靶向β-catenin的siRNA对宫颈癌细胞恶性表型的影响

目的探讨靶向β-链蛋白（β-eatenin）的小干扰RNA（siRNA）对宫颈癌细胞Hela细胞功能的影响以及相关作用机制。方法脂质体介导转染β-catenin小干扰RNA（β-cateninsiRNA）敲低Hela细胞β-catenln的表达。MTT法检测转染后细胞增殖水平,流式法评价转染后细胞周期分布及凋亡变化,并结合Western印迹研究β-catenin在Hela细胞中的作用机制。结果体外转染β-catenin小干扰RNA能明显抑制Hela细胞增殖,诱导其凋亡,并且能够明显下调Bcl-2及CyclinD1蛋白水平表达,上调Bax蛋白表达水平。结论β-cateninsiRNA能明品柳制Hela绅晌毕长．β-catPnin可作为宫颈癌基因治疗的靶点。     

熊果酸抑制人结肠癌HT-29细胞增殖并诱导凋亡的研究

目的探讨熊果酸对人结肠癌HT-29细胞的抗增殖和凋亡诱导作用。方法采用MTT法观察熊果酸对HT-29细胞增殖作用的影响;Hoechst 33258染色观察不同浓度熊果酸诱导的凋亡情况;流式细胞术检测熊果酸对细胞周期的影响。结果熊果酸对HT-29细胞具有明显的增殖抑制作用;20 mol/L、40 mol/L的熊果酸分别作用于HT-29细胞24 h后,较多细胞呈凋亡特征性改变;熊果酸可将HT-29细胞阻滞于G1期,随着熊果酸浓度的增加,细胞凋亡率也相应增加。结论熊果酸对HT-29细胞有较强的增殖抑制和诱导凋亡作用,其诱导凋亡的机制与熊果酸阻滞HT-29细胞的细胞周期有关。     

RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响

本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern blot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株。流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%)。MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p0.01和p0.05)。结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡。RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

β1整合素表达下调对人结肠癌细胞增殖和化疗敏感性影响

目的 观察β1整合素表达下调对人结肠癌HT-29细胞增殖和化疗敏感性的影响.方法 采用反义寡核苷酸（ASODN）技术转染HT-29细胞,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测β1整合素表达下调情况.MTT法检测HT-29细胞相对存活率.给予梯度浓度氟尿嘧啶（5-FU）,计算IC50.结果 实验组β1整合素条带吸光度积分（IAD）值/β-actin条带IAD值的比值及HT-29细胞的存活率与对照组相比显著降低（F=1 630.08,q=72.40,P〈0.01;t=4.37,P〈0.05）.5-FU＋ASODN组HT-29细胞对5-FU的IC50与5-FU组比较显著下降（t′=37.71,P〈0.05）.结论 β1整合素表达下调可抑制结肠癌细胞增殖,增强结肠癌细胞对化疗药物敏感性.     

FRAT1基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的构建FRAT1siRNA真核干涉表达载体pSINsi-FRAT1,并测序鉴定证实克隆正确。方法设计以FRAT1基因为靶标的RNAi序列和阴性对照片段序列,并克隆入载体pSINsi-hU6,用基因测序进行重组克隆验证。结果PCR检测证实siRNA插人pSINsi-hU6质粒,测序分析证实插入序列正确。结论成功构建FRAT1基因的RNAi载体,为研究FRAT1基因对结肠癌细胞增殖凋亡侵袭的影响提供了稳定转染的RNA干扰质粒。     

靶向沉默c-FLIPs基因表达对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响及机制

目的探讨抑制c-FLIPs基因表达对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法 RT-PCR及Western blot分别检测膀胱癌组织及细胞中c-FLIPs基因的表达;si-c-FLIPs转染人膀胱癌T24细胞,同时转染正常对照组(normal)和阴性对照组(si-control),48 h后Western blot检测c-FLIPs、Cleaved caspase 8、β-链蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白(Cyclin D1)蛋白表达;细胞计数试剂盒-8(CCK8)实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果膀胱癌组织及细胞中c-FLIPs基因的表达均显著高于癌旁组织(P0.01)。T24细胞中c-FLIPs基因的表达最高,选择作为研究对象;转染si-c-FLIPs后FLIPs的表达显著降低;si-c-FLIPs组细胞存活率及β-catenin和Cyclin D1蛋白表达显著低于normal组,细胞凋亡率及Cleaved caspase 8蛋白表达显著高于normal组(P0.01)。结论抑制膀胱癌中c-FLIPs基因表达可降低癌细胞的增殖及诱导细胞的凋亡,其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

