人脐带间充质干细胞向神经细胞分化的研究

目的研究人脐带分离的间充质干细胞向神经细胞分化的可能性。方法将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小块培养,得到贴壁细胞;经传代培养、细胞周期分析、流式细胞检测后,再以不同方案诱导向其神经细胞分化,并以免疫荧光和RT-PCR方法进行鉴定。结果培养5～7 d后,有细胞从组织块中游出。细胞传代培养达23代后无明显的形态和增殖能力改变。细胞周期分析表明,80％以上的细胞都处于G0～G1期。流式细胞检测表明,这些细胞表达CD13、CD29、CD44、CD90、CD105和CD166等MSCs标志物。经神经分化诱导后,部分细胞呈现出与神经元或神经胶质细胞类似的形态。免疫荧光检测表明,第二神经分化诱导方案优于第一方案,其NSE和MBP阳性细胞分别达80．8％±3．9％、4.2％±1．3％,但未能见到GFAP阳性细胞。RT-PCR进一步证实了这些神经标志物的表达。结论人脐带间充质干细胞具有向神经细胞分化的潜能,可作为神经系统疾病细胞移植治疗的备选来源。     

密度梯度离心法体外培养骨髓间充质干细胞的分化能力

背景：骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,是目前极具潜力的种子细胞及基因治疗的靶细胞。 目的：体外培养兔骨髓来源间充质干细胞,了解其生物学特性。 方法：采用密度梯度离心法培养兔骨髓间充质干细胞,对细胞的形态及生长特性进行观察,应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD44、CD45、CD166、HLA-DR表达,并进行相关生物学特性鉴定。 结果与结论：密度梯度离心法能分离培养出纯度较高的骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表达CD29、CD44、CD166,不表达CD34、CD45、HLA-DR。在适当的条件下能够诱导分化成为成骨细胞、软骨细胞等。     

HO-1修饰的大鼠骨髓间充质干细胞在体外对淋巴细胞的影响北大核心CSCD

目的：探讨血红素加氧酶1（HO-1）修饰的大鼠骨髓间充质干细胞（BM MSCs）在体外对淋巴细胞的免疫调节作用。方法体外分离培养和鉴定BM MSCs ,用载有HO-1基因的重组腺病毒载体进行感染,形成HO-1/BM MSCs,与大鼠脾淋巴细胞共培养。 MTT法检测淋巴细胞的增殖活性,碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞周期的分布情况,ELISA法检测细胞因子含量,流式细胞仪分析T淋巴细胞CD25、CD71的表达。结果 HO-1/BM MSCs参与共培养的淋巴细胞的增殖活性和细胞周期进程均被抑制、促炎因子（ IL-2、TNF-α和IFN-γ）的分泌量降低、抗炎因子（ IL-10）的分泌量升高、T淋巴细胞CD25和CD71的表达降低,与BM MSCs组相比差异有统计学意义。结论 HO-1/BM MSCs较BM MSCs能够更好地发挥对淋巴细胞的免疫调节作用。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的实验研究

目的探讨体外诱导骨髓间充质干细胞分化为血管内皮细胞的可行性。方法分离培养骨髓间充质干细胞，鉴定其表面抗原，用含2％胎牛血清以及50ng／ml血管内皮生长因子的条件培养基诱导，诱导后细胞通过内皮细胞标志物KDR、FLT-1以及v-WF染色鉴定。结果骨髓间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性，CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱导后细胞形态明显改变，内皮细胞标志物KDR、FLT-1以及v-wF染色结果阳性。结论骨髓间充质干细胞在体外具有分化为血管内皮细胞的能力，可以作为干细胞治疗的一种有效来源。     

