聚焦超声对软骨细胞损伤中炎症因子和焦亡蛋白的影响

目的 探讨低强度脉冲聚焦超声（focused low-intensity pulsed ultrasound, FLIPUS）对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导软骨细胞炎症因子释放及细胞焦亡相关蛋白表达的影响及保护软骨的作用机制。方法 提取C57BL /6J 乳鼠膝关节原代软骨细胞进行体外实验,LPS处理软骨细胞模拟骨关节炎样软骨细胞损伤并进行验证。细胞分为Control组、LPS组和LPS+FLIPUS组。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组软骨II型胶原（COL2α1）,炎症细胞因子：白细胞介素-18（interleukin-18, IL-18）和IL-1β,炎症小体：NOD样受体蛋白3（NOD ? likereceptorthermalproteindo?main3, NLRP3）和裂解半胱氨酸蛋白酶?1（Cleaved cysteinylaspartatespecificproteinase1, Cleaved Caspase?1）,焦亡蛋白：gasdermin D N端片段(N-terminal fragment of gasdermin D, GSDMD-N),软骨基质降解因子：基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13, MMP-13)、MMP3和血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶-5(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs-5, ADAMTS-5)蛋白表达,钙黄绿素/碘化丙啶（Calcein am/PI）荧光染色和乳酸脱氢酶（lactic acid dehydrogenase, LDH）释放实验检测细胞活性,扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）检测细胞的形态变化,ELISA检测细胞上清液中IL-1β、IL-18水平。结果 成功提取膝关节原代软骨细胞并模拟骨关节炎样软骨细胞损伤。与Control组相比,LPS组COL2α1蛋白表达明显降低（P<0.001）,ADAMTS5、MMP13、MMP3、NLRP3、GSDMD-N、Cleaved Caspase 1、IL-18和IL-1β蛋白表达增加（P<0.05）,IL-18、IL-1β和LDH释放增加（P<0.01）,细胞肿胀变形,膜上出现较多孔隙丧失完整性,细胞死亡率增加（P<0.01）;与LPS组相比,LPS+FLIPUS组COL2α1蛋白表达上升（P<0.01）,ADAMTS5、MMP13、MMP3、NLRP3、GSDMD-N、Cleaved Caspase 1、IL-18和IL-1β蛋白表达明显下降（P<0.05）,IL-18、IL-1β和LDH释放减少,细胞肿胀程度减轻,膜上孔隙减少,细胞死亡率下降（P<0.05）。结论 FLIPUS可能通过抑制炎症因子和细胞焦亡相关蛋白减轻脂多糖诱导的软骨细胞损伤,保护软骨。     

富马酸二甲酯通过NF-κB通路抑制IL-1β诱导的小鼠软骨细胞炎症

目的探讨富马酸二甲酯对软骨细胞炎症的治疗作用及其机制。方法用不同浓度的富马酸二甲酯处理IL-1β诱导的小鼠ATDC5细胞。通过CCK-8实验检测富马酸二甲酯对软骨细胞毒性、增殖的影响;阿利新蓝染色分析富马酸二甲酯对细胞表型的影响;实时定量荧光PCR检测MMP3、MMP9、MMP13和SOX9的mRNA表达;Western印迹法检测MMP9、MMP13、Col2a1及NF-κB通路相关蛋白表达水平;免疫荧光染色检测p65磷酸化入核的影响。结果富马酸二甲酯在0~25 μmol/L对ATDC5细胞的增殖活性没有影响;与对照组相比,IL-1β刺激ATDC5细胞后NF-κB通路被激活,IκBα蛋白表达下降,而p-IKKα、p-IκBα和p-p65蛋白表达增加,活化的NF-κB p65进入细胞核中,MMP3、MMP9、MMP13的表达上升,Col2a1和SOX9的表达下降（P＜0.05）;与IL-1β组比较,富马酸二甲酯治疗后提高IκBα表达,降低了p-IKKα、p-IκBα和p-p65的表达,阻断了NF-κB p65进入细胞核中,MMP3、MMP9、MMP13的表达下降,Col2a1和SOX9的表达上升（P＜0.05）。结论富马酸二甲酯可能通过抑制NF-κB通路来发挥对软骨细胞的保护作用,以改善软骨细胞的炎症反应。     

