阳离子脂质体及其在基因转移和基因治疗中的应用

基因治疗 (Ｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙ)是指将遗传物质 (即ＤＮＡ)转移入人体细胞 ,并整合至染色体中 ,取代突变基因 ,补充缺失基因或关闭异常基因 ,从而达到治疗机体疾病或有益于治疗的目的。应用基因治疗研究最多的是肿瘤。据统计 ,1994年 7月美国重组ＤＮＡ咨询委员会 (ＲＡＣ)批准的人类基因治疗方案共 72个 ,其中 36个与癌症有关 ,与囊性纤维化和艾滋病有关的各 7个[1] 。由于基因转移 (Ｇｅｎｅｔｒａｎｓ ｆｅｒｉｎｇ)技术的发展 ,基因治疗取得了突破性的进展。1　基因转移的方法近年发展起来的体外或体内基因转移技术有十余种 ,可分为…     

阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率的比较研究

目的 提高阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率。方法 采用表达Ｅ．ｃｏｌｉβ－半乳糖苷酶的ｐＣＭＶβ报告基因质粒及组化染色评价阳离子脂质体的转染效率。优化脂质体介导肺癌细胞基因转染效率的条件包括：脂质体：ＤＮＡ电荷比率，ＤＮＡ转染剂量，阳离子脂质体的类型。结果 当阳离子脂质体：ＤＮＡ电荷比率（＋／－）为３：１时，ｐＣＭＶβ的剂量为４ｕｇ／孔（２４孔板）时，阳离子脂质体ＤＯＳＰＥＲ介导肺癌细胞株Ｓ     

阳离子脂质体介导IL-2基因治疗SCCⅦ移植瘤的初步研究

目的：探讨多价阳离子脂质体介导的白细胞介素2（IL－2）基因治疗头颈鳞癌的最佳比例和免疫机理。方法：利用SCCⅦ细胞株在C3H／HeJ小鼠口底建立头颈鳞癌荷瘤动物模型。用不同比例的脂质体与DNA混合物及裸DNA进行体内外转染，用ELISA方法检测其转染后IL－2基因的蛋白表达水平，用乳酸脱氢酶（LDH）法检测荷瘤小鼠脾脏的自然杀伤细胞（NK）和细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性。结果：最佳IL－2分泌水平在体外细胞株与体内瘤内转染时的脂质混合物比较不一致。与裸DNA和空载体相比，合适比例的脂质混合物转染可增强脾脏NK和CTL的杀伤活性。结论：脂质复合物在瘤内直接基因转染的良好效能取决于其合适的构成比例，体外细胞转染的最佳脂质混和物比例不能作为体内转染的参考；与裸DNA转染相比，多价阳离子脂质体适于作为头颈肿瘤进行直接瘤内基因治疗的非病毒载体。     

自制阳离子脂质体介导的体内外基因转移研究

目的：研究阳离子脂质体介导体内外基因转移的效率。方法：采用逆相蒸发法制备出包裹TNFα DNA的脂质体,将其与体外培养的靶细胞共育,或将其直接注射至小鼠腹腔内,检测TNFα的分泌水平。结果：TNFα基因转染NIH3T3细胞和腹腔细胞,10d后均可检测到TNFα的分泌。结论：研制的脂质体不但能将目的基因转移至体外培养的靶细胞中,还可通过腹腔内注射直接将TNFα基因转移至腹腔细胞,稳定表达TNFα。     

阳离子乳剂介导的基因载体给药

目的利用阳离子乳剂包裹用于治疗的基因片段,通过转染机体细胞达到基因治疗的目的。方法取DOTAP溶解于氯仿,真空干燥去除有机乳剂后,用超声细胞破碎仪在冰水中震荡后加入角鲨烯继续超声即得到阳离子乳剂,细胞转染实验之前,把乳剂与质粒DNA混合均匀,室温静置即得到带正电阳离子乳剂-DNA复合物。结果阳离子乳剂包裹的基因片段能成功转染机体细胞。结论包裹基因载体的阳离子乳剂表面携带正电荷与机体细胞膜表面的负电荷吸引并结合,有效地增加了细胞转染的成功率,是一种方便、经济、实用的基因给药新方法。     

基因治疗基因转移方法

基因转移是指用适当手段将外源基因导入体外或体内受体细胞中的分子生物学技术。常用方法可概括为物理、化学和生物三大类，前两类是非病毒的方法，生物方法主要指病毒介导的基因转移，包括RNA病毒、DNA病毒两类，物理化学法携带的遗传物质在细胞内易受DNA酶降解，而且不容易稳定地存在细胞基因组中，但是这些方法不存在野生型病毒污染．比较安全．病毒方法的特点是基因转移效率较高，但是安全性问题需要重视。理想的基因转移方法应符合以下要求，(1)高效的转移率；(2)外源基因定向导入受体细胞，且能转导非分裂相的细胞；(3)能稳定地、定点整合到宿主染色体上．最好是同源重组；(4)较高的安全性．对人体不构成较严正重的危害；(5)容易操作．易推广应用。     

阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在HepG2及GRC细胞株中的表达

目的：研究阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在不同肿瘤细胞株中的表达。方法：质粒pDCβ-在大肠杆菌DH5a中扩增后用碱裂解法提取，并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析，以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2、人肾癌细胞株GRC，然后用X-gal细胞化学染色法检测β-半乳糖苷酶活性。结果：β-半乳糖苷酶活性在HepG2、GRC中均有表达。结论：阳离子脂质体Lipofectin是有效的细胞基因转染剂。     

阳离子脂质体介导细胞因子基因对小鼠肝癌抑制的作用

目的观察阳离子脂质体介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因对小鼠肝癌的抑制作用。方法构建含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒载体,用阳离子脂质体ＬｉｐｏｆeｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导的含细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２的质粒ＤＮＡ分别体外转染小鼠肝癌细胞株ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ,并在荷瘤小鼠体内分别直接注射上述阳离子脂质体－ＤＮＡ复合物,观察瘤体大小及小鼠生存期。结果两种阳离子脂质体介导的细胞因子转染后都具有生物学活性,转染效率为１０％左右,瘤内注射后均能延长荷瘤小鼠的生存期。ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子的治疗效果较佳。结论ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ或ＤＯＳＰＥＲ介导细胞因子ＴＮＦ－ａ及ＩＬ－２基因均具有抑制小鼠肝癌生长、延长荷瘤小鼠生存期的作用,ＤＯＳＰＥＲ的效果较好。     

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因在肿瘤基因治疗中的应用

胸苷激酶基因在细菌和哺乳动物细胞中都存在，但只有病毒的胸苷激酶如单纯疱疹病毒胸苷激酶才能使更昔洛伟(ganciclovir，GCV)等核苷类似物磷酸化，磷酸化的核苷类似物干扰DNA的合成而中止细胞的复制，尤其在肿瘤细胞中。在近10年，人们利用HSV—tk基因通过病毒载体转染多种肿瘤细胞，然后给予更昔洛伟(GCV)或阿昔洛伟(acyclovir，ACV)，在体外、体内试验对肿瘤细胞的杀伤作用都很明显。另外HSV—tk／GCV系统在抗肿瘤作用中有“旁观”效应，即转染有HSV-tk基因的靶细胞与未转染的HSV-tk基因的靶细胞同样可被GCV杀伤。由于HSV—tk／GCV系统的抗肿瘤作用效果明显，安全性好，越来越多的肿瘤患志愿接受实验，该系统已获准临床实验。本综述了近10年来HSV-tk／GCV系统在抗肿瘤治疗探索中的应用，大量资料显示HSV—tk基因用于抗肿瘤治疗将是本世纪的重要方法。     

阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在_及GRC细胞株中的表达

目的 :研究阳离子脂质体Lipofectin介导的 β 半乳糖苷酶基因在不同肿瘤细胞株中的表达。 方法 :质粒pDCβ在大肠杆菌DH5α中扩增后用碱裂解法提取 ,并经Sepharose 2B凝胶过滤柱层析 ,以Lipofectin分别转染人肝癌细胞株HepG2 、人肾癌细胞株GRC ,然后用X gal细胞化学染色法检测 β 半乳糖苷酶活性。 结果 :β 半乳糖苷酶活性在HepG2 、GRC中均有表达。结论 :阳离子脂质体Lipofectin是有效的细胞基因转染剂     

阳离子脂质体介导血管内皮生长因子的基因表达

以ＲＴ－ＰＣＲ自人胎肝中克隆和筛选血管内皮生长因子全长ｃＤＮＡ，测序鉴定正确后，插入真核表达载体ｐＡｄＣＭＶｌｉｎｋ１中的ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎＩ位点。用ｌｉｐｏｆｅｃｔ ＡＭＩＮＥ体外介导转染ＣＨＯ细胞，收集转染后２４ｈ至第５ｄ的培养上清，用ＲＴ－ＰＣＲ检测转染细胞中外源ＶＥＧＦ１６５基因的转当，Ｍｉｌｅｓ试验检测细胞培养上清中ＶＥＧＦ的生物活性。     

阳离子脂质体基因载体的研究进展

肿瘤基因治疗的最大挑战之一是研制安全有效的基因转染载体。基因治疗载体一般分为病毒性载体和非病毒性载体。由于病毒型载体存在安全性问题,目前非病毒性载体的研究越来越受到人们的重视。脂质体作为常用的非病毒性载体容易制备,安全性高,但亦存在质控要求高,体内基因导入效率较低,且无靶向性,使得其应用受到限制。pH敏脂质体、阳离子脂质体等大大提高了脂质体的转运效率,也为非病毒载体在临床上的应用开辟了广阔的前景,本文就阳离子脂质体作为基因载体的研究予以综述。     

