表皮生长因子受体参与屋尘螨诱导的气道上皮屏障破坏的机制

目的 探讨屋尘螨(HDM)对肌动蛋白应力纤维(F-actin)重新排布的影响及表皮生长因子受体(EGFR)相关信号通路在其中的作用.方法 选取正常人支气管上皮细胞系16HBE细胞为研究对象,以HDM刺激细胞,予EGFR抑制剂AG-1478进行预处理,实验分为4组:Control组,AG-1478组,HDM组,AG-1478+HDM组,应用Western blotting检测HDM对磷酸化(p-)EGFR、F-actin及粘附连接蛋白E-cadherin和β-catenin表达的影响,应用免疫荧光技术观察F-actin、E-cadherin及β-catenin的分布变化,并测量16HBE细胞层的跨上皮电阻(TER)值和右旋糖苷(FITC-DX)的透过率.结果 HDM刺激细胞10 min时,p-EGFR表达明显增多(P<0.05),E-cadherin(P>0.05)及β-catenin(P>0.05)蛋白表达无明显改变,免疫荧光示HDM刺激后E-cadherin及β-catenin均发生分布异常,由胞膜向胞浆弥散.HDM组TER值(70.00±4.33)%显著下降,FITC-DX透过率(115.98±4.34)%明显增加,加入EGFR抑制剂后E-cadherin和β-catenin的分布异常及TER值(90.00±3.75)%、FITC-DX(101.10±2.10)%透过率均明显改善.HDM刺激后促进F-actin表达增多并出现重新排布,而EGFR抑制剂可明显抑制这一过程(P<0.05).结论 表皮生长因子受体相关信号通路参与了屋尘螨介导肌动蛋白应力纤维的重新排布,并导致气道上皮屏障破坏.     

高迁移率族蛋白B1对16HBE细胞血管内皮生长因子表达和分泌的影响

目的:探讨高迁移率族蛋白B1(HMGB1)对人支气管上皮细胞(16HBE)血管内皮生长因子(VEGF)表达和分泌的影响及可能调控机制。方法:16HBE按以下方法分组。1HMGB1不同质量浓度组:0、100、500、2 000μg/L HMGB1刺激16HBE 24 h。2HMGB1不同作用时间组:对照组,2 000μg/L HMGB1分别刺激16HBE 6、12、24h组。MTT检测上述各组干预后16HBE的细胞活力,实时荧光定量PCR检测16HBE VEGF mRNA表达水平的变化,ELISA检测细胞培养上清中VEGF水平。应用P38 MAPK通路特异性抑制剂SB-202190观察其对HMGB1诱导VEGF表达和分泌的影响。结果:随HMGB1作用浓度的增加和作用时间的延长,VEGF的表达和分泌呈上升趋势(P均<0.05),但细胞活力无明显改变(P均>0.05)。HMGB1刺激增加了16HBE细胞VEGF的表达和分泌,SB-202190几乎完全抑制了HMGB1诱导的VEGF的表达和分泌(P均<0.05)。结论:HMGB1可能通过P38 MAPK通路介导支气管上皮细胞VEGF的表达和分泌。     

转化生长因子-β1对慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉上皮紧密连接屏障功能的影响

目的 本研究旨在探讨中国汉族人群中慢性鼻窦炎伴鼻息肉（chronic rhinosinusitis with nasal polyps,CRSwNP）患者鼻腔上皮紧密连接（tight junction,TJ）屏障功能的改变以及转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）对其调控作用。方法 气液界面方法体外培养鼻息肉患者及健康对照鼻腔上皮细胞,待细胞分化完成后加入不同浓度的TGF-β1刺激上皮细胞72 h,检测上皮细胞跨膜阻力（transepithelial resistance,TER）及细胞间荧光素通透性的变化,评价上皮细胞屏障功能的改变;此外,分别应用实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）和免疫荧光技术检测紧密连接相关基因mRNA及蛋白表达的改变。结果 与健康对照上皮相比,鼻息肉来源的上皮细胞TER明显降低,上皮细胞对荧光素FITC-葡聚糖（FITC-Dextran）的通透性增加,10 ng/mL TGF-β1刺激可明显降低两种上皮细胞的TER,同时增加荧光素通透性。细胞紧密连接蛋白occludin及zonula occludens（ZO）-1免疫荧光结果显示,健康对照上皮细胞间紧密连接蛋白呈现连续的线性结构,而鼻息肉上皮紧密连接蛋白表达模式呈现明显破坏,包括紧密连接线性结构分离、断裂等,而经10 ng/mL TGF-β1刺激后,无论健康对照还是鼻息肉来源的上皮细胞间紧密连接蛋白表达模式均有明显破坏。结论 中国汉族鼻息肉患者的鼻腔上皮紧密连接屏障功能有明显的缺陷,而TGF-β1在诱发鼻息肉上皮屏障功能缺陷中发挥了重要的调控作用,或可作为鼻息肉治疗潜在的靶位点。     