模拟步行压力下牛蒡子苷元对软骨细胞的保护机制研究

目的:探讨模拟步行压力对软骨细胞的作用及压力负荷下牛蒡子苷元(ARG)对软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白(ColⅡ)、SRY相关高迁移率族盒蛋白转录因子9(SOX9)、瞬时受体电位香草素亚家族4(TRPV4)、基质金属蛋白酶(MMPs)的影响。方法:分离并培养小鼠原代软骨细胞,制备3D培养软骨细胞水凝胶。将制备的水凝胶分为空白组、模型组、ARG组和抑制剂组。空白组不进行压力干预,使用常规培养基换液。其他3组均给予模拟步行压力(正弦波,1 Hz,20 kPa)干预2 h。压力干预同时,ARG组和抑制剂组分别给予10μmol/L ARG和10 nmol/L TRPV4抑制剂GSK2193874。收集干预后各组水凝胶提取的软骨细胞,免疫荧光染色检测ColⅡ蛋白表达,PCR检测ColⅡ、SOX9、TRPV4、MMP9、MMP13的mRNA表达水平,Western blot检测ColⅡ、SOX9、TRPV4的蛋白表达水平。结果:(1)免疫荧光染色观察显示,与空白组相比,模型组ColⅡ蛋白表达较少;与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ蛋白表达明显增多。(2)与空白组相比,模型组ColⅡ、SOX9、TRPV4的mRNA表达量显著降低(P0.01),MMP9和MMP13的mRNA表达量均显著增高(P0.01);与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ、SOX9、TRPV4的mRNA表达量显著增高(P0.01),MMP9和MMP13的mRNA表达量均显著降低(P0.01)。(3)与空白组相比,模型组ColⅡ和SOX9蛋白表达水平显著降低(P0.01),TRPV4蛋白表达无明显变化;与模型组相比,ARG组和抑制剂组ColⅡ和SOX9蛋白表达水平显著增高(P0.01),TRPV4蛋白表达水平显著降低(P0.01)。结论:模拟步行压力可导致软骨细胞发生趋向于软骨退化的代谢反应。模拟步行压力下,ARG和TRPV4抑制剂对软骨细胞具有保护作用,其机制可能与上调ColⅡ、SOX9表达,抑制TRPV4、MMP9和MMP13的表达有关。     

白脉软膏含药血浆对大鼠退变滑膜细胞和软骨细胞共培养体系的作用及机制研究

【目的】观察白脉软膏含药血浆对大鼠退变滑膜细胞和软骨细胞共培养体系的干预作用,并从"滑膜—软骨"轴角度探讨骨关节炎(OA)的发病机制。【方法】取新生SD大鼠膝关节滑膜,经消化酶消化后获得原代滑膜细胞,取第1代(P1)细胞进行实验。实验设空白组、模型组、西药组、白脉组。模型组加入脂多糖(LPS)进行诱导,西药组与白脉组在模型组LPS诱导的基础上分别加入扶他林软膏、白脉软膏含药血浆干预。LPS诱导24 h后观察滑膜细胞形态变化,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测滑膜细胞上清中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。此后,各组皆与正常软骨细胞进行共培养。共培养24 h后观察软骨细胞形态,实时定量PCR(qPCR)检测软骨细胞基质金属蛋白酶3(MMP3)、带有血小板凝血酶敏感蛋白样模体的解整链蛋白金属蛋白酶4(ADAMTS4)、TNF-α、性别决定区Y框蛋白9(Sox9)mRNA表达情况,Westernblot法检测Ⅱ型胶原蛋白(COL2A1)、基质金属蛋白酶13(MMP13)、磷酸化核因子κBp65(p-NF-κBp65)表达情况。【结果】LPS诱导后滑膜细胞形态由原来的多角形变成长梭形。ELISA结果显示,模型组滑膜细胞上清中IL-1β、TNF-α含量较空白组升高(P 0.05),而白脉组IL-1β、TNF-α含量较模型组下降。软骨细胞与退变滑膜细胞培养24 h后由原来的多角形变为长梭形。qPCR结果显示:与空白组比较,模型组软骨细胞MMP3、ADAMTS4、TNF-αmRNA表达升高(P 0.05),Sox9mRNA表达降低(P 0.05);与模型组比较,白脉组软骨细胞MMP3、TNF-α、ADAMTS4 mRNA表达明显降低(P 0.05),Sox9 mRNA表达水平升高(P 0.05)。Western blot结果显示:与空白组比较,模型组软骨细胞MMP13、p-NF-κBp65表达升高(P 0.05),COL2A1表达明显降低(P 0.05);与模型组比较,白脉组软骨细胞MMP13、p-NF-κBp65表达降低(P 0.05),COL2A1表达升高(P 0.05)。【结论】退变滑膜细胞可导致软骨细胞退变并促进骨关节炎发展,白脉软膏对此病理过程有明显的抑制作用。     