胎盘源间充质干细胞对T淋巴细胞体外增殖的影响

目的从人胎盘组织中分离培养获得间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）,并进一步研究其对T淋巴细胞体外增殖的影响。方法首先从胎盘组织中分离培养胎盘间充质干细胞（PMSCs）,在体外观测其形态,并通过细胞表面抗原表达、分化潜能等特征进行鉴定;然后将体外分离培养扩增的PMSCs,按照不同比例加入双向混合淋巴细胞培养体系（mixed lymphocyte reaction,MLR）中,共同培养6d后,测定T淋巴细胞的增殖。结果从人胎盘组织中分离培养获得问充质干细胞,具有与骨髓间充质于细胞（BMSCs）极为相似的细胞形态及细胞表面标志,表达CD29、CD44和CD105,不表达CD34、CD45、CD106和HLA—DR,并且还具有与BMSCs相似的跨胚层分化能力,能在一定条件下被诱导分化出神经元样细胞。PMSCs与同种异体混合淋巴细胞共同培养能抑制T淋巴细胞的体外增殖。结论胎盘组织是MSCs的有效来源,PMSCs具有与BMSCs相似的生物学特性及免疫调节机制。它为问充质干细胞的研究提供了又一重要的细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞基因表达谱的芯片分析

目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）作为组织工程种子细胞的分子遗传学基础和临床应用价值。方法：通过密度梯度离心法和贴壁筛选法的联合应用，分离人骨髓间充质干细胞，流式细胞仪分析细胞同源性，UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提法获取足量的RNA，用于MSCs基因表达谱的分析研究。结果：流式细胞仪检测表明了所分离hMSCs的高度同源性，基因表达谱芯片分析首次揭示了MSCs表达多种间充质细胞和非间充质细胞的特异性mRNA，如脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞、成肌细胞、造血支持基质、神经元、神经胶质细胞和上皮／内皮细胞等。结论：hMSCs具有高度可塑性和广泛分化潜能，是以干细胞工程为代表的现代组织工程的重要细胞来源。     

恒河猴骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)的细胞生物学特性。方法 免疫细胞化学检测细胞ALPase、Vimentin和Laminin活性。流式细胞术测定细胞周期和细胞表面抗原。MTT法测定细胞的生长曲线。原位杂交检测细胞端粒酶活性。结果 MSCs ALPase和Laminin呈阴性，Vimentin呈阳性。细胞周期中G1、S、G2期的细胞所占百分比分别为89．5％、7．8％、7．7％；MSCs具有独特的表现特征，即CD166、CD29、CD44、CD105表达呈强阳性，阳性率高达96．7％以上，而CD34和HLA-DR呈阴性表达。细胞的平均倍增时间为32h。细胞端粒酶活性呈阳性反应。结论 培养的细胞为未分化的骨髓间充质于细胞，而不是造血于细胞和成纤维细胞，且细胞具有较强的增殖能力。     

隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的： 体外培养猴骨髓间质干细胞（MSCs）并定向诱导分化为神经元样细胞。 方法： 体外分离培养猴MSCs，流式细胞仪检测其表面标志，用含隐丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞，免疫细胞化学检测单克隆抗体特异性神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。 结果： 体外培养的猴MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166，并且具有正常的二倍体核型，不随传代而发生改变。bFGF预诱导24 h 后，隐丹参酮可以将MSCs诱导为神经元样细胞，免疫细胞化学显示NSE、NF表达阳性，阳性率分别为68.3％±3.5％、70.3％±1.5％，而GFAP表达阴性。 结论： 隐丹参酮可以在体外将猴MSCs诱导分化为神经元样细胞。     

致敏小鼠骨髓间充质干细胞体外培养及多向分化功能的测定

目的：评价异基因脾细胞输注致敏的小鼠骨髓源性间充质干细胞(MSCs)的体外培养生长能力及其多向分化功能。方法：应用贴壁培养法体外培养间充质干细胞,流式检测其表面标志以及检测其成骨、成脂和成肌多向分化状况;结果：致敏小鼠骨髓源性MSCs与非致敏小鼠骨髓源性MSCs比较,形态学无差异且均表达CD29+、CD105+、CD44+和Sca-1+ ;CD34-、CD11b-;同时在相应的诱导条件下具有向成骨、成脂、成肌多向分化的能力。结论：异基因脾细胞输注致敏的小鼠,其骨髓源性MSCs的形态学和功能与正常小鼠的MSCs比较评估未见异常。     