IL-1β诱导支气管上皮细胞高迁移率族蛋白1主动释放

目的：研究IL‐1β对健康人支气管上皮细胞（HBE）高迁移率族蛋白1（HMGB1）表达和释放的影响。方法培养HBE135‐E6E7,四唑盐（MTT）法检测不同浓度IL‐1β对支气管上皮细胞活力的影响,荧光定量PCR检测IL‐1β刺激HBE后HMGB1mRNA表达,双抗体夹心ELISA法检测细胞上清液中HMGB1水平,蛋白免疫印迹方法检测IL‐1β刺激HBE总蛋白、胞核、胞质HMGB1表达。免疫荧光观察IL‐1β刺激后对HBEHMGB1的移位的影响。结果0．1、1．0、10．0ng／mLIL‐1β刺激HBE24h对其活力无影响。IL‐1β以浓度和时间依赖性方式刺激HBE的HMGB1mRNA水平升高,IL‐1β增加HBE的HMGB1蛋白表达水平。在浓度依赖性实验,与对照组比较,1．0、10．0ng／mLIL‐1β刺激HBE24h后培养上清液HMGB1水平显著增加;在时间依赖性实验中,与对照组比较,10．0ng／mLIL‐1β刺激HBE12h、24h后细胞上清液中的HMGB1显著升高（P＜0．05）;10．0ng／mLIL‐1β刺激HBE24h后,HBE胞质蛋白明显增加,胞核蛋白减少。免疫荧光检测显示,HMGB1主要表达正常HBE的细胞核内,少量分布于细胞质,IL‐1β（10．0ng／mL）刺激HBE24h,HMGB1明显从HBE胞核向胞质转位。结论IL‐1β可以显著诱导支气管上皮细胞HMGB1的表达和主动释放,提示HMGB1可能参与了IL‐1β介导慢性气道炎症过程。     

25羟维生素D3对正常气道上皮细胞通透性的影响及可能机制

目的探讨25羟维生素D3对人正常气道上皮细胞通透性及ZO-1表达的影响。方法选取正常人支气管上皮细胞系16HBE为研究对象,MTT法分别检测不同浓度25羟维生素D3对细胞活力的影响;实验分组为:对照组,不同浓度25羟维生素D3处理组。各处理因素作用细胞总时间为24h。跨上皮电阻测量仪测量标准化单细胞层跨上皮电阻(TER),比较各组TER差别。进一步用实时定量PCR观测各处理组紧密连接蛋白ZO-1mRNA表达的变化。结果与对照组相比,25羟维生素D3处理组TER(P<0.05)显著增高,但各浓度的25羟维生素D3对ZO-1表达无明显影响(P>0.05)。结论 25羟维生素D3可以使气道上皮通透性减低,但这种效应并非通过上调气道上皮ZO-1表达实现的。     