益气养血方抗兔膝骨关节炎模型软骨退变的作用及机制研究

目的探讨益气养血方对兔膝骨关节炎(KOA)模型软骨细胞凋亡及血清白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Ⅱ型胶原蛋白(COL-Ⅱ)、人基质金属蛋白酶-13(MMP13)表达的影响,揭示其抗骨关节炎软骨退变的作用及机制。方法 40只日本大耳白兔随机分为4组,即假手术组、KOA模型组、阳性药(双醋瑞因)组、益气养血方组各10只。石蜡切片HE染色观察软骨退变情况,TUNEL法检测软骨细胞凋亡,免疫组化检测COL-Ⅱ、MMP13的表达。结果益气养血方对KOA模型兔膝关节软骨退变具有一定抑制作用,能下调血清促炎细胞因子TNF-α产生水平(P0.05),抑制软骨细胞凋亡;能下调软骨组织MMP-13蛋白的表达(P0.01),上调软骨组织COL-Ⅱ胶原的表达(P0.05),抑制软骨基质降解。结论益气养血方通过下调TNF-α、MMP-13蛋白表达,同时上调COL-Ⅱ胶原表达,抑制软骨细胞凋亡及细胞外基质降解,可能是益气养血方治疗骨关节炎的作用机制之一。     

膝痹通络方通过调节MAPK-MEK信号通路延缓对白细胞介素1β诱导的关节软骨细胞退变

【目的】观察膝痹通络方对白细胞介素1β(IL-1β)诱导的软骨细胞退变的影响,并从丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)-MAPK激酶(MEK)信号通路探讨其机制。【方法】提取新生SD大鼠四肢关节软骨细胞,选择P1代细胞进行实验,共设5组:正常对照组,IL-1β组,高、中、低浓度中药组。正常对照组软骨细胞加入正常大鼠血清培养;IL-1β组软骨细胞加入正常大鼠血清、20 ng/mL IL-1β培养;高、中、低浓度中药组软骨细胞分别加入对应浓度的膝痹通络方含药血清进行培养,并加入20 ng/mL IL-1β。24 h后倒置显微镜下观察软骨细胞大小、密度、形态,采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测软骨细胞基质金属蛋白酶3(MMP3)、聚蛋白多糖酶4/5(ADAMTS4/5)、蛋白多糖(A-CAN)、性别决定区Y框蛋白(SOX9)等软骨退变相关基因的表达,蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测软骨细胞SOX9、基质金属蛋白酶13(MMP13)、磷酸化原癌基因丝苏氨酸蛋白激酶(P-Raf1)、Raf-1、磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶(P-MEK1)、MEK1的蛋白表达。【结果】倒置显微镜下可见,经IL-1β炎性因子诱导后的软骨细胞出现退变形态;q PCR结果显示,与IL-1β组比较,各浓度中药组MMP3、ADAMTS4/5的mRNA表达水平降低(P0.05),A-CAN的mRNA表达水平升高(P0.05),高浓度中药组SOX9的mRNA表达水平升高(P0.05);Western Blot结果显示,与IL-1β组比较,各浓度中药组软骨细胞MMP13蛋白表达,Raf1、MEK1磷酸化水平降低(P0.05),SOX9蛋白表达水平升高(P0.05)。【结论】膝痹通络方可延缓IL-1β诱导的软骨细胞退变,其机制可能与调节MAPK-MEK信号通路相关蛋白及基因表达有关。     

