抗原特异性细胞毒T细胞检测及其临床意义

抗原特异性细胞毒T细胞(CTL)在控制病毒感染和某些肿瘤中具有重要作用。用MHC-Ⅰ类分子的α链和β2-微球蛋白、抗原肽和有荧光染料标记的联接蛋白组成的四聚体试剂，可以检测相应的抗原特异性CTL。这项技术将对病毒性疾病和肿瘤的发病机制、患者体内细胞免疫功能的了解具有重要的意义，也为这些疾病的细胞免疫治疗提供新的方法。     

白癜风患者外周血黑素细胞抗原特异性T细胞、调节性T细胞及自然杀伤T细胞水平及意义

目的 探讨白癜风患者外周血黑素抗原特异性CD8+T细胞、调节性T细胞及自然杀伤T细胞的变化及意义。方法 采用流式细胞术对初诊123例白癜风患者（观察组）和30例正常人（对照组）外周血中黑素细胞抗原特异性T细胞（CD8+Melan-A+/Tyrosinase+CTL）、调节性T细胞（CD4+CD125+CD127-Tregs）及自然杀伤T细胞（CD3+TCRα24+β11+NKT）进行定量分析并进行比较。结果观察组CD8+Melan-A+/Tyrosinase+CTL水平显著高于对照组（P＜0.05）;CD4+CD125+CD127-Tregs、CD3+TCRα24+β11+NKT水平均低于对照组（均P＜0.05）。不同分期白癜风患者外周血各种T细胞表达水平比较中,CD8+Melan-A+/Tyrosinase+CTL在各期中均高于对照组（均P＜0.05）;CD4+CD125+CD127-Tregs、CD3+TCRα24+β11+NKT水平仅在进展期中均低于对照组（均P＜0.05）,稳定期则无统计学差异。3种细胞水平与患者的白斑面积明显相关（r=0.929、-0.982、-0.957,均P＜0.01）。结论CD8+Melan-A+/Tyrosinase+CTL、CD4+CD125+CD127-Tregs、CD3+TCRα24+β11+NKT水平的异常导致白癜风患者体内免疫调节功能失衡,与白癜风的发生、发展有密切关系。     

免疫球蛋白重链框架区的抗原九肽诱导特异性细胞毒T细胞增殖

目的 探索免疫球蛋白重链可变区(IgHV)是否存在T细胞识别的表位。方法 PCR扩增108例急性淋巴细胞白血病(ALL)的7个IgHV家族的重排基因,PCR产物直接测序并翻译成氨基酸。利用互联网生物信息资源分析B-ALL IgHV基因的重排类型和基因变异,利用SYFPEITHI和BIMAS软件预测IgHV基因编码蛋白质的T细胞表位。合成代表性九肽IgHV1家族的QLVQSGAEV,进行12结合分析、合成九肽诱导的T细胞扩增、扩增细胞的HLA-A*0201／QLVQSGAEV四聚体检测等实验,确定合成九肽的免疫原性。结果 66％的B-ALL检测到IgHV基因重排克隆。在40份测序得到的B-ALL IgHV序列中,选出26份进行HLA-A*0201分子结合九肽的预测,发现7个IgHV家族共有12条抗原九肽。除1条位于第3互补决定区(CDR3)外,10条(83％)位于框架区(FR),并与相应胚系VH家族的代表序列相同;为同一IgHV家族的白血病细胞所共有。合成的IgHV1抗原九肽可将12细胞表面HLA-A*0201分子的表达提高1．63倍。HLA-A*0201正常供者的外周血淋巴细胞接受该九肽负荷的自身PBMC的1轮刺激,CD8^ 四聚体^ 细胞达1．64％,继续接受该九肽负荷的12细胞的2轮刺激,CD8^ 四聚体^ 细胞增至82．57％。结论 B淋巴细胞的免疫球蛋白重链框架区有CTL识别的IgHv家族特异的抗原九肽,正常人外周血T细胞库存在这些抗原九肽特异的CTL,这些抗原九肽可诱导特异性CTL的增殖。     