幽门螺杆菌感染对患儿胃粘膜相关紧密连接蛋白表达水平的影响

目的探讨幽门螺杆菌感染对患儿胃粘膜相关紧密连接蛋白表达水平的影响。方法选取2014年2月-2019年3月因恶心、呕吐、腹痛或黑便等消化道症状在河南省第二人民医院接受胃镜检查的患儿117例,根据有无幽门螺杆菌感染分为幽门螺杆菌感染组(n=63)和非幽门螺杆菌感染组(n=54)。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测两组患儿胃黏膜相关紧密连接蛋白:咬合蛋白(occludin)、闭合小环蛋白-1(ZO-1)、闭合蛋白-4(claudin-4)及钙黏附蛋白-E(E-cadherin)的mRNA表达水平;采用免疫组化法检测幽门螺杆菌感染组患儿治疗前后胃黏膜occludin、ZO-1、claudin-4及E-cadherin的蛋白表达情况。结果与非幽门螺杆菌感染组相比,幽门螺杆菌感染组患儿胃黏膜ZO-1和E-cadherin mRNA表达水平显著降低,claudin-4 mRNA表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P0.05);与无溃疡组患儿相比,溃疡组患儿claudin-4的mRNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05),其余指标差异无统计学意义(P0.05)。免疫组化结果显示,与治疗前相比,治疗后幽门螺杆菌感染组患儿胃黏膜occludin、ZO-1和E-cadherin蛋白表达阳性率及表达量均显著升高,差异有统计学意义(P0.05);而claudin-4蛋白表达阳性率及表达量显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论幽门螺杆菌感染患儿胃黏膜屏障功能受损,紧密连接蛋白occludin、ZO-1及E-cadherin表达下调,其中claudin-4与幽门螺杆菌感染患儿溃疡程度密切相关,在临床诊治中具有指导性意义。     

HSP90α通过调控气道上皮细胞内质网应激加重屋尘螨诱导的哮喘气道炎症

目的 探讨热休克蛋白90（HSP90α）参与屋尘螨（HDM）诱导的哮喘气道炎症的作用及调控气道上皮细胞内质网应激的机制。方法 人气道上皮细胞HBE体外培养,由HDM诱导哮喘体外模型,浓度梯度刺激24 h,分为正常对照组;200 U/mL组;400 U/mL组;800 U/mL组。随后分别使用siHSP90α干扰序列转染及HSP90抑制剂17-AAG干预,分为HBE正常对照组、HBE+HDM组（800 U/mL,24 h）、HBE+HDM（800 U/mL,24 h）+siHSP90α（50 nmol,12 h）组、HBE+HDM（800 U/mL,24 h）+17-AAG（900 nmol,6 h）组,测定HSP90α以及内质网应激标志物的表达水平。C57BL/6小鼠由HDM诱导哮喘体内模型,分为正常对照组、17-AAG滴鼻组、HDM滴鼻组、HDM+17-AAG滴鼻组,测定气道炎症水平与内质网应激标志物的表达水平。结果 在HDM诱导的HBE细胞哮喘体外模型中,蛋白电泳结果显示HSP90α（P=0.011）表达上调,琼脂糖凝胶电泳结果显示内质网应激标志物XBP-1（P=0.044）、ATF-6α（P=0.030）和GRP-78（P=0.027）表达水平显著上调;而敲低HSP90α和使用17-AAG会显著抑制HDM诱导的XBP-1（P=0.008）上调;在HDM诱导的哮喘小鼠模型中,相较于HDM组,H&E染色和瑞氏-姬萨姆染色显示HDM+17-AAG组的气道炎症改善,炎症细胞聚集明显减少。肺泡灌洗液计数显示,炎症细胞数量显著减少（P=0.014）。ELISA法显示肺泡灌洗液中炎症因子IL-4（P=0.030）、IL-5（P=0.035）显著降低。免疫组织化学染色显示气道上皮细胞XBP-1和GRP-78表达明显减少。结论 HSP90α加重HDM诱导的哮喘气道炎症,可能通过上调内质网应激实现的。     

IL-33通过TGF-β1/Smad3信号通路调控CES诱导细胞上皮-间质转化的机制研究

目的 探讨IL-33在烟草提取物(CSE)诱导细胞上皮-间质转化(EMT)形成过程中的作用机制。方法 将人支气管上皮细胞(16HBE)分为对照组、CSE组、CSE+Anti-IL-33组、CSE+IL-33组,按照实验分组分别给予PBS、5%CSE、5%CSE+Anti-IL-33(3μg/mL)、5%CSE+IL-33(40 ng/mL)刺激72 h。免疫荧光检测细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)荧光强度,Western blot检测细胞E-cadherin、Vimentin、肿瘤发生抑制蛋白2(ST2)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、母亲信号蛋白同源物(Smad3)、磷酸化Smad3(p-Smad3)蛋白表达。结果 与对照组比较,CSE暴露后干预各组细胞E-cadherin蛋白表达降低,Vimentin、ST2、TGF-β1、p-Smad3蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与CSE组比较,CSE+Anti-IL-33组E-cadherin蛋白表达升高,Vimentin、ST2、TGF-β1、p-Smad3蛋白表达降低,C...     