依达拉奉体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的 采用密度梯度离心和差速贴壁法体外分离、培养、纯化及鉴定成年Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,利用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和依达拉奉联合诱导MSCs定向分化为神经元样细胞。 方法 选用1月龄健康雄性Wistar大鼠,采用Percoll分离液密度梯度离心法获取骨髓中的MSCs,通过差速贴壁法反复传代培养、纯化,取第3代细胞采用流式细胞术、免疫细胞化学等方法检测MSCs的纯度,利用bFGF联合依达拉奉诱导MSCs向神经元样细胞分化,并通过扫描电镜、免疫细胞化学等对诱导后的细胞进行鉴定。结果 第3代MSCs经免疫细胞化学及流式细胞仪等检测,间充质干细胞特异性的标记物CD44表达阳性,不表达造血干细胞及白细胞的特异性标记物CD34、CD45,MSCs纯度高达955%。诱导分化后扫描电镜检测可观察到典型的神经元样细胞结构;免疫细胞化学检测发现,细胞表达神经元特异性烯醇化酶（NSE）,不表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）,Nestin的表达随着细胞成熟而减弱。 结论 密度梯度离心和差速贴壁法可获得高纯度的MSCs;依达拉奉能高效地定向诱导MSCs分化为神经元样细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨生长因子在体外能否诱导大鼠骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSC）向心肌样细胞分化,是否增强其旁分泌作用.方法 取4周龄雄性SD大鼠骨髓,贴壁法培养BM-MSC至第3代时,应用流式细胞仪检测其表面标志物CD29、CD44、CD105、CD34、CD45、CD31.将细胞随机分为间充质干细胞组（MSC组）和生长因子共培养组（GF-MSC组）.MSC组继续培养传代;GF-MSC组与生长因子[其中包括培养基（IMDM）、2％胎牛血清（FBS）、20 nmol/L地塞米松、100μmo1/L维生素C（VitC）、50 μg/L成纤维细胞生长因子2（FGF-2）、10 μg/L成骨蛋白2（BMP-2）、2μg/L胰岛素样生长因子1（IGF-1）、青霉素和100 mg/L链霉素]共培养.1周后细胞免疫荧光染色检测两组细胞肌钙蛋白Ⅰ（TnⅠ）和结蛋白（Des）表达;反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组细胞Tn Ⅰ和Des mRNA的表达;ELISA法检测两组细胞裂解液以及细胞培养上清中的肝细胞生长因子（HGF）和血管内皮生长因子（VEGF）的蛋白水平.结果 体外培养的BM-MSC表达CD29、CD44、CD105,而不表达CD31、CD34、CD45.免疫荧光染色显示GF-MSC阳性表达TnⅠ和Des.RT-PCR结果显示TnⅠ和Des mRNA在GF-MSC有阳性表达,而MSC为阴性表达.GF-MSC组HGF、VEGF在细胞裂解液和细胞培养上清中的蛋白水平（ng/L）高于MSC组（HGF裂解液32.05±0.41比12.10±0.21,培养上清574.21±4.19比169.16±2.41;VEGF裂解液45.66±2.22比30.37±0.54,培养上清487.78±36.29比44.25±1.31;均P＜0.05）.结论 体外与生长因子共培养,可诱导BM-MSC向心肌样细胞分化,并增强其旁分泌作用.     

低氧对人脐带间充质干细胞生物学特性及增殖的影响简

目的探讨低氧培养条件对人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）的生长和增殖的影响。方法采用人脐带酶消化法分离培养hUC-MSCs,分别将细胞置人体积分数20％、10％、3％0,条件下培养,通过细胞成脂、成骨分化诱导及流式细胞仪检测其表面标志物.鉴定hUC-MSCs：绘制细胞生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况。结果低氧条件培养hUC-MSCs具有成脂、成骨等多项分化的潜能：流式细胞仪检测呈CD105、CD73、CD90、CD44、HLA-ABC高表达,CDl06、CD29、CD45、CD34、HLA-DR低表达;体积分数3％O2培养组与正常体积分数20％O2培养组及体积分数10％0,培养组相比（各组倍增时间分别为17.2h、20.8h、18.9h）,细胞增殖速度加快（P〈0.05）;G0/G1期细胞减少（各组G0／G1期细胞数分别为77.11％±3.89％、83.92％±5.59％、80.19％±5.16％）,S期细胞增多（S期细胞数分别为15.73％±2.56％、10.91％±1.86％、13.31％-4-2.31％）,增殖指数升高（P〈0.05）;细胞凋亡率降低（流式细胞仪检测各组凋亡率分别为13.41％±1.39％、20.83％±1.81％、19.11％±2.44％）（P〈0.05）。结论体积分数3％O：持续培养可促进hUC-MSCs的增殖.减少细胞凋亡。     

