDS低危组中均明显高于高危组和正常对照组,而在MDS各亚组中,CD34-细胞的A/P值明显高于CD34+的A/P值(P<0.05)。结论:CD34+细胞百分率随MDS危险度增加而逐渐增加,在低危组中以CD34-细胞的凋亡占主导,随着病情进展,在高危组中则以CD34+细胞的增殖占主导,提示异常的凋亡和增殖在MDS的发生和发展中起重要作用。     

富集CD34^＋细胞作干细胞移植的临床初步探索

目的 观察富集ＣＤ３４＾＋的造血干／祖细胞做肿瘤患者同种异基因造血干细胞移植（Ａｌｌｏ－ＨＳＣＴ０的自体移植的临床疗效。观察输注纯化ＣＤ３４＾＋细胞患者的预后情况。方法 采用磁分选临床型细胞富集仪将表面包被有ＣＤ３４单抗的磁性微球体系与细胞共同培养,特异性结合ＣＤ３４＾＋细胞。在磁场作用下分别收集ＣＤ３４＾＋和ＣＤ３４＾－组分。完成２０例患者ＣＤ３４＾＋细胞体外纯化富集。其中ＨＬＡ半相合移植５例,     

姜素对CD34~+肝癌SMMC-7721细胞增殖及CD34表达的影响

目的:探讨姜素对CD34+肝癌SMMC-7721细胞增殖及其CD34蛋白表达的影响。方法:培养人CD34+肝癌SMMC-7721细胞并用姜素处理,MTT法测定细胞增殖率,流式细胞术测定SMMC-7721细胞中CD34+细胞含量,Western blot法测定CD34蛋白的水平。结果:姜素对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制率随姜素浓度和作用时间的增加而升高(P<0.05)。姜素处理组CD34+细胞的含量与正常组中CD34+细胞的含量差异具有统计学意义(P<0.05),且抑制率随浓度升高而升高。Western Blot检测CD34的表达情况,组内及组间条带灰度值比较:CD34的表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:姜素能抑制人CD34+肝癌细胞的增殖,但对CD34蛋白的表达无影响。     

PERIPHERAL BLOOD CD34^＋ CELL MOBILIZATION IN 42 PATIENTS WITH SEVERE AUTOIMMUNE DISEASE

Objective To evaluate the feasibility and safety of peripheral CD34 cell mobilization in patients with severe autoimmune disease. Methods Forty-two patients underwent a total of 46 mobilizations by the regimen of cyclophosphamide 2-3 g/m2 recombinant human granulocyte colony stimulating factor (rhG-CSF) 5 μg·kg-1·d-1. The positive selection of CD34 cell was performed through the CliniMACS. Results In 8.1±2.3 days after administration of cyclophosphamide, the peripheral white blood cell and mononuclear cell (MNC) decreased to the lowest level. In 3.7±1.6 days after injection of rhG-CSF, the peripheral absolute MNC and CD34 cell counts were 0.95×109/L and 0.035×109/L, respectively. After 2.4±0.6 times of leukapheresis, there gained 4.46×108/kg of MNC and 5.26×106/kg of CD34 , respectively. After mobilization, the underlying diseases were ameliorated more or less. In systemic lupus erythematosus (SLE) patients, SLE Disease Activity Index (SLEDAI) decreased from a median of 17 to 3 (P<0.01). In rheumatic arthritis patients, an American College of Rheumatology criteria for 20%(ACR20) response was achieved in all five patients. Totally, 17.4% of patients whose absolute neutrophil count <0.5×109/L suffered infection, and 31.0% of patients had bone pain after the injection of rhG-CSF. Two patients suffered severe complications, one with acute renal failure and recovered by hemodialysis, the other died of thrombotic thrombocytopenic purpura. Failed mobilization occurred in three patients. Conclusions Sufficient CD34 cells can be mobilized by low dose of cyclophosphamide and rhG-CSF. CD34 cell mobilization for treatment of severe autoimmune disease not only is appropriate in both effectiveness and safety but ameliorates disease also.     