过氧化氢诱导支气管上皮细胞高迁移率族蛋白1主动释放

目的研究过氧化氢(H2O2)对正常人支气管上皮细胞(HBE)HMGB1表达、移位和释放的影响。方法四唑盐(MTT)法检测不同浓度H2O2对支气管上皮细胞活力的影响;蛋白免疫印迹方法分别检测H2O2刺激HBE胞核,胞浆以及细胞培养上清中HMGB1浓度。免疫荧光观察HBE的HMGB1的定位和H2O2刺激后对HBE HMGB1的移位的影响。结果 125μmmol/L刺激对HBE活力无影响,而250μmmol/L会导致细胞活力下降(与对照组组比较,P<0.05),但是不引起细胞死亡,400μmmol/L(与对照组比较,P=0.000)导致HBE死亡。在浓度依赖性实验,与对照组比较12.5、125、250μmmol/L H2O2刺激HBE 24 h后培养上清HMGB1水平显著增加;在时间依赖性实验中与对照组比较,125μmmol/L H2O2刺激HBE 12、24 h后细胞上清中的HMGB1显著升高(P<0.05);12.5μmmol/L H2O2刺激HBE 24 h后,HBE胞浆蛋白明显增加,胞核蛋白减少。而免疫荧光检测示HMGB1高丰度分布正常HBE的细胞核内,少量分布于细胞浆,125μmmol/L H2O2刺激HBE 12 h,HMGB1明显从HBE胞核向胞浆转位;125μmmol/L H2O2刺激HBE 24 h后观察到HMGB1移位分布到胞膜上。结论 H2O2可以显著诱导支气管上皮细胞HMGB1的表达、转位和释放,提示HMGB1可能参与了哮喘,COPD等慢性炎症疾病气道的氧化应激过程。     

埃兹蛋白在转化生长因子-β诱导的支气管上皮细胞间充质转化中的作用

目的探讨埃兹蛋白(ezrin)在支气管上皮细胞(16HBE)间充质转化(EMT)中的作用。方法建立转化生长因子-β(TGF-β)诱导的16HBE的EMT模型;RT-PCR和Western blot法检测16HBE中ezrin m RNA和蛋白表达;通过慢病毒sh RNA抑制ezrin表达,观察细胞形态,检测细胞EMT的生物标志分子上皮钙黏着蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)和α-平滑肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)的m RNA和蛋白表达水平;加入外源性ezrin蛋白,细胞免疫荧光、RT-PCR及Western blot法检测其对EMT标志物的影响。结果 TGF-β能下调16HBE中ezrin的m RNA和蛋白表达。经ezrin敲减后,同TGF-β刺激表现相同,16HBE也由典型的铺路石样变为梭形,同时其E-cadherin表达下降,vimentin和α-SMA表达增加;加入重组蛋白ezrin后,16HBE的E-cadherin表达增多,vimentin和α-SMA表达下降。结论 TGF-β可能通过下调ezrin表达促进16HBE发生EMT。     

组胺对皮肤角化上皮屏障功能的作用的研究

目的检测体外培养人皮肤角化上皮细胞在组胺刺激下的跨膜阻力(trans-epithelial resistance,TER)和细胞间通透性的变化,研究组胺对角化上皮屏障功能的作用。方法应用气-液细胞培养技术(air-liquid interface,ALI)培养正常人和特异性皮炎(atopic dermatitis,AD)患者皮肤原代角化上皮细胞,以组胺及其受体拮抗剂等连续刺激上皮细胞96 h,监测TER及细胞间荧光素通过强度,评价皮肤角化上皮屏障功能的改变。结果组胺刺激可以降低皮肤角化上皮细胞的TER,增加上皮细胞间荧光素FITC-葡聚糖(FITC-Dextran)的通透性,作用曲线呈时间和剂量依赖性,组胺刺激与对照组相比差异具有统计学意义;组胺受体1(histamine 1 receptor,H1R)拮抗剂可以抑制组胺对TER的降低作用,而Ca2+载体离子霉素可以诱导类似组胺对TER的降低作用,差异具有统计学意义。结论本实验提示组胺可以降低人皮肤原代角化上皮细胞的屏障功能,有可能与AD等慢性皮肤炎性疾病的发病机制有关,并有可能为临床治疗提供选择依据。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注早期血脑屏障通透性变化的研究