肿瘤抗原冲击DC诱导淋巴细胞对小鼠胃肠癌的杀伤作用

目的：用胃肠癌冻融抗原冲击树突状细胞（DC）诱导荷瘤小鼠脾细胞，观察DC及细胞毒T细胞（CTL）的生物学功能及对胃肠癌靶细胞体外杀伤作用。方法：小鼠骨髓细胞经GM-CSF、IL-4诱导和胃肠癌细胞系 KATO3、CT26细胞冻融抗原（Ag）的冲击，诱生致敏的DC与活化脾淋巴细胞共培养，获得的CTL对相应靶细胞及对照黑色素瘤细胞进行体外杀伤。结果：制备的DC与CTL具有良好的生物学活性，胃肠癌 Ag冲击的DC诱导的CTL对相应靶细胞的杀伤率分别平均75.98%和86.75%，且效靶比显示量效关系；对无关靶细胞A375为10.57%和11.53%。结论：胃肠癌Ag冲击致敏的DC能诱导CTL产生特异性杀伤作用。     

γδ T细胞对多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞杀伤作用的实验研究

摘要: 目的探讨体外诱导培养的γδ T细胞对多发性骨髓瘤(MM)细胞的杀伤作用。 方法 采用健康志愿者外周血分离获得外周血单个核细胞(PBMNC),并在1 μmol/L唑来膦酸(Zol)和200 IU/mL重组人白细胞介素-2(IL-2)条件下扩增获得γδ T细胞。采用流式细胞术检测γδ T细胞表型,然后与RPMI 8226细胞共培养。采用CCK-8检测γδ T细胞对RPMI 8226细胞增殖的抑制作用,乳酸脱氢酶(LDH)法检测γδ T细胞对RPMI 8226细胞的杀伤作用,流式细胞术检测RPMI 8226细胞的凋亡率改变,并分别用抗人γδ TCR mAb、抗人NKG2D mAb、抗人CD3 mAb和同型对照IgG mAb封闭γδ T细胞后,作用于RPMI 8226细胞,LDH法检测不同抗体封闭后对RPMI 8226细胞杀伤作用的影响。 结果 体外条件下可成功高效扩增获得γδ T细胞,可抑制RPMI 8226细胞株的增殖并呈一定的量效关系; 不同效靶比(1:1,5:1和10:1)的γδ T细胞作用于RPMI 8226细胞的杀伤率分别为(12.23±1.75)%,(31.11±6.12)%和(43.56±3.29)%; 效靶比为1:1和10:1时,γδ T细胞诱导RPMI 8226细胞凋亡率分别为(38.21±1.98)%和(68.18±2.16)%,明显高于RPMI 8226单独培养组(13.32±1.55)%,差别有统计学意义(P<0.05); 抗人γδ TCR mAb、抗人NKG2D mAb、抗人CD3 mAb和同型对照IgG mAb封闭γδ T细胞后按10:1的效靶比与RPMI 8226混合培养,各组杀伤率分别为(21.54±1.52)%,(29.25±1.51)%,(32.68±0.78)%和(43.0±2.91)%。 结论 体外利用Zol+IL-2刺激培养可高效扩增γδ T细胞,并具有杀伤RPMI 8226细胞的作用,为MM的细胞免疫治疗提供实验依据。     

肿瘤exosome诱导的细胞毒性T细胞的特异性杀伤作用

目的:检测癌细胞来源的外排小体exosome在体外刺激细胞毒性T细胞(CTL)特异性杀伤癌细胞的能力。方法:从外周静脉血中分离和培养树突细胞(DC),分离纯化舌鳞癌Tca-8113细胞培养上清液中的exosome,并将exosome负载至DC上,诱导T淋巴细胞活化为细胞毒性T细胞(CTL),把CTL加入到靶细胞(Tca-8113和95-D)培养体系中,18h后利用MTT比色法测定CTL对靶细胞的杀伤活性。结果:从外周静脉血中分离的单核细胞,经粒细胞-单细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)的培养可分化为DC,经exosome冲击后,诱导的CTL对Tca-8113细胞具有显著的杀伤作用,在效靶比为20:1时,18h平均杀伤率为(43.60±5.66)%(P<0.01),但对95-D细胞无明显杀伤作用,杀伤率为(29.7±8.78)%(P>0.05)。结论:肿瘤细胞分泌的exosome,负载到DC上后,可以活化T细胞,使之成为抗原特异性的CTL,并具有特异性的杀伤肿瘤细胞的功能。     