抑癌基因PTEN在大肠癌中的功能及机制

目的研究抑癌基因第十号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)在大肠癌中的功能及作用机制。方法收集结肠癌细胞HT-29转染各组质粒后细胞,调整各组细胞悬液浓度至5×10~4cells/ml,设立实验组和对照组共5组,即过表达空载体组(转染NC-oe)、过表达组(转染PTEN-oe)、干扰空载体组(转染NC-sh)、干扰表达组(转染PTEN-sh)、空白对照组(不作任何处理)。qPCR检测PTEN基因在结肠癌细胞系样本中的含量;MTT检测PTEN对结肠癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测PTEN对结肠癌细胞周期和细胞凋亡的影响;PTEN重组子种植于裸鼠腋部背侧皮下成瘤部位,成瘤后定期测量裸鼠体重及瘤体大小。结果与空载体对照组和空白对照组比较,过表达组PTEN mRNA水平显著升高,干扰表达组PENT mRNA表达水平显著降低;过表达组细胞增殖速度减慢,干扰表达组细胞增殖速度加快;过表达组细胞周期S期细胞数量减少,干扰表达组细胞周期S期细胞数量明显增多;过表达组细胞凋亡率升高,干扰表达组细胞凋亡率降低;干扰组肿瘤生长迅速,提前使裸鼠致死,过表达组肿瘤生长缓慢。结论抑癌基因PTEN能够明显抑制大肠癌细胞增殖,抑制大肠癌细胞DNA合成,促进大肠癌细胞凋亡。增强PTEN基因可为临床瘤体内注射PTEN基因药物治疗提供新途径。     

siRNA干扰β-catenin基因表达情况与喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭的关系

目的探讨小干扰RNA(siRNA)干扰β-链蛋白(β-catenin)基因表达对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法前瞻性选取喉癌Hep-2细胞,随机分为空白对照组、阴性对照组和干扰组,其中干扰组转染靶向β-catenin的siRNA,阴性对照组转染空白siRNA。采用荧光定量PCR和Western-blot检测β-catenin mRNA和蛋白表达,MTT检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Transell法观察细胞侵袭能力。结果干扰组β-catenin mRNA和蛋白相对表达量分别为(0.304±0.015)和(0.234±0.065),明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰组培养48 h和72 h吸光值分别为(0.721±0.250)和(0.942±0.321),明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰组细胞凋亡率为(19.10±1.24)%,明显高于空白对照组和阴性对照组(P0.05);干扰组穿膜细胞数为(22.41±3.25)个,明显低于空白对照组和阴性对照组(P0.05)。结论干扰β-catenin基因,可抑制喉癌Hep-2细胞增殖和侵袭,促进细胞凋亡。     