Nanog蛋白在CD73+小鼠脂肪源间充质干细胞中的表达

目的 探讨Nanog蛋白在小鼠脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)中的表达规律.方法 体外分离培养ADMSCs,利用流式细胞仪从ADMSCs中分选出CD73+和CD73 -两个细胞亚群.体外分别培养两组细胞,用免疫细胞化学和免疫荧光测定两组细胞Nanog蛋白的表达,并比较其差异.结果 CD73+ ADMSCs细胞约占总细胞的5％,形态上分为大细胞和小细胞.Nanog蛋白在CD73+ ADMSCs细胞中强阳性表达率(16.85±6.83)％,弱阳性表达率(81.78 ±7.19)％,阴性表达率(1.63±3.59)％;nanog蛋白在CD73 - ADMSCs细胞中强阳性表达率(5.74±2.79)％,弱阳性表达率(85.84 +37.31)％,阴性表达率(8.42±4.12)％.在Nanog阳性表达的细胞中可见不同分裂时相的有丝分裂细胞,CD73+细胞的分裂象明显多于CD73 -细胞.结论 CD73和Nanog可能均是ADMSCs特异性表达的标志,Nanog蛋白强阳性的细胞可能更具幼稚性.通常采用分离培养方法获得的ADMSCs是多种细胞的复合物.     

Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, cartilage, and adipose tissue

Mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from bone marrow (BM), cartilage, and adipose tissue (AT) possess the capacity for self-renewal and the potential for multilineage differentiation, and are therefore perceived as attractive sources of stem cells for cell therapy. However, MSCs from these different sources have different characteristics. We compared MSCs of adult Sprague Dawley rats derived from these three sources in terms of their immunophenotypic characterization, proliferation capacity, differentiation ability, expression of angiogenic cytokines, and anti-apoptotic ability. According to growth curve, cell cycle, and telomerase activity analyses, MSCs derived from adipose tissue (AT-MSCs) possess the highest proliferation potential, followed by MSCs derived from BM and cartilage (BM-MSCs and C-MSCs). In terms of multilineage differentiation, MSCs from all three sources displayed osteogenic, adipogenic, and chondrogenic differentiation potential. The result of realtime RT-PCR indicated that these cells all expressed angiogenic cytokines, with some differences in expression level. Flow cytometry and MTT analysis showed that C-MSCs possess the highest resistance toward hydrogen peroxide -induced apoptosis, while AT-MSCs exhibited high tolerance to serum deprivation-induced apoptosis. Both AT and cartilage are attractive alternatives to BM as sources for isolating MSCs, but these differences must be considered when choosing a stem cell source for clinical application.     

慢病毒介导GDNF基因对食蟹猴骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

 目的 探讨慢病毒介导胶质源性神经营养因子（GDNF）对食蟹猴骨髓间充质干细胞（cMSCs）生物学特性的影响。方法 无菌条件下取食蟹猴骨髓,梯度密度离心法分离培养cMSCs,含有GDNF基因的慢病毒感染cMSCs。利用ELISA、Real-time PCR、流式细胞术（FCM）、BrdU掺入法等实验方法,观察慢病毒感染后GDNF基因的表达,以及慢病毒感染前后的cMSCs的表面抗原表达、体外增殖和分化能力。结果 感染慢病毒后,体外培养的cMSCs高表达GDNF。慢病毒感染后cMSCs的细胞形态无明显改变,细胞表面标志CD34、CD90和Stro-1阳性细胞比例增高。BrdU掺入结果显示,与对照组（0.61±0.11）比较,GDNF慢病毒感染组（0.50±0.13）明显降低（P＜0.05）。但GDNF慢病毒感染并没有影响cMSCs体外脂肪诱导分化能力。结论 慢病毒感染影响cMSCs的表面抗原表达和体外增殖能力,但对cMSCs体外脂肪分化能力无影响。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及血管内皮生长因子对其体外诱导分化作用