目的探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注早期血脑屏障通透性及紧密连接蛋白claudin-5、occludin和蛋白激酶Cδ(PKCδ)表达的变化。方法采用线栓法制作大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,伊文思蓝法检测血脑屏障的通透性变化,免疫组化和Western blot方法检测脑缺血组织claudin-5和occludin的表达,Western blot方法检测脑缺血组织PKCδ蛋白的表达。结果伊文思蓝法结果表明,与假手术组比较,血脑屏障通透性在缺血1 h、缺血2 h、再灌注0.5 h、1 h、2 h时显著升高(P<0.01)。免疫组化和Western blot结果显示,与假手术组比较,脑缺血组织血管内皮细胞claudin-5和occludin的表达亦在缺血1 h、缺血2 h、再灌注0.5 h、1 h、2 h时显著下降(P<0.01);而PKCδ蛋白在缺血1 h、缺血2 h、再灌注0.5 h、1 h、2 h时表达显著上调(P<0.01)。结论大鼠局灶性脑缺血再灌注早期血脑屏障通透性的增加可能与claudin-5、occludin表达下降和PKCδ蛋白激活有关。     

Lyn对屋尘螨诱导的人支气管上皮细胞中MUC5AC表达的影响及其机制

目的：探讨Lyn对屋尘螨（HDM）诱导的人支气管上皮细胞中MUC5AC表达的影响,并初步阐明其可能的相关作用机制。方法：选取人支气管上皮16HBE细胞,将其分为PBS组（给予PBS）和HDM组（给予1 μg·L^-1HDM）,采用脂质体转染法将LynsiRNA分别转至PBS组和HDM组细胞。构建人MUC5AC启动子荧光素酶报告基因,采用Promega双荧光素酶报告基因试剂盒检测相对荧光素酶活性（RLU）,采用免疫荧光法检测16HBE细胞中MUC5AC的表达,并在共聚焦显微镜下观察。采用Western blotting法检测16HBE细胞中STAT6的表达水平。结果：双荧光素酶报告基因检测,HDM组16HBE细胞中MUC5AC启动子的RLU高于PBS组（P<0.05）;与未干扰时比较,LynsiRNA干扰后HDM组RLU明显升高（P<0.05）。免疫荧光法检测,HDM组MUC5AC表达水平高于PBS组（P<0.05）;与未干扰时比较,LynsiRNA干扰后HDM组MUC5AC表达水平升高（P<0.05）。Western blotting法检测,LynsiRNA干扰后,HDM组细胞中STAT6表达水平升高（P<0.05）。结论：Lyn缺失能增加人支气管上皮细胞中MUC5AC的表达,其机制可能与Lyn调控STAT6信号途径有关。     

shRNA干扰β-catenin对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化的作用

目的构建特异性针对β-catenin基因的shRNA干扰载体,转染TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞株HKCs,研究其对肾小管上皮细胞转分化的影响。方法将构建的shRNA-β-catenin干扰载体转染TGF-β1诱导的HKC细胞,RT-PCR、Western blot检测β-catenin的mRNA及蛋白表达水平,筛选抑制效果最佳载体;RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot检测肾小管上皮细胞转分化相关蛋白E-cadherin、α-SMA的mRNA及蛋白表达水平。结果经酶切和测序鉴定,成功构建的shRNA-β-catenin表达载体转染HKC细胞,β-catenin在mRNA及蛋白表达水平均低于转染空白载体组(P<0.05),并筛选shRNA-β-catenin-1进入实验组;转染shRNA-β-catenin-1组细胞β-catenin在mRNA及蛋白表达水平均低于TGF-β1诱导组和空载体组(P<0.05),且β-catenin转核显著减弱(P<0.05);E-cadherin的mRNA及蛋白表达水平较TGF-β1诱导组和空载体组显著上调(P<0.05)、α-SMA的mRNA及蛋白表达水平较TGF-β1诱导组和空载体组显著下调(P<0.05)。结论运用shRNA-β-catenin干扰载体转染TGF-β1诱导的HKC细胞,能够抑制肾小管上皮细胞-间充质转分化。     

