重组阴道毛滴虫黏附蛋白33单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组阴道毛滴虫(T.υ)黏附蛋白33(AP33)单克隆抗体(McAb)并进行初步鉴定。方法将pET32(a)-AP33重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA法纯化,以纯化的融合蛋白33为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,免疫印迹分析其特异性。结果共筛选出能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株(4A2,4F11,4F8,4E7,4H11)杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1;腹水的上清效价为1∶40 000-1∶80 000。免疫印迹分析显示,5株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合;与阴道毛滴虫抗原分子量为33kDa抗原分子结合。结论制备的抗重组AP33杂交瘤细胞株能分泌识别重组AP33的高特异性单抗,为进一步研究其在阴道毛滴虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。     

快速诊断滴虫性阴道炎免疫层析试纸条的初步研制

目的 用胶体金标记抗阴道毛滴虫重组AP33单克隆抗体制备金标AP33 mAb,研制开发出一种能快速、简便、有效检测阴道毛滴虫感染的免疫层析（GICA）试纸条。方法 采用柠檬酸钠还原法制备胶体金颗粒,标记抗阴道毛滴虫重组AP33单克隆抗体,选择最佳反应模式组装试纸条。用该试纸条检测滴虫性阴道炎患者及非滴虫性阴道炎患者白带中的靶抗原,鉴定方法的敏感性和特异性。结果 用制备的免疫层析试纸条检测重组AP33抗原的最低量为20 ng/ml,其中以单克隆抗体4A2为包被抗体、单克隆抗体4F8为金标抗体的试纸条检测效果最佳。以湿片法为标准,用该试纸条检测60例滴虫性阴道炎患者白带,敏感性为90.0%（54/60）;检测60例非滴虫性阴道炎患者白带,特异性为95.0%（57/60）。两法的总符合率为92.5%。结论 GICA检测阴道毛滴虫特异性强、灵敏度高、简便快速,无需特殊仪器设备,有广泛应用价值。     

恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体制备及功能分析

目的 制备恶性疟原虫（FCC1/HN株）融合抗原PfCP-2.9的单克隆抗体，分析其生物学特性及功能。 方法 用PfCP-2.9免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞在聚乙二醇（PEG1500）作用下进行融合，制备单克隆抗体，并分析其特性。 结果 获得1株能分泌抗PfCP-2.9的小鼠杂交瘤细胞株单克隆抗体F12D，经免疫球蛋白类型和亚类鉴定为IgG1。ELISA和蛋白质印迹法（Western blotting）显示单克隆抗体F12D能与PfCP-2.9发生特异性反应，F12D所识别的PfCP-2.9抗原表位不能耐受还原剂巯基乙醇，表明F12D识别的是构象表位。间接免疫荧光试验（IFA）显示F12D可识别培养的FCC1/HN。体外抑制试验结果显示，F12D终浓度为0.3 mg/ml时，对FCC1/HN的抑制率为56%。 结论 单克隆抗体F12D能与PfCP-2.9发生特异性反应，其所识别表位为构象表位，F12D可识别体外培养的FCC1/HN，并对其生长具有抑制作用。     

重组恶性疟原虫醛缩酶鉴定及其单克隆抗体的制备

目的 鉴定重组表达的恶性疟原虫醛缩酶（ALD），制备针对此酶的单克隆抗体。 方法 用PCR法扩增恶性疟原虫海南株ALD基因，经大肠埃希菌表达并纯化的ALD免疫BALB/c小鼠，腹腔注射免疫3次,每次间隔2周，加强免疫后3d取免疫小鼠脾细胞制备单克隆抗体。同时用获得的免疫血清进行间接荧光抗体试验（IFAT）和蛋白质印迹（Westernt blotting）分析。 结果 ELISA检测表明，小鼠能产生较高的针对ALD免疫应答，3次免疫后血清中特异性抗体滴度达1∶10⁵，IFAT显示免疫血清能特异性识别疟原虫体内的抗原；Western blotting分析显示免疫血清识别的疟原虫蛋白相对分子质量（Mr）约41 000；所制备的免疫血清与人红细胞内醛缩酶无交叉反应。经ELISA检测 3次，筛选获得7株分泌针对ALD的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中3株分泌的单克隆抗体能识别培养的恶性疟原虫；抗体亚型鉴定结果显示均为IgG1型。 结论 本实验构建并表达了重组疟原虫糖酵解醛缩酶，并获得特异性的单克隆抗体。     