树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究

目的探讨通过聚肌胞体外作用树突状细胞后改善慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能,并在体外活化自身T细胞获得高频数HBV特异性细胞毒性T细胞(CTL)的方法。方法分离慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞,在粒巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)和白细胞介素4(IL4)的诱导下培养树突状细胞。培养的第7天加入聚肌胞刺激获得成熟树突状细胞,经HBVcore1827肽负载后与自身T淋巴细胞共培养,通过酶联斑点计数法(Elispot)及MHC肽四聚体法(Tetramer)比较病人T细胞未经自身树突状细胞刺激组、经HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组、经聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组中HBV特异性的CTL的功能和频数。结果慢性乙型肝炎病人外周血单核细胞体外经GM CSF和IL4诱导可转化为树突状细胞,树突状细胞转化过程中聚肌胞的刺激可显著上调树突状细胞表面分子CD80、CD83的表达(P<0.01),促进树突状细胞的成熟。Elispot法检测分泌IFNγ的CTL的频数病人T细胞未经自身树突状细胞刺激组分泌频数为(9～28)/1×105T细胞,均值16;经HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组频数为(30～67)/1×105T细胞,均值为46;经聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组频数为(59～130)/1×105T细胞,均值为98。三组数据     

肿瘤热休克蛋白70—多肽复合物诱导特异性细胞毒T淋巴细胞产生 …

OBJECTIVE: To investigate the killing effect of cytotoxic T lymphocytes (CTLs) induced with heat shock protein-peptide complexes (HSP-PC70) derived from tumor cells. METHODS: Cell culture, flow cytometric analysis, affinity chromatography for protein extraction and purification, SDS-PAGE, Western blotting, CTL induction and expansion, and LDH release were used. RESULTS: 63.5% of the HcaF cells expressed HSP-PC70 on their membrane by FCM analysis under physiological condition, and the expression was 75.5% of the stressed cells (P < 0.01). HcaF cells had high HSP70 expression and inducibility. The cytotoxic activity of the CTLs induced with HSP70 obtained by affinity chromatography from HcaF cells was 84.2%, 47.9% and 14.8% respectively at E/T ratio of 50 : 1, 25 : 1 and 12.5 : 1. The CTLs were CD8 positive T cells. All mice which received CTL injection got long period survival (over 90 days, P < 0.01), compared with control group (10.6 days). CONCLUSION: HSP-PC70 derived from tumor cells has strong immunogeneicity, and can activate CTLs with high peculiarity and killing activity. HSP-PC70 induced CTL adoptive immunotherapy can be a promising treatment for human to fight cancers.     

膀胱癌可溶性抗原诱导细胞毒T细胞的实验研究

目的 观察膀胱癌可溶性抗原诱导细胞毒Ｔ细胞生长,为构建膀胱癌疫苗及过继性免疫治疗提供实验基础。方法 提膀胱癌可溶性抗原（ＴＳＡ）,用ＴＳＡ、抗ＣＤ－３单抗、ＩＬ－２联合诱导外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）,动态观察细胞增殖,进行细胞表型分析和细胞因子测定;并与ＩＬ－２诱导的ＬＡＫ细胞,抗ＣＤ－３单抗、ＩＬ－２诱导的ＣＤ３－ＡＫ细胞进行比较。结果 实验组细胞第８ｄ增殖７．５２倍,第１２ｄ增殖２８．９２倍     

细胞毒T细胞

细胞毒T细胞(CTL)分为CD8 CTLs、CD4 CTLs和CD4-CD8-CTLs几个亚群,它来源于淋巴样造血干细胞的T细胞库,在胸腺中发育成熟,并在周围淋巴组织中活化。效应CTL对靶细胞实行杀伤的途径主要有两条:FasL-Fas介导的细胞凋亡作用和颗粒胞吐途径介导的溶细胞作用。由于CTL在抗肿瘤和抗病毒中效应显著,因而受到广泛重视。     

LAK细胞对肿瘤细胞杀伤作用的形态学研究

本文报道了用人胚胎中期脾脏和胸腺细胞经人重组ＩＬ－２激活而成的ＬＡＫ细胞与正常人淋巴细胞在形态、活性上的区别。并观察了在体外培养条件下ＬＡＫ细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。     