参麦注射液关节腔注射对兔膝骨关节炎IL-1β、IL-6、TNF-α表达的影响

目的 研究参麦注射液对兔膝骨关节炎模型的干预作用,并探讨其作用机理.方法 行前交叉韧带切除法(ACLT)复制兔膝骨关节炎模型,予膝关节腔注射参麦注射液、透明质酸钠4周后,取膝关节液及关节软骨组织,用ELISA法检测关节液白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,RT-qPCR检测关节软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α基因表达.结果 与正常对照组比较,模型组关节液IL-1β、IL-6和TNF-α的表达均明显升高(P＜0.01),软骨组织IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达均明显升高(P＜0.01);与模型组比较,参麦注射液组和透明质酸钠组关节液IL-1β、IL-6和TNF-α表达均显著降低(P＜0.01),软骨组织IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA均显著降低(P＜0.05).参麦注射液组与透明质酸钠组各指标比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 参麦注射液对兔膝关节软骨有一定的保护作用,其作用机制与下调关节液IL-1β、IL-6、TNF-α水平,降低软骨组织IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达有关.     

ERK1/2信号通路介导PDGF-CC诱导的鼠心肌纤维化及其机制

目的 研究ERK1/2通路在血小板源性生长因子(PDGF)-CC诱导的鼠心肌纤维化中的作用及其可能的机制.方法 取SD大鼠乳鼠心脏组织,差速贴壁法分离并纯化心肌成纤维细胞.按不同药物处理随机分成对照组(CON组)、PDGF-CC(P组)、PDGF-CC+ERK1/2抑制剂U0126(PU组).MTT法检测心肌成纤维细胞的增殖,qRT-PCR法检测mRNA含量,Western blot法分析蛋白表达量.结果 MTT法显示P组细胞数较CON组显著增加(P＜0.01),而PU组细胞数较P组明显减少(P＜0.01).qRT-PCR法显示P组中PDGF-α受体(PDGFR-α)、ERK1、ERK2、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白(Col Ⅰ、ColⅢ)的mRNA表达水平均明显高于CON组(P ＜0.001),PDGFR-β的mRNA表达量在P组与CON组间差异无统计学意义.与P组相比,PU组中PDG-FR-α、ERK1、ERK2、Col Ⅰ和ColⅢmRNA表达均明显下降(P＜0.01).Western blot法显示P组中磷酸化PDGFR-α(p-PDGFR-α)、ERK1/2、p-ERK1/2、Col Ⅰ和ColⅢ的表达量均明显高于CON组(P ＜0.001),PU组中p-PDGFR-α、ERK1/2、p-ERK1/2、Col Ⅰ和ColⅢ蛋白表达量均显著低于P组(P＜0.001).结论 PDGF-CC可能通过结合PDGFR-α激活ERK 1/2信号通路,诱导鼠心肌成纤维细胞过量增殖伴胶原蛋白的合成,参与心肌纤维化的发生.     