抗弓形虫表膜抗原P30单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗弓形虫主要表膜抗原P30单克隆抗体并进行鉴定,进而为弓形虫病诊断、抗原的提纯及亚单位疫苗的制备等提供可靠依据。用弓形虫速殖子膜蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选出能够稳定分泌高滴度抗P30单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并测定单克隆抗体免疫球蛋白亚类和抗体效价,用IFAT进行单抗识别的抗原定位,并通过SDS-PAGE和Western-Blot分析鉴定。结果获得了两株抗P30抗原的杂交瘤细胞株E3和G2,其分泌的抗体与肺孢子虫、隐孢子虫等抗原均不发生交叉反应。2株单抗均属IgG1亚类,且识别的抗原定位于速殖子表膜。结果表明,制备的抗P30抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和特异性的单克隆抗体。     

分泌抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体杂交瘤株的建立

目的应用杂交瘤技术,制备分泌抗鼠疫F1抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用鼠疫菌F1抗原免疫雌性BALB/c小鼠,检测小鼠血清中的F1抗体,选抗体滴度最高的小鼠用于细胞融合,融合前3天F1抗原经腹腔注射加强免疫1次,然后取其脾脏细胞与处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞混合,50%的PEG作为细胞融合剂,HAT培养液选择培养融合后的细胞,间接ELISA法检测细胞培养上清中的F1抗体,阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行克隆及再克隆。结果获得共计100余株分泌F1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,3株进行了4次克隆化,经8个月保存后抗体分泌稳定。结论应用杂交瘤技术,在云南首次成功制备了3株能稳定分泌抗鼠疫杆菌F1抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了杂交瘤技术的实验程序。     

抗重组日本血吸虫P38抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的?摇在大肠埃希菌中可溶性表达日本血吸虫P38（SjP38）抗原分子，并以其纯化产物为抗原，制备抗SjP38单克隆抗体(McAb)。 方法 将pET32(a)-P38重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)，在1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达，超声破菌后获得可溶性表达产物，通过镍柱一步法纯化，以纯化的重组SjP38为抗原，免疫BALB/ｃ小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，用ELISA和有限稀释法筛选出高分泌滴度McAb杂交瘤细胞株，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，蛋白质印迹法（Western blotting）分析其特异性。 结果 筛选出能稳定分泌抗重组SjP38单克隆抗体的8株杂交瘤细胞株，均为IgG1； Western blotting 分析显示8株单抗能与日本血吸虫虫卵抗原中的天然P38发生特异性结合。 结论 制备的抗P38杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的McAb。     

阴道毛滴虫重组蛋白AP33的制备、鉴定和初步应用

目的 克隆阴道毛滴虫(T.v)重组蛋白AP33的基因(ap33基因),构建其原核表达系统,鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性和免疫原性。方法 从阴道毛滴虫临床分离虫株Tv317抽提总RNA,经mRNA纯化试剂盒纯化后逆转录合成cDNA。以cDNA为模板扩增ap33基因,T-A克隆后测序,构建pET32a(+)的ap33基因表达载体,转化入大肠埃希菌(E.coli)BL21DE3株,用不同浓度的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用抗阴道毛滴虫全虫抗体蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定重组融合蛋白AP33的抗原性,用兔抗重组融合蛋白AP33血清的免疫双扩散试验鉴定重组融合蛋白AP33的免疫原性,用阴道毛滴虫临床分离虫株全虫抗原包被的ELISA鉴定重组蛋白AP33的免疫原性。ELISA检测滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体。结果 克隆的ap33基因与已报道的相应核苷酸序列同源性及氨基酸序列同源性均较高。重组融合蛋白AP33表达量较大,能与抗阴道毛滴虫全虫抗体发生结合反应,免疫家兔能获得高效价抗AP33蛋白抗体。T.v临床分离虫株重组蛋白AP33表达率高,能刺激机体产生抗体。ELISA检测50例滴虫性阴道炎患者血清抗AP33蛋白抗体,阳性率为78.0%(39/50)。结论 构建了阴道毛滴虫ap33基因原核表达系统,重组融合蛋白AP33具有良好的抗原性和免疫原性。     