阳离子脂质体的研究进展

基因治疗面临的首要技术问题是基因药物的载体,目前用于基因治疗的载体主要分为两大类:病毒载体和非病毒载体.病毒载体虽然在基因转移方面具有一定的优点,但在体内具有较大的潜在危险,限制了它在临床基因治疗上的应用.非病毒载体中最具典型的是阳离子脂质体(cationic liposomes)载体,它具有可自然降解、无免疫原性、可重复转染等优点,近年来备受研究者的重视,至今已有数10种阳离子脂质体被研制合成出来.现就其进展综述如下.     

不同阳离子脂质体介导基因转染效率的比较研究

目的评估不同脂质体介导基因转染条件及效率。方法以大肠杆菌β-gal基因为报告基因，比较三种阳离子脂质体（lipen、lipotecfamine和Dosper）在不同的脂质体：DNA比例、不同细胞汇合度、不同转染时间及血清存在条件下转染情况。通过x-gal染色法观察不同脂质体的转染效率。结果三种阳离子脂质作的最优条件不同。Dosper转染效率最高，蓝染细胞达18％。结论通过条件优化可使脂质体转染效率提高。有望成为一种有效的非病毒基因转移方法应用于基因治疗。     

基因转移的骨骼肌细胞及其在基因治疗中的应用

基因转移的骨骼肌细胞及其在基因治疗中的应用田竟生郑少鹏近年来发现，若将外源基因包括报告基因及目的基因克隆到哺乳动物表达性质粒载体或病毒载体上，再将质粒ＤＮＡ以裸露方式或用脂质体包裹，直接注射或先体外后体内（ｅｘｖｉｖｏ）法，即经骨骼肌的前体细胞——成...     

经膀胱灌注阳离子脂质体介导的HVS-TK基因对大鼠膀胱癌的杀伤作用

目的观察阳离子脂质体介导的HSV—TK基因经尿道膀胱灌注对大鼠膀胱肿瘤体内杀伤作用。方法N-甲基亚硝基脲(MNU)膀胱灌注诱导雌性Wistar大鼠膀胱肿瘤。经尿道HSV—TK基因膀胱灌注后，RT—PCR检测肿瘤组织中TK基因表达；TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡；荷瘤膀胱总重量测定。结果HSV—TK基因经尿道膀胱灌注后．RT—PCR检测膀胱肿瘤组织有TK基因mRNA表达；TUNEL法凋亡检测，荷瘤膀胱总重量测定，提示治疗组与对照组差异有显著性。结论经尿道膀胱灌注阳离子脂质体-TK复合物可转导TK基因；联合GCV治疗，肿瘤生长被抑制；诱导肿瘤细胞凋亡可能是HSV—TK／GCV系统作用机理之一。     

脂质体介导的融合基因pCEAcd／tk转染肺癌细胞侏效率的 …

目的：对脂质体介导的体外肺癌细胞ＤＮＡ转效率的差异性进行研究。方法：撮质料ｐＣＥＡｃｄ／ｔｋ,脂质体包裹后转染６种肺癌细胞株,Ｇ４１８筛选,计数细胞阳性春隆数。结果：６种肺癌细胞株中,导入了ｐＣＥＡｃｅｔ／ｔｋ并获得稳定表达的细胞阳性克隆数差异较大;脂质体ＥＳＣＯＲＴ－ＤＮＡ混合物与细胞孵育时间不同对转染效率也有一定的影响。结论：脂质体介导的方法把融合自杀基因纽入到肺癌细胞的效率存在细胞差异性。     

阳离子脂质体介导HSV-TK基因对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用

目的 观察阳离子脂质体介导的HSV－TK／ACV系统对人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法 将新近克隆的含HSV－TK基因的真核表达载体pCR3-5K,用阳离子脂质体Lipofectamine转染至人脑胶质瘤细胞株TJ905中，筛选出阳性克隆，给予不同浓度的ACV，观察不同时间对细胞的杀伤情况，并用MTT方法检测不同细胞对ACV的反应情况。结果 转染TK基因的胶质瘤细胞对ACV的杀伤敏感性明显提高（P＜0．01），ACV对转染TK基因的胶质瘤细胞有特异性抑制和杀伤作用。结论 阳离子脂质体Lipofectamine是一种简便、安全、有效的基因转移方法。可用阳离子脂质体介导pCR3-TK转移，进行胶质瘤HSV－TK／GCV基因治疗的研究，为胶质瘤的治疗提供一种新方法。