目的：分离和培养人骨髓间充质干细胞(mcsenchymal stem cells，MSCs)并检测其免疫学表型，探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VECF)对其体外诱导分化作用。方法：利用Pcreoll梯度分离、贴壁筛选法及单克隆培养法分离、培养、扩增MSCs；采用免疫荧光和流式细胞术检测MSCs免疫学表型；通过VFGF-165基因转染分析MSCs的表型变化。结果：体外分离、培养出高度同源性的MSCs；MSCs具有独特的细胞免疫学表型，即CD44，CD29，c-kit阳性，CD34，CD31，CD54阴性；VEGF-165诱导后CD44表达明显降低，CD31显著升高，MSCs向内皮分化。结论：成功建立人MSCs分离培养方法，探讨了MSCs细胞免疫学表型及VEGF对它的内皮诱导分化作用，为MSCs的应用提供理论基础。     

小鼠脂肪源和骨髓源间充质干细胞表面标记表达的比较

目的探讨小鼠脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)和骨髓源间充质干细胞(BMSCs)表面标记表达的差异。方法分别对小鼠脂肪源和骨髓源间充质干细胞进行成骨、成脂、成心肌分化诱导、鉴定;流式细胞术与细胞免疫荧光法检测CD29、CD44、CD45和CD73的表达并进行比较。结果 BMSCs形态均一,呈长梭形;ADMSCs形态多样,呈梭形、星形、多角形等,胞体较大,表面分泌物较多;两者均可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞和心肌样细胞。流式细胞术检测显示,BMSCs表面分子CD29、CD44和CD73表达率分别为(83.43±1.97)%、(90.33±0.81)%、(2.63±0.42)%;ADMSCs表面分子CD29和CD44的表达率分别为(53.1±1.05)%、(34.8±2.1)%,CD73表达不稳定,在1.8%~19.7%之间波动。两种细胞均不表达造血干细胞标记物CD45。免疫荧光显示,CD73分子与部分CD29、CD44阳性细胞共表达。结论小鼠BMSCs和ADMSCs均具有成脂、成骨、成心肌分化能力,但是在形态上和分子表达上均存在差异。BMSCs的CD44和CD29表达高于ADMSCs;而CD73的表达则相反,CD73在两种细胞的表达均较低,在ADMSCs的表达不稳定。     

正常与糖尿病小鼠脂肪间充质干细胞移植促进皮肤创伤愈合的比较

目的比较正常和糖尿病小鼠脂肪间充质干细胞(Adipose mesenchymal stem cells,ADSCs)移植促进皮肤创伤愈合疗效差别。方法无菌条件下获取正常小鼠及糖尿病小鼠的ADSCs,应用流式细胞术对3代细胞表面抗原CD34、CD45、CD90、CD105进行表型鉴定。应用WST法和Transwell迁移实验检测细胞增殖和迁移情况。应用ELISA对正常小鼠及糖尿病小鼠的ADSCs条件培养液中VEGF、HGF和IGF-1蛋白含量进行检测。建立小鼠皮肤创伤模型并随机分为3组,分别以皮内注射方式将3代正常小鼠或糖尿病小鼠来源ADSCs的细胞混悬液移植到小鼠创面四周,空白对照组注射生理盐水,于伤后14d观察创面愈合情况;Western blot检测伤后14d创面组织Bcl-2蛋白表达。结果小鼠ADSCs表达CD90和CD105,不表达CD34和CD45,与正常小鼠相比,糖尿病小鼠来源的ADSCs增殖和迁移能力下降,条件培养液中VEGF、HGF和IGF-1蛋白含量明显降低。糖尿病小鼠ADSCs移植组于创伤后第14d伤口愈合率为(79.6%±6.2%),均显著低于正常小鼠移植组14d的(97.1%±4.1%),两者均高于对照组14d的(64.6%±2.9%,0.05)。与正常小鼠移植组相比,糖尿病小鼠移植组伤后14d创面组织Bcl-2表达水平降低,高于对照组创面组织Bcl-2表达水平。结论正常小鼠来源ADSCs较糖尿病小鼠ADSCs更能促进小鼠皮肤创面愈合。