阴道毛滴虫接触依赖性细胞毒性的分子作用及化学基础

阴道毛滴虫（以下简称滴虫）寄生于人体泌尿生殖道，在接触依赖性致病过程中，虫体对靶细胞的黏附起着关键性的作用，滴虫合成的酶分子可直接损伤上皮细胞，滴虫寄生部位的局部免疫反应可起到免疫保护作用，但炎症分子和免疫细胞又可加重病变损害，从整体水平来看，阴道毛滴虫的细胞毒性作用是多分子和多化学因素参与的共同结果。     

抗旋毛虫肌幼虫ES抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备分泌抗旋毛虫肌幼虫排泄分泌(ES)抗原单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,并对其及分泌的McAb进行鉴定。方法用旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌特异性、高滴度McAb的杂交瘤细胞株,制备腹水,进行纯化。ELISA间接法、夹心法和竞争法分别测定McAb滴度、相对亲和力和相加效应,琼脂双扩散试验鉴定免疫球蛋白类型,检测McAb与其他寄生虫抗原的交叉反应。电镜观察杂交瘤细胞超微结构,计数染色体数目及观察杂交瘤细胞分泌McAb的稳定性。结果筛选出2株(B2C12和E11F11)分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原McAb杂交瘤细胞株。电镜显示,杂交瘤细胞具有肿瘤细胞和浆细胞的特征,胞浆内可见大量分泌颗粒;杂交瘤细胞染色体数目平均为98.6条,均能稳定分泌McAb(属IgM)。B2C12株培养上清液和腹水McAb滴度分别为1∶1280和1∶2.048×104,E11F11株为1∶640和1∶1.024×104,其中前者的相对亲和力较后者稍高。2株McAb识别ES抗原不同的抗原决定簇;且不与其他寄生虫抗原发生交叉反应。结论获得2株抗旋毛虫肌幼虫ES抗原杂交瘤细胞株,均能稳定分泌高滴度、特异性的IgM类McAb,并识别不同的抗原决定簇,为研制旋毛虫病诊断试剂盒和制备基因工程抗体奠定了基础。     

Preparation of monoclonal antibodies against the adhesion protein 33 of Trichomonas vaginalis]

OBJECTIVE: To prepare and characterize the monoclonal antibodies (McAbs) against recombinant adhesion protein 33 (AP33) of Trichomonas vaginalis. METHODS: The purified recombinant fusion protein AP33 was used as antigen to immunize BALB/c mice. Sp2/0 myeloma cells were fused with the splenocytes from immunized BALB/c mice. After ELISA screening and 4 times of limited dilution, 5 positive hybridoma cell lines were obtained, and the biological properties of the McAbs were identified by Western blotting. Indirect immunofluorescent antibody test (IFAT) was performed and the inhibition effect of McAbs on the cytoadherence of T. richomonas vaginalis to HeLa cell was assayed. RESULTS: Western blotting demonstrated that 5 McAbs, designated as 4A2, 4F11, 4F8, 4E7 and 4H11, specifically combined with the recombinant AP33 of T. vaginalis. The McAbs were IgG1 isotypes. Four of them (4F11, 4F8, 4E7 and 4H11) showed parasite recognition by IFAT. Parasite cytoadherence to a monolayer of HeLa cells was inhibited in vitro with a inhibition rate of 50.08%, 65.03%, 50.70% and 49.08% by the 4 McAbs under a concentration of 200, 200, 400 and 200 microg/ml, respectively. CONCLUSIONS: The prepared McAbs against the recombinant AP33 show a protective inhibition on cytoadherence of Trichomonas vaginalis in vitro.     