烟草烟雾暴露对气道上皮细胞转分化改变的初探

目的:观察烟草烟雾暴露人气道上皮细胞(16HBE)后,发生间充质转分化(EMT)样改变。方法:(1)以不同浓度(5~50μg/mL)CSC刺激16HBE 7 d,用CCKit-8检测细胞总体活性,筛选最佳浓度。(2)用CSC最大活性影响浓度刺激16HBE 7 d,观察细胞形态改变,经Western-blot法和细胞免疫荧光技术检测上皮细胞标志物E钙黏蛋白(E-cad)及EMT标记物1型胶原(COL1)、波形蛋白(Vimentin)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达水平。结果:(1)不同浓度CSC刺激后,16HBE在10μg/mL时OD值最高,为(2.562±0.045)。各浓度间OD值比较差异均有统计学意义(P0.05)。(2)经10μg/mL CSC刺激后,部分16HBE形态由鹅卵石状向长梭形、多角形或星形改变。(3)Western-blot检测发现试验组COL1、MMP-9的蛋白表达量分别为(0.566±0.011)和(0.463±0.003),高于对照组(0.272±0.020)和(0.201±0.023),差异均有统计学意义(P0.05);而E-cad蛋白表达量则明显低于对照组,分别为(0.301±0.041)和(0.591±0.068),差异有统计学意义(P0.05)。(4)细胞免疫荧光检测发现试验组COL1、Vimentin和MMP-9蛋白表达量均高于对照组(P0.05);而E-cad蛋白表达量明显低于对照组(P0.05)。结论:经CSC刺激后,16HBE可出现转分化样改变。     

高迁移率族蛋白 B1活化 p38 MAPK 对人支气管上皮细胞胸腺基质淋巴生成素表达的影响

目的：探讨高迁移率族蛋白B1（HMGB1）对人支气管上皮细胞（HBE）胸腺基质淋巴生成素（TSLP）表达的影响及机制。方法应用实时荧光定量PCR和ELISA分别检测HMGB1刺激HBE后TSLP基因表达及蛋白释放水平;用Western blot和ELISA分别检测p38 MAPK抑制剂SB202190干预HBE后磷酸化ATF－2蛋白（ p－ATF－2）表达及TSLP释放水平。结果（1）HMGB1以浓度依赖形式增加HBE TSLP的表达;（2）相对于HMGB12000 ng／mL的干预,SB202190抑制剂可明显减少活化的HBE p－ATF－2蛋白的表达（ P＜0.01）及其TSLP的释放（ P＜0.01）。结论 HMGB1可活化p38 MAPK通路增加HBE TSLP的表达,可能以此参与哮喘的发病过程。     

鳞状细胞癌和博温病紧密连接相关蛋白

背景:表皮是一种典型的复层上皮,在颗粒层紧密连接(TJs),单层上皮也是这样。迄今为止,已经报道过单层上皮肿瘤TJs的异常,并涉及到claudin-1。目的:检测紧密连接相关蛋白(occludin,ZO-1,claudin-1,claudin-4)在正常人上皮和恶性角化性疾病中表达情况。方法:应用免疫荧光染色法检测紧密连接相关蛋白在正常上皮、5例鳞状细胞癌(SCC)患者和5例博温病患者中的表达情况。结果:Occludin,ZO-1和claudin-4特异性表达于正常上皮细胞与细胞的边缘,而claudin-1表达于整个上皮中。在SCC,角化的肿瘤细胞如癌角珠高度表达occludin,ZO-1,claudin-1和c…     

α肌动蛋白基因转录激活因子HMGB34367的克隆和调控功能研究

目的:探讨从博来霉素致肺纤维化小鼠肺组织中筛选出的高迁移率族蛋白B1(HMGB1)亚家族成员HMGB34367,作为转录因子对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因表达的影响。方法:①克隆与构建HMGB34367真核表达载体及α-SMA启动子红色荧光报告质粒。②构建质粒共转染气道上皮细胞系16HBE,荧光显微镜观察重组转化生长因子-β1(rhTGF-β1)刺激下红色荧光的表达。③电泳迁移率(EMSA)及超迁移实验分析HMGB34367和α-SMA启动子CArGB基序的特异性结合活性。④RT-PCR检测细胞转染HMGB34367真核表达载体HMGB34367-pcDNA3.0对内源性α-SMA基因表达的影响。结果:细胞过表达HMGB34367能活化α-SMA启动子,转染HMGB34367-pcDNA3.0质粒的16HBE细胞核蛋白,显著增强了与α-SMA启动子CArGB序列特异结合,过表达HMGB34367诱导了α-SMA基因表达。结论:HMGB34367基因编码蛋白能作为转录因子特异性地诱导α-SMA启动子的转录激活,上调αS-MA基因表达。提示致纤维化环境因子通过诱导HMGB34367表达使αS-MA基因转录激活,可能在气道重塑和肺纤维化的病理过程中发挥重要作用。     