肿瘤抗原致敏树突状细胞诱导机体产生抗肿瘤作用的实验研究

目的：探讨肿瘤抗原冲击致敏的树突状细胞（Dc）诱导机体产生的特异性抗肿瘤作用。方法：体外培养的小鼠骨髓树突状细胞用小鼠结肠腺癌细胞株CT26细胞抗原冲击致敏；混合淋巴细胞反应检测肿瘤抗原致敏DC刺激同基因型T淋巴细胞增殖的能力；观察小鼠经皮下免疫肿瘤抗原致敏DC后诱导产生肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和抵抗CT26细胞再攻击的能力。结果：肿瘤抗原致敏DC能有效刺激同基因型T淋巴细胞增殖反应；小鼠经肿瘤抗原致敏DC免疫后可诱导强烈的CT[，杀瘤活性，产生免疫保护作用，能有效抵抗CT26细胞再攻击，肿瘤生长明显减缓，与未经抗原致敏DC免疫的小鼠组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：肿瘤抗原致敏的DC能有效诱导机体产生特异性的抗肿瘤作用。     

α－CD_3单克隆抗体对肿瘤特异性T细胞的扩增和杀瘤活性的影响

为寻找更有效的肿瘤过继性免疫治疗的方案，用α－ＣＤ３单克隆抗体（单抗）激活ＦＢＬ－３红白血病肿瘤细胞免疫的小鼠脾细胞获取肿瘤特异性Ｔ细胞，并观察α－ＣＤ３单抗对肿瘤特异性Ｔ细胞的增殖、杀瘤活性及表型的影响。体外实验结果显示，免疫小鼠脾细胞经α－ＣＤ３单抗激活后，采用低剂量ＩＬ－２即可维持其长期高度的、持续的增殖；又培养过程中α－ＣＤ３单抗持续存在可大大促进其对肿瘤的特异性杀伤。细胞分型分析结果也支持了α－ＣＤ３单抗的持续存在对维持肿瘤特异性Ｔ细胞的抗瘤活性具有很重要的意义，是肿瘤过继免疫疗法中颇有前景的治疗方案。     

细胞毒淋巴细胞浸润与鼻咽癌细胞凋亡关系的探讨

目的 探讨细胞毒淋巴细胞浸润与鼻咽癌细胞凋亡之间的关系。方法 收集未经治疗的鼻咽癌活检组织30例,采用TUNEL法定量测定鼻咽癌细胞凋亡的程度,用免疫组化的方法检测肿瘤内TIA-1阳性细胞毒淋巴细胞数。结果 按组织学分类,角化性鳞状细胞癌6例,分化型非角化性癌8例,未分化癌16例,平均凋亡指数分别为58.8、62、4和31.6。角化性鳞状细胞癌、分化型非角化性癌与未分化癌之间差异有显著性(P<0.05);每1000个癌细胞范围内浸润的TIA-1阳性细胞为8～62个,在角化性鳞状细胞癌中平均为10.2个,分化型非角化性癌中平均为20.6个,未分化癌平均为22.4个,角化性鳞状细胞癌明显低于分化型非角化性癌、未分化癌,差异有显著性(P<0.05);在分化型非角化性癌、未分化癌中,TIA-1阳性细胞多者,凋亡指数较高(r=0.4047,P<0.05)。结论 鼻咽癌细胞凋亡程度在不同组织学类型中差异有显著性;鼻咽癌组织内TIA-1阳性细胞数在不同的组织学类型中有差别;分化型非角化性癌组织中,TIA-1阳性细胞多者凋亡指数较高。说明细胞毒淋巴细胞具有促进鼻咽癌细胞凋亡的作用。     