阴道毛滴虫半胱氨酸蛋白酶3基因的克隆、表达与免疫原性分析

目的 研究小鼠对阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）半胱氨酸蛋白酶3（TvCP3）重组蛋白的免疫应答。 方法 用PCR方法从阴道毛滴虫基因组DNA扩增TvCP3基因编码序列,分别用编码前体酶和成熟酶的基因片段构建重组表达质粒pET28b-TvCP3和pET28b-TvCP3C,转化入大肠埃希菌（E. coli）BL21（DE3）后进行诱导表达,通过金属螯合层析法（immobilized metal affinity chromatography,IMAC）纯化表达产物重组蛋白,复性后免疫BALB/c小鼠。BALB/c小鼠分为TvCP3免疫组、TvCP3C免疫组和对照组3组,每组6只,分别用TvCP3重组蛋白、TvCP3C和PBS免疫小鼠。第1次25 μg/只,福氏完全佐剂乳化;第2次25 μg/只,福氏不完全佐剂乳化;第3次与第4次12.5 μg/只,水剂。前3次免疫间隔2周,第4次间隔1周。末次免疫后1周用ELISA测定血清抗体滴度。采集高滴度小鼠血清制备免疫血清,通过蛋白质印迹（Western blotting）分析抗体所识别的阴道毛滴虫虫体或其分泌物中的特异性抗原组分。 结果 重组表达质粒 pET28b-TvCP3和pET28b-TvCP3C均能在E. coli BL21（DE3）中高效表达,重组蛋白占菌体总蛋白的25%以上;ELISA结果显示,纯化的重组蛋白TvCP3和TvCP3C免疫小鼠4次后血清抗体效价分别达1︰204 800和1︰102 400;Western blotting分析显示,小鼠免疫血清能特异性识别表达产物中的目的蛋白,以及阴道毛滴虫虫体或分泌物中的特异性抗原组分。 结论 重组表达质粒pET28b-Tvcp3和pET28b-Tvcp3C可在E. coli BL21（DE3）中高效表达,纯化的表达产物具有良好的免疫原性。     

阴道毛滴虫低温保存及其影响因素

观察不同浓度二甲亚砜(DMSO)和甘油、不同密度滴虫及不同冻存时间对阴道毛滴虫在-78℃低温保存的影响。阴道毛滴虫的最适冻存密度为(1～2)×106/ml。10%甘油和10%二甲亚砜的冻存效果最好,复苏存活率分别为38.0%和31.7%,两者差异无统计学意义(P0.05)。短期冻存(1～16周)的效果良好,均可在37℃重悬培养至对数生长期。     

中性粒细胞杀灭阴道毛滴虫作用的研究

目的 研究中性粒细胞对阴道毛滴虫的杀灭作用。 方法 将滴虫性阴道炎患者的阴道分泌物接种于肝浸汤培养基，获阴道毛滴虫。取患者静脉血分离血清，取其1 ml 于56 ℃ 30 min获补体失活血清。另取1 ml患者血清于0 ℃以阴道毛滴虫吸附3次，获去除抗体血清。用密度梯度离心法及聚合物加速沉降法分离、纯化患者静脉血中性粒细胞。用氮蓝四唑（NBT）和沙黄O（safranin O）染色，显微镜观察中性粒细胞与阴道毛滴虫相互作用及甲臢（NBT还原产物)颗粒（formazan）沉积。取300个阴道毛滴虫和3×104个中性粒细胞，分别在有氧或厌氧、有或无超氧化物岐化酶（SOD）及过氧化氢酶（CAT）、有或无补体等不同条件下，培养10、20、30、40、50及60 min，再接种于固态琼脂培养基，在37 ℃厌氧条件下继续培养5 d。观察计数阴道毛滴虫存活率。 结果 显微镜下可见几个中性粒细胞同时围攻杀灭1个阴道毛滴虫。含有中性粒细胞时培养的虫体存活率，厌氧条件下为85%，有氧条件为3%（P﹤0.01）。SOD及CAT可明显降低其杀虫作用，培养60 min虫体存活率分别为98%及94%，而无SOD及CAT时虫体存活率为2%（P值均<0.05）。加入去除抗体血清，可将虫体全部杀灭。加入补体失活血清则无杀虫作用。 结论 中性粒细胞杀灭阴道毛滴虫作用依赖于氧及患者血清中补体的存在。     