钙激活Cl~-通道蛋白在急性呼吸窘迫综合征患者体外气道上皮细胞中的表达及其作用实验研究

目的:探讨钙激活Cl~-通道蛋白(CLCA)在急性呼吸窘迫综合征(ARDS)体外气道上皮细胞中的蛋白表达情况,并初步探讨其作用。方法:运用脂多糖(LPS)刺激16HBE细胞系,Western Blot检测hCLCA1蛋白表达水平与ARDS的时程关系;运用hCLCA1-siRNA干扰16HBE细胞系中hCLCA1的表达,real-time RT-PCR法检测细胞系中hCLCA1的mRNA和蛋白表达水平,验证siRNA是否对目的基因成功抑制。同时检测炎症因子的mRNA表达变化水平,观察CLCA的降低与炎症因子表达的关系。结果:Western Blot结果显示:16HBE细胞系加LPS(1μg/ml)刺激12h、24h后hCLCA1的蛋白表达量下降,且LPS刺激24h后hCLCA1的降低有统计学差异(P<0.05)。real-time RT-PCR检测证实hCLCA1-siRNA对目的基因成功抑制,表明成功构建hCLCA1低表达的16HBE细胞系;同时real-time RT-PCR结果显示TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平升高(P<0.05)。结论:CLCA在LPS刺激后的培养HBE细胞系中蛋白表达水平下降,并表现为时间依赖性。抑制HBE细胞系hCLCA1的基因表达,则该细胞分泌炎症因子的水平升高,推测CLCA在ARDS体外气道上皮细胞分泌炎症介质过程中发挥负性调节作用。     

KIF3A通过结合Wnt/β-catenin通路中的β-arrestin参与哮喘气道上皮的炎症调控

目的 研究KIF3A参与哮喘气道炎症调控的可能机制,为哮喘治疗提供新的靶点和方向.方法 选取20只雌性6～8周龄C57BL/6小鼠建立哮喘模型,随机分为哮喘组与对照组(n= 10).Western blot和免疫组化(IHC)检测两组小鼠KIF3A的表达;在体外分别用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)和屋尘螨(house dust mite,HDM)干预人支气管上皮细胞 16HBE,Western blot 和RT-PCR检测KIF3A的表达;构建含有KIF3A的过表达组(LV-KIF3A-45894-J2,LV-KIF3A)和RNA干扰序列的慢病毒载体组(LV-KIF3A-RNAi-81183-1,RNAi),用含有空载的慢病毒和阴性对照序列的慢病毒载体作为对照,分别感染16HBE;免疫共沉淀检测过表达组中KIF3A与β-arrestin的结合,同时Western blot和RT-PCR检测各组细胞β-catenin的表达水平,RT-PCR检测KIF3A基因差异表达对趋化因子CCL-17和CCL-26表达的影响.结果 哮喘组的KIF3A表达水平较对照组减少(P＜0.05).HDM干预16HBE后的KIF3A蛋白和mRNA表达水平较对照组有下降趋势,但无统计学差异(P＞0.05).慢病毒载体感染16HBE 72 h且经流式分选绿色荧光阳性细胞后,RT-PCR和Western blot结果显示LV-KIF3A组和RNAi组的KIF3A蛋白和mRNA表达分别增多(P＜0.05)和下降(P＜0.05).免疫共沉淀证实KIF3A与β-arrestin相结合.LV-KIF3A组和RNAi组的β-catenin蛋白总量无明显差异;与对照组相比,RNAi组的β-catenin mRNA表达显著下降(P＜0.000 1),LV-KIF3A组则无统计学差异.RT-PCR结果显示,与对照组相比,RNAi组的趋化因子CCL-17和CCL-26的mRNA水平增加(P＜0.001),LV-KIF3A 组则降低(P＜0.05).结论 KIF3A 与 Wnt/β-catenin 通路中的 β-arrestin 结合,通过调节趋化因子CCL-17和CCL-26的表达而参与哮喘气道上皮炎症的调控.