搭桥术中从胸骨和肋骨骨髓中富集CD34^＋干细胞的方法

目的为便于进行心肌干细胞移植的临床研究,探索一种搭桥术中从胸骨和肋骨骨髓中快速富集CD34+干细胞的方法.方法搭桥手术患者11例,男6例,女5例,平均年龄(65.4±8.9)岁,平均体重(60.8±14.6)kg.术中从胸骨和肋股骨髓中多点抽取骨髓,MiniMACS分选系统分离纯化骨髓CD34+干细胞,流式细胞术检测富集的CD34+细胞纯度,镜检细胞活力,计数富集干细胞的时间.结果本方法抽取的骨髓液20～30ml,可富集(1.7±0.8)×107个CD34+干细胞,纯度(95.8±1.6)%,活力(95.3±1.6)%;从抽取骨髓到富集到可用的CD34+细胞用时3.5～4 h.结论搭桥术中从胸骨和肋骨骨髓中可快速富集理想的CD 34+干细胞,获取细胞隐蔽,患者无痛苦,分选时间短,可在搭桥手术结束前提供心肌注射使用,为心肌干细胞移植的临床试验提供依据.     

胎儿骨髓来源的Flkl^＋CD34^—细胞的血液血管干细胞特性

目的:研究骨髓基质中是否具有血液血管干细胞的特征。方法：分离并培养人胎儿骨骨基质细胞（hfMSCs),FACS检测细胞的免疫表现。将此细胞接种在基底膜胶中，由血管内皮细胞生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)诱导，免疫组化和透射电镜检测轿管和造血的分化形成。结果：此细胞群体的典型特征是CD34阴性的成纤维样细胞99％表达Flkl(即血管内皮细胞生长因子受体2），并能形成血管样结构，而在管样结构形成的过程中诱导的CD34阳性的圆形细胞。结论：Flk^ CD34^-的hfMSC能向血管内皮细胞和造血细胞分化，提示其具有血液血管干细胞的特征表型。     

脐血CD34^＋造血干细胞体外扩增的研究

目的：探讨在体外液体培养中,多种细胞因子联合应用对脐血 Ｃ Ｄ３４＋ 造血细胞的扩增作用。方法：用 Ｉｓｏｌｅｘ ５０ 免疫磁珠法分离纯化脐血 Ｃ Ｄ３４＋ 细胞,在液体培养中,经不同细胞因子组合的诱导,检测有核细胞和集落形成细胞（ Ｃ Ｆ Ｃ）的增殖倍数。结果：干细胞生长因子、白细胞介素 Ｉ Ｌ３、 Ｉ Ｌ６、粒细胞集落刺激因子和红细胞生成素５ 种细胞因子联合对脐血 Ｃ Ｄ３４＋ 细胞扩增效果最好,其增殖高峰在第３～４ 周,单个核细胞数和 Ｃ Ｆ Ｕ Ｇ Ｅ Ｍ Ｍ 增殖倍数最高分别达３２６８±１０２４ 倍和８５±３１ 倍。结论：以干细胞生长因子、 Ｉ Ｌ３、 Ｉ Ｌ６ 为主的不同细胞因子组合,能维持脐血 Ｃ Ｄ３４＋ 细胞在体外长期造血达６ 周,使 Ｃ Ｆ Ｃｓ 大量扩增,这在造血调控研究和造血细胞支持治疗中具有重要意义     

血小板生成素从CD34^＋细胞体外扩增巨核祖细胞

目的 探讨血小板生成素(Tpo)对CD34^ 细胞增殖分化巨核细胞，体外扩增巨核祖细胞集落形成的影响。方法 采用Dynal M—45CD34免疫磁珠分离纯化再障(AA)骨髓CD34^ 细胞，应用Tpo、IL—3、IL—6等不同组合的扩增效应。结果 Tpo具有明显的体外扩增作用，含Tpo组其扩增CFU—MK的能力明显强于不含Tpo组。IL—3、IL—6单独作用时，对巨核祖细胞有不同程度的生长刺激。但该作用均低于Tpo组，其中Tpo 20ng/ml为CFU—MK培养的最佳浓度。结论 Tpo具有促使干细胞进入增殖周期的作用，对造血细胞同样具有协同扩增作用。     

应用免疫磁珠法富集慢性髓性白血病骨髓CD34^＋细胞

利用免疫磁珠法 (MACS)富集慢性髓性白血病骨髓单个核细胞 (MNC)中的CD34 细胞 ,用流式细胞术检测富集前后CD34 细胞纯度。结果表明 ,富集前CD34 细胞纯度为 2 .3 %± 0 .4% ( x±SD ,下同 ) ,富集后纯度为 90 .68%± 3 .0 2 % ,仍保持细胞活力。该法简便、快速、富集纯度高 ,为分离纯化CML骨髓中的CD34 细胞提供了有效方法。