Vpr抑制人大肠癌细胞株HT-29增殖及调节存活素表达的研究

目的观察I型人类免疫缺陷病毒蛋白R(Viral protein R、Vpr)在体外对大肠癌细胞HT-29增殖抑制及探索Vpr对HT-29细胞存活素(Survivin)表达的调节作用。方法应用腺病毒转染系统将Vpr基因以不同感染复数转染至HT-29细胞。MTT法检测Vpr对HT-29细胞的增殖抑制作用;流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡变化。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹(western blot)法检测mRNA水平和蛋白水平上Survivin的表达。结果实验组可见Vpr蛋白的表达;实验组大肠癌细胞HT-29增殖受到抑制(MOI=200),从转染72h开始,实验组MTT值与对照组及空载体组比较差异均具有有统计学意义(P0.05),随着时间的延长,抑制逐渐增强;转染72h后(MOI=200),实验组细胞凋亡率与对照组及空载体组比较均差异具有显著统计学意义(P0.01);实验组处于G2/M期细胞比例与对照组及空载体组比较均差异具有统计学意义(P0.05);转染72h后,实验组(MOI=50)Survivin基因的mRNA水平及蛋白表达水平与对照组及空载体组(MOI=200)比较均差异具有统计学意义(P0.05或P0.01),并且survivin的表达随着MOI的增加而减弱。结论 Vpr体外可以诱导细胞HT-29G2/M期阻滞及凋亡从而有效抑制细胞HT-29增殖,其机制可能与Vpr下调Survivin基因的表达有关。Vpr在大肠癌的治疗中具有潜在的应用前景。     

siRNA特异性抑制HEL细胞evi1基因的实验研究

本研究探讨小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）沉默人红白细胞白血病细胞（HEL）的evi1基因后对细胞evi1基因表达的抑制作用及细胞生物学特征变化及其作用机制。体外合成3条evi1基因特异性的siRNA（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3）并转染HEL细胞,并设对照。用四甲基偶氮唑蓝法评价细胞增殖抑制情况,半定量逆转录聚合酶链反应（semiquantitative RT-PCR）检测evi1基因mRNA的表达,台盼蓝染色试验测定细胞活性的变化,流式细胞术检测细胞周期变化和凋亡率。结果显示,细胞转染24、48、72小时后,以siRNA-1作用最强,转染后48小时抑制作用最明显。siRNA浓度为120nmol/L时,抑制率达到最大。转染48小时后siRNA-1对HEL细胞的增殖抑制率为（72.22±2.80）%,evi1-mRNA相对表达率为（27.31±1.11）%,HEL细胞活率为（26.05±2.49）%,与其他各组相比有显著性差异（p〈0.001）。siRNA可使细胞周期阻滞在G0/G1期,S期细胞明显减少,凋亡率明显增高（p〈0.01）。结论：evi1基因特异性siRNA可抑制HEL细胞增殖,使evi1-mRNA表达水平降低,细胞活性下降,HEL细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制细胞的有丝分裂,促进细胞凋亡。     

索拉非尼通过抑制WNT信号通路诱导白血病细胞株U937凋亡

本研究观察多激酶活性抑制药物索拉非尼对急性白血病细胞株U937细胞增殖活力的影响及诱导凋亡的作用,并探讨其可能的作用机制。以不同浓度的索拉非尼作用于U937细胞48小时后,使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞增殖活力变化;Annexin V/PI染色后通过流式细胞仪观察索拉非尼对U937细胞株的促凋亡作用;PI染色后利用流式细胞仪分析细胞周期中各期细胞比例变化;Western blot检测GSK-3β、β-catenin、Cyclin-D1蛋白表达变化。结果表明,同对照组相比较,索拉非尼以浓度依赖方式抑制U937细胞增殖,使细胞阻滞于G1/G0期并促进其凋亡(p<0.05)。Western blot检测结果显示,与索拉非尼处理前后相比,WNT通路中失活型GSK-3β蛋白、β-catenin及cyclinD1表达均下调,并呈现出浓度依赖性。使用GSK-3β抑制剂氯化锂上调失活型GSK-3β蛋白后仍得出同样趋势(p<0.05)。结论:索拉非尼通过减少WNT信号通路负向调节蛋白GSK-3β失活,进而下调β-catenin,cyclin-D1水平,使U937细胞阻滞于G1/G0期并促进其凋亡。     