伯氏疟原虫红内期融合抗原的构建、表达及其免疫原性研究

目的 合成伯氏疟原虫红内期融合抗原基因PbCP-2.9，在毕赤酵母真核系统中表达其产物，并进行免疫原性分析。 方法 选取与恶性疟原虫红内期融合抗原基因PfCP-2.9具有同源性的伯氏疟原虫AMA1（Ⅲ）和MSP1-19序列，融合形成PbCP-2.9基因。基因序列经密码子优化，在毕赤酵母中分泌表达。60只BABL/c小鼠均分为6组，其中蛋白免疫组3组，分别用PbCP-2.9蛋白与福氏佐剂、ISA206和IMS1312佐剂乳化后，皮下注射免疫小鼠，抗原免疫剂量20 μg/只·次，注射体积200 μl，共免疫3次，每次间隔2周。佐剂对照组3组，以 PBS代替免疫抗原同法免疫。免疫前及每次免疫后1周鼠尾取血，分离血清。用ELISA和IFAT方法检测血清中特异性抗体的滴度及其与天然抗原的反应结果。 结果 PbCP-2.9基因在毕赤酵母中分泌表达出Mr约26 400的 PbCP-2.9蛋白，其与抗伯氏疟原虫红内期原虫的血清能进行特异性反应；ELISA检测PbCP-2.9蛋白免疫组结果表明，福氏佐剂组第2次免疫后特异性抗体滴度为(52.62±11.26), 第3次免疫后为( 94.50±52.84); ISA206 组第2次免疫后为(7.59±5.61), 第3次免疫后为( 25.60±16.92) ; IMS1312组第2次免疫后为(9.41±8.86), 第3次免疫后为( 28.92±12.98)。福氏佐剂组第2次免疫后特异性抗体滴度分别为ISA206 组的6.9和IMS1312组的5.6倍（F＝81.06，P＜0.01），第3次免疫后分别为ISA206 组的3.7和IMS1312组的3.3倍（F＝13.29，P＜0.01）。IFAT检测结果显示，经PbCP-2.9免疫的鼠血清与Pb ANKA株虫体表面抗原有阳性反应。 结论 PbCP-2.9基因在毕赤酵母中高效表达，重组抗原免疫原性强，其免疫血清能识别伯氏疟原虫天然抗原。     

铁离子对体外培养的阴道毛滴虫生长的影响

目的研究铁离子对体外培养的阴道毛滴虫生长的影响。方法在TYM(trypticase-yeast extract-maltose)培养基(pH6.0)中,分别加入100、200、300和400μmol/L铁离子,并设不加铁离子组为对照组,阴道毛滴虫初始浓度为1×105/ml,于37℃定量纯培养。采用台盼蓝染色法镜下观察并计数活滴虫数和死滴虫数,绘制生长曲线和存活率曲线,并计算对数生长期内世代时间。通过连续稀释的方法测定在加入200μmol/L铁离子培养基和对照组培养基中甲硝唑对阴道毛滴虫的最小致死浓度(minimal lethal concentration,MLC)。结果在加入100、200、300和400μmol/L铁离子的培养基中,阴道毛滴虫均于40h达最高密度,分别为2.9×106、3.2×106、3.1×106和2.8×106/ml,对照组阴道毛滴虫于54h达最高密度,为2.5×106/ml。400μmol/L铁离子组阴道毛滴虫的世代时间为(6.8±0.7)h,较100～300μmol/L铁离子组的世代时间[(4.8±0.3)、(4.8±0.2)和(5.0±0.4)h]延长(均P﹤0.05),而100～400μmol/L铁离子组的世代时间均短于对照组[(10.2±3.1)h](均P﹤0.05)。在加入200μmol/L铁离子的培养基中阴道毛滴虫的甲硝唑最小致死浓度为(23.44±11.56)μg/ml,显著低于对照组[(31.25±15.44)μg/ml](均P﹤0.05)。结论阴道毛滴虫在加入100～400μmol/L铁离子的TYM培养基中生长较快,且甲硝唑对阴道毛滴虫的最小致死浓度较小。     