基于W m啡eaterin信号通路探讨去霉附子场对骨关节类大鼠的软骨保护作用

[目的]基于Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路探讨去毒附子汤(detoxicated Fuzi decoction，FZT)对膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)的作用及相关机制。[方法]将30只雌性无特殊病原体(specific pathogen free，SPF)级SD大鼠随机分为正常组，模型组，FZT低、中、高剂量组，每组6只。模型组，FZT低、中、高剂量组均采用碘乙酸关节腔注射造模法构建大鼠KOA模型。建模成功后，FZT低、中、高剂量组分别以2.4、4.8、9.6 g·kg-1的FZT灌胃，模型组和正常组以同剂量的0.9%氯化钠溶液灌胃，连续4周。首次给药前和末次给药后，对各组大鼠进行疼痛行为学检测。末次给药后1周，取各组大鼠膝关节软骨组织，进行番红O染色和Mankin评分。分离大鼠原代软骨细胞进行培养，以不同浓度的FZT含药血清进行干预，采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)法测定FZT含药血清对软骨细胞增殖活力的影响，选取最佳浓度。将软骨细胞随机分为NC组、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)组、TNF-α+FZT组，TNF-α+FZT组以10%的FZT含药血清干预，其余组使用空白培养基处理，以实时定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)检测2型胶原(collgen type 2，Col2)、10型胶原(collgen type 10，Col10)、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP13)、带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶4(adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 4，Adamts4)、带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶5(adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，Adamts5)、卷曲关联蛋白(frizzled-related protein，FRZB)、Wnt、低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low density lipoprotein receptor related proteins 5/6，LRP5/6)、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)以及β-catenin的mRNA表达情况，Western blot检测Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β以及β-catenin的蛋白表达情况。[结果]疼痛行为学数据显示，模型组大鼠的热痛和压痛阈值显著低于正常组(P＜0.01，P＜0.01)，FZT低、中、高剂量组大鼠的热痛和压痛阈值较模型组显著提高(均P＜0.01)。Mankin病理评分表明，模型组评分较正常组显著增高(P＜0.01)，FZT组评分较模型组显著降低(均P＜0.01)，且具有剂量依赖效应。MTT结果提示FZT含药血清能显著提高软骨细胞增殖活力。Real-time qPCR结果显示，与TNF-α组比较，FZT含药血清干预显著下调Col10、MMP13、Adamts4、Adamts5、Wnt、LRP5/6、GSK-3β及β-catenin的表达(均P＜0.01)，同时上调Col2的表达(P＜0.01)。Western blot结果显示，与TNF-α组比较，TNF-α+FZT组Wnt、LRP5/6、FRZB、GSK-3β以及β-catenin的蛋白表达减少(均P＜0.01)。[结论]FZT能显著改善KOA大鼠的疼痛行为学指标，修复软骨损伤，其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路以及软骨细胞分解代谢有关。     

IL-1β和TNF-α对软骨细胞基质降解的影响及相关机制研究

目的研究白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对关节软骨细胞外基质降解的作用及相关分子机制。方法体外培养大鼠原代关节软骨细胞,单独或联合使用IL-1β和（或）TNF-α刺激软骨细胞,分别设为IL-1β刺激组、TNF-α刺激组、IL-1β和TNF-α联合刺激组;另设无任何刺激的对照组。在细胞培养24、48、72h时点,采用倒置显微镜观察软骨细胞外基质的变化;采用Real-TimePCR法检测基质金属蛋白酶-13（MMP-13）、蛋白聚糖降解酶-1（Adamts-4）和蛋白聚糖降解酶-2（Adamts-5）mRNA的表达。结果细胞在培养48、72h时点,显微镜观察显示对照组与TNF-α刺激组的软骨细胞外基质降解情况无明显差异;IL-1β刺激组、IL-1β和TNF-α联合刺激组细胞外基质失染、降解,细胞形态缩小,细胞间隙增宽。与对照组比较,细胞培养24h时点,IL-1β刺激组MMP-13、Adamts-4和Adamts-5mRNA的表达显著上调（P〈0.01）;而在培养48、72h时点有所下调。IL-1β和TNF-α联合刺激组与IL-1β刺激组比较,在培养各时点,MMP-13、Adamts-4和Adamts-5mRNA表达差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论 IL-1β诱导软骨细胞产生大量的MMP-13、Adamts-4和Adamts-5而直接降解软骨细胞外基质;TNF-α可能不直接引起软骨细胞外基质的降解。