干扰素-α联合高三尖杉酯碱对K562细胞增殖及β-catenin基因表达的影响

本研究探讨干扰素-α(IFN-α)联合高三尖杉酯碱(HHT)对K562细胞增殖、凋亡、细胞周期及β-环联蛋白(β-catenin)基因表达的影响。用IFN-α、HHT单药或两药联合处理后,K562细胞的增殖、凋亡、细胞周期及β-catenin mRNA表达水平分别用MTT法,流式细胞术及RT-PCR方法检测。结果显示,单用HHT能明显抑制K562细胞增殖,诱导凋亡,使细胞阻滞在G0/G1期,β-catenin表达下调,呈时间和剂量依赖性,而IFN-α无此作用。HHT组的β-catenin表达水平为0.5576±0.0373,低于空白对照组(0.9369±0.0142)。IFN-α联用HHT组β-catenin表达较单用HHT组下调更显著(0.3737±0.0529 vs 0.5576±0.0373,P<0.05)。HHT联合IFN-α对正常人骨髓单个核细胞未见明显毒性作用。结论:IFN-α联用HHT可明显增强后者的抗K562细胞作用,而β-catenin表达下调可能为其作用机制之一。     

熊果酸诱导结肠癌HT-29细胞凋亡与凋亡相关基因的关系

目的：体外实验探讨熊果酸诱导结肠癌HT-29细胞凋亡的可能性，揭示该凋亡发生与其相关基因之间的关系。方法：采用四甲基偶氮唑蓝比色、TUNEL法、流式细胞术检测熊果酸对结肠癌HT-29细胞的增殖抑制与杀伤作用；应用免疫组织化学SP法检测凋亡相关基因caspase-9、bcl-2、bax的表达。结果：熊果酸在体外对HT-29细胞有中度增殖抑制效应，在熊果酸作用下，HT-29细胞出现显著的细胞凋亡征象，TUNEL法显示细胞固缩，核染色质聚集或断裂，形成凋亡小体。流式细胞术检测在G1期之前出现sub-G1峰，凋亡率最高为11．63％，熊果酸的作用具有浓度和时间依赖性。在HT-29细胞凋亡过程中，凋亡相关基因caspase-9、bax的表达增强，bcl-2的表达减弱。结论：熊果酸在体外对结肠癌HT-29细胞有诱导凋亡作用，而caspase-9和bax的表达增强，bcl-2的表达减弱可能是其作用机制之一。     

辛伐他汀对人结肠癌细胞增殖的影响

目的体外观察辛伐他汀对人结肠癌HT-29、colo-320细胞增殖、细胞周期及环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）蛋白表达的影响。方法采用噻唑蓝（MTT）法观察辛伐他汀对结肠癌HT-29、colo-320细胞增殖的影响，流式细胞仪（FCM）研究辛伐他汀对细胞周期的作用，免疫细胞化学法观察辛伐他汀对COX-2蛋白表达的影响。结果体外辛伐他汀可抑制结肠癌HT-29（F=15．400，P〈0．001）、colo-320（F=5．162，P=0．004）细胞的增殖，辛伐他汀处理组内G0／G1期细胞增多，辛伐他汀可抑制结肠癌HT-29（F=5．699，P=0．002）、colo-320（F=7．214，P=0．001）细胞COX-2蛋白的表达。结论体外辛伐他汀对colo-320细胞增殖有抑制作用，该作用可能与其使细胞生长阻滞于G0／G1期及抑制COX-2蛋白表达有关。     

粉防己碱对人结肠癌细胞株HT-29增殖与凋亡的影响

目的:通过观察粉防己碱对人结肠癌细胞株HT-29增殖与凋亡的影响,初步探讨粉防己碱对结肠癌的体外抗肿瘤效应。方法:采用MTT比色法观察粉防己碱对HT-29细胞的增殖抑制效应,利用细胞DNA琼脂糖凝胶电泳及细胞凋亡荧光染色法检测粉防己碱诱导肿瘤细胞凋亡的作用,以免疫细胞化学法检测粉防己碱对Bcl-2和BAX表达水平的影响。结果:MTT比色法显示粉防己碱对人结肠癌细胞株HT-29增殖有抑制作用,其抑制效应具有剂量依赖的特点,细胞凋亡荧光染色法、琼脂糖凝胶电泳表明粉防己碱可诱导HT-29细胞凋亡,免疫细胞化学法显示粉防己碱上调BAX基因表达,下调Bcl-2基因表达。结论:粉防己碱对人结肠癌细胞株HT-29增殖的抑制效应具有剂量依赖性,并可诱导细胞凋亡,其抗肿瘤效应可能与凋亡相关基因表达的调控有关。     