日本血吸虫重组抗原SjPGAM-SjEnol的保护性免疫效果评价

目的构建日本血吸虫重组表达质粒pET32a-SjPGAM-SjEnol并在大肠埃希菌(E.coli BL21)中表达,观察重组抗原在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用。方法利用生物信息学技术筛选SjPGAM和SjEnol富含人源(HLA)Ⅱ类、鼠源(H2-d)Ⅱ细胞结合表位且与宿主同源性较小的肽段,将对应编码的核苷酸序列进行拼接,构建重组质粒pET32a(+)-SjPGAM-SjEnol,并在E.coli BL21中表达。用蛋白质印迹(Western blotting)分析该重组抗原的抗原性。用小鼠实验评估重组抗原的免疫保护效果,即将55只雄性BALB/c小鼠均分成5组,其中3个试验组分别用重组抗原pET32a-SjPGAM-SjEnol(A组)、pET28a-SjPGAM(B组)、pET28a-SjEnol(C组)(各27μg)与206佐剂混合后免疫小鼠,每次间隔2周,共免疫3次。同时设佐剂对照组(D组)和空白对照组(E组)。末次免疫后2周,每鼠经腹部皮肤分别感染日本血吸虫尾蚴40±2条,感染后6周,经肝门静脉灌注法收集成虫和检测每克肝虫卵数(EPG),计算减虫率和肝脏减卵率。各组小鼠分别于免疫前、各次免疫后1周尾部取血和剖杀时收集血清,应用ELISA检测血清特异性IgG抗体水平。结果确定SjPGAM的96~147、SjEnol的233~312肽段为重组片段。PCR扩增出一条含编码这两个肽段的核苷酸序列的重组DNA序列,大小447bp。获得的重组蛋白pET32a-SjPGAM-SjEnol相对分子质量(Mr)为33000。Westernblotting结果显示,该重组蛋白可被日本血吸虫成虫抗原免疫兔血清识别,具有良好的抗原性。小鼠免疫实验结果显示,与空白组相比,A组获得39.7%的减虫率和64.9%的肝减卵率,其减虫率与B组(18.5%)、C组(14.7%)比较,差异有统计学意义(均P0.05);肝减卵率与B组(47.5%)、C组(30.5%)比较,差异也有统计学意义(P0.05,P0.01)。ELISA结果显示,第3次免疫后A组的特异性IgG抗体达到较高水平(2.372±0.268),与D组(0.490±0.138)、E组(0.220±0.088)间的差异有统计学意义(P0.01)。结论成功构建了重组表达质粒pET32a-SjPGAM-SjEnol,多表位重组蛋白pET32a-SjPGAM-SjEnol在小鼠抗血吸虫感染中比单一重组抗原pET28a-SjPGAM和pET28a-SjEnol诱导了更高的免疫保护作用。     

甲硝唑对阴道毛滴虫作用的流式细胞分析

目的 :了解甲硝唑对阴道毛滴虫的作用机制。方法 :应用流式细胞术 ( FCM)检测阴道毛滴虫的细胞周期和甲硝唑对该虫细胞周期的影响。结果 :对照组中 ,阴道毛滴虫细胞周期的时相分布为 G0 /G1期 70 .3%,S期 13.6% ,G2 M期 13.5%和自然死亡率为 2 .8%左右。各用药组虫体的细胞周期时相因药物浓度和随时间推移而改变。尤其给药 9h后 ( 2 0 μg/ml) ,虫体死亡率为4 6.6% ,与对照组相比有显著性差异 ( P<0 .0 1),G0 /G1期和 G2 M期虫体明显减少 ,S期出现积累。结论 :甲硝唑对阴道毛滴虫 G2 M期有抑制作用。     

美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及变应原活性测定

目的 克隆美洲大蠊（Periplaneta americana）精氨酸激酶(arginine kinase，AK)基因并表达、纯化具有变应原活性的重组AK。 方法 提取美洲大蠊总RNA，设计特异引物，通过RT-PCR克隆美洲大蠊AK基因目的片段，测序后将该片段克隆入原核表达载体pET-28a，转化至大肠埃希菌（E. coli） BL21（DE3），经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，获重组AK。用镍离子（Ni²⁺）亲和层析柱纯化，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组AK表达情况。用蛋白质印迹分析（Western blotting）（变性条件）和ELISA（非变性条件）检测重组AK变应原与过敏患者血清IgE结合活性，并以健康人血清为对照。 结果 测序结果表明，AK基因含有1 068 bp的开放阅读框，编码356个氨基酸（登录号为EU429466）。与GenBank公布的序列（登录号为AY563004）比较同源性达99.9%。SDS-PAGE分析表明, 该变应原基因在E. coli中主要以可溶形式高水平表达，相对分子质量约为Mr 45 000。重组变应原AK在变性与非变性条件下，与过敏患者血清IgE均具有良好的结合活性，与健康人对照组之间的差异具有统计学意义（P＜0.05）。 结论 获得了具有变应原活性的重组美洲大蠊精氨酸激酶。