抗乙肝胎盘特异转移因子的特异免疫活性观察

报告提取自ＨＢＶＭ一Ａｇ阴性、ＨＢＶＭ一Ａｂ阳性胎盘的特异转移因子的免疫活性，证明经本剂注射的小白鼠外周血淋巴细胞明显增多，胸腺重量和胸腺指数亦明显增加．进而脂酶染色证明７５％属Ｔ一样淋巴细胞，２５％属Ｔｈｙ一样淋巴细胞。此外，用正常人外周血白细胞，或小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞体外转移特异胎盘转移因子（ＰＳＴＦ）的特异免疫活性；豚鼠或小鼠注射ＰＳＴＦ体内转移ＰＳＴＦ特异免疫活性，再取其腹腔巨噬细胞和脾细胞，作白细胞粘附抑制试验、白细胞移动抑制试验、特异淋巴细胞转化试验和小鼠足掌注射试验，均可得到明显阳性结果，说明ＰＳＴＦ对ＨＢＶ具有特异免疫活性，阳性供体可将ＰＳＴＦ的特异免疫活性转移给阴性受体。     

伯氏疟原虫免疫抑制因子对小鼠T淋巴细胞的作用

观察了伯氏疟原虫的免疫抑制因子对小鼠Ｔ淋巴细胞亚群的作用。结果，注射免疫抑制因子小鼠牌细胞中的ＣＤ４Ｔ细胞阳性百分数明显下降，ＣＤ６Ｔ细胞则明显升高，ＣＤ４／ＣＤ８Ｔ细胞幽会显著降低；注射因子对小鼠皮肤抗ＤＮＣＢ的ＤＴＨ反应也明显下降。提示：免疫抑制在子具有诱导、激活ＣＤ８Ｔ细胞活性的功能，使其数目增多，同时造成ＣＤ４Ｔ细胞百分数相对下降，通过抑制ＤＴＨ反应耐影响细胞免疫功能。     

肿瘤坏死因子、干扰素和化疗药物对正常骨骼肌细胞的作用研究

目的:探讨肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)和顺铂(DDP)、表阿霉素(EPI)联合应用对正常骨骼肌细胞的细胞毒作用,为骨恶性肿瘤的治疗提供理论基础.方法:用原代培养的Wister大鼠的骨骼肌细胞作为靶细胞,采用四甲基偶氮唑蓝试验法(MTT)观察TNF、IFN和DDP、EPI联合应用,在不同浓度和不同时间对正常骨骼肌细胞生长的影响.结果:TNF、DDP和EPI联合应用对正常骨骼肌细胞的生长起抑制作用,TNF、IFN、DDP和EPI联合应用,在浓度为250 U/ml 0.000 5 g/L 0.000 5 g/L时可促进骨骼肌细胞的生长与增殖,从浓度为500 U/ml 0.001 g/L 0.001 g/L时转为抑制骨骼肌细胞的生长.结论:TNF、IFN、DDP和EPI联合应用,在低浓度时对正常骨骼肌细胞的生长具有促进、增殖作用,高浓度时可抑制正常骨骼肌细胞的生长作用.     

赛庚啶对大鼠胰岛B细胞内分泌功能的影响

目的　探讨赛庚啶对大鼠胰岛Ｂ细胞内分泌功能的影响。方法　应用放射免疫分析、生化分析法和电子显微镜研究赛庚啶（Ｃｙｐｒｏｈｅｐｔａｄｉｎｅ,Ｃｙｐ）对大鼠胰岛Ｂ 细胞内分泌功能的影响。结果　Ｃｙｐ ２．３ｍ ｇ／（ｋｇ·ｄ）,灌胃给药,连续用药 １０ｄ 可引起大鼠血清胰岛素含量降低（Ｐ＜ ０．０１）,而血糖水平则无显著改变。Ｃｙｐ ４．６ｍ ｇ／（ｋｇ·ｄ）,不但引起血清胰岛素含量显著降低,而且使血糖水平显著升高（Ｐ＜ ０．０１）。电镜观察,大鼠胰岛Ｂ 细胞超微结构亦呈退行性改变。结论　Ｃｙｐ 连续用药可抑制大鼠胰岛Ｂ 细胞的内分泌功能。     

LAK细胞对人肝癌细胞及乙型肝炎病毒的杀伤活性

由健康人外周血制备的ＬＡＫ细胞加ｒＩＬ－２体外培养时间分别为４天和７天，其对人肝癌细胞的杀伤活性分别是５８．７％及４３．２％；其对人肝癌细胞所分泌的ＨＢＶ表面抗原和ｅ抗原也有一定的杀灭活性；结果揭示，ＬＡＫ细胞对与肝炎病毒密切相关的肝癌治疗有着潜在的临床意义。