苦参碱诱导多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡及其对细胞黏附分子表达的影响

为了探讨苦参碱诱导多发性骨髓瘤（MM）RPMI8226细胞凋亡及其对细胞黏附分子表达的影响,将苦参碱与RPMI8226细胞共培育,采用CCK-8法观察细胞生长,Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测细胞凋亡,PI单染色法检测细胞周期,双染色流式细胞仪检测细胞膜表面CD44、CD44v6、CD54和CD106的表达。结果表明,苦参碱对RPMI8226细胞具有明显的生长抑制作用,呈量效和时效关系;苦参碱能诱导RPMI8226细胞凋亡,其发生率随着药物浓度增加而增加;细胞周期分析显示G0/G1期细胞相对增多,S期相对减少,但G2/M期细胞数无明显改变;苦参碱作用于RPMI8226细胞48小时导致CD44和CD54表达减少,但CD44v6和CD106表达无明显改变。结论：苦参碱通过诱导凋亡和细胞周期阻滞抑制RPMI8226细胞的生长,同时降低CD44、CD54等细胞黏附分子表达。     

新型青蒿素衍生物SM1044诱导Kasumi-1细胞凋亡及机制的研究

本研究探讨新型水溶性青蒿素衍生物SM1044对人急性髓系白血病M2b细胞株Kasumi-1的诱导凋亡作用及其机制。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法观察SM1044对细胞生长的抑制作用;Annexin-Ⅴ/PI双标记流式细胞术、PI单标记流式细胞术分别检测细胞凋亡和细胞周期;Western blot检测加药处理后Kasumi-1细胞凋亡相关蛋白Caspase 3、PARP以及融合蛋白AML1-ETO的变化。结果显示:青蒿素衍生物SM1044可抑制Kasumi-1细胞的增殖,其抑制作用呈时间和剂量依赖性;1μmol/L SM1044作用24小时,生长抑制率达到50%,48小时的IC50值为0.17±0.067μmol/L;SM1044通过Caspase依赖的途径诱导Kasumi-1细胞凋亡,细胞凋亡率随药物浓度的增加而增加。细胞周期测定显示,SM1044阻滞细胞周期于G0/G1期,5μmol/LSM1044作用24小时使G0/G1期细胞由(58.33±4.46)%上升为(71.75±2.24)%;Western blot测定显示SM1044促使凋亡相关蛋白cCaspase 3(cleaved Caspase 3)、cPARP(cleaved PARP)表达水平增加,同时融合蛋白AML1-ETO表达降低。结论 :SM1044可有效抑制Kasumi-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,该过程与cCaspase 3、cPARP蛋白的表达上调有关。SM1044还能阻滞细胞周期,将Kasumi-1细胞阻滞在G0/G1期;同时SM1044能明显引起融合蛋白AML1-ETO的表达降低,可作为SM1044作用的胞内靶点。     

醋酸棉酚对人鼻咽癌细胞凋亡的影响及其作用机制探讨

目的:研究醋酸棉酚(gossypol acetic acid,GAA)对人鼻咽癌细胞系CNE2体外增殖的影响,初步探讨其作用机制。方法:采用MTT法检测GAA对CNE2细胞的增殖抑制作用,Hoechst 33342/PI荧光染色观察细胞核的形态变化,流式细胞仪分析细胞周期的分布、凋亡率以及凋亡相关基因蛋白的表达情况。结果:GAA对CNE2细胞具有显著的增殖抑制作用并且呈剂量、时间依赖性,Hoechst 33342/PI荧光染色可观察到明显核固缩、染色质凝集等细胞凋亡现象;流式细胞仪检测发现细胞被阻滞于G0/G1期,G2/M期和S期细胞相对减少并出现典型的"亚二倍体峰",凋亡相关基因Bcl-2表达下调,而Bax表达则相对上调。结论:GAA能够抑制人鼻咽癌细胞系CNE2的增殖,促进其凋亡,其作用机制可能是通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax而实现的。