手足口病肠道病毒检测中两种核酸提取方法的比较

目的对手工核酸提取法和全自动核酸提取仪法在手足口肠道病毒RNA荧光定量PCR检测中提取效率、重复性、耗时和成本进行比较。方法手工法试剂盒和全自动核酸提取仪对样本进行核酸提取,采用实时荧光定量PCR进行评价。结果提取仪法阳性46例,试剂盒法阳性43例,二者无明显差异（P〉0．05）。提取仪法重复性高于试剂盒法（CV3．5％〈5％）。核酸液终体积：提取仪法70μL,试剂盒法50μL。提取仪法耗时较短,成本较高;试剂盒法耗时较长,成本较低。结论两种方法结果无显著差异,均能满足临床需要,核酸提取仪法更具优势。     

小鼠组织总RNA制备方法及样本储存时间对qRT-PCR影响的探讨

目的 探讨适合现代医学实验室的高效组织总RNA提取方法,以及组织样本储存时间对后续实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测有效性的影响。方法 分别采用全自动样本处理器+磁珠法全自动核酸提取(方法1)、全自动样本处理器+离心柱法(方法2)、手工匀浆器+磁珠法全自动核酸提取(方法3)和手工匀浆器+离心柱法(方法4)4种方法制备小鼠新鲜心、肝、肾组织总RNA,比较各方法制备的总RNA质量。评价方法1和方法4制备的新鲜、-80℃储存1年和2年的小鼠肝组织总RNA质量及其对qRT-PCR检测结果的影响。结果 方法1制备的小鼠新鲜组织总RNA浓度、完整性均优于其他3种方法。方法1制备的1年和2年肝组织总RNA完整性均明显优于方法4。3个不同储存时间肝组织样本的Ct值范围分别为18～19、21～22和27～28,2年肝组织样本总RNA降解明显。结论 方法1是最佳的组织总RNA制备方法,尤其针对保存2年内的稀有生物样本。用于qRT-PCR检测的生物样本于-80℃储存时间最好不超过1年。     

3种核酸提取方法检测甲型H1N1流感病毒的比较

目的选择常见的3种核酸提取方法,比较其对低拷贝数甲型H1N1流感病毒核酸检测的敏感性差异,为实验室应用和结果的评价提供依据。方法对已确定阳性的甲型H1N1流感病毒标本,作10^-1～10^-4系列稀释,选用Promega公司全自动核酸提取仪及配套试剂盒、QIAGEN公司Rneasy Mini Kit和国产H公司提取试剂盒3种核酸提取方法提取上述标本核酸模板,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（荧光RT—PCR）对其进行评价。结果在对不同拷贝数流感病毒的检测中,3种核酸提取方法以Promega公司全自动核酸提取仪提取效率最高,以此提取效率作为100％,则QIAGEN Rneasy Mini Kit和国产H公司提取试剂盒的平均提取效率依次为83．27％、55．70％。经方差分析,3种方法之间存在显著性差异（P〈0．05）。结论各试剂之间提取核酸的效率存在显著差异,建议根据实际情况采用合适的核酸提取试剂和方法。     

两种HCV RNA荧光定量试剂盒检测丙型肝炎病毒的比较分析

目的 比较分析两种丙型肝炎病毒（HCV）核酸定量检测试剂盒的临床性能.方法 随机抽取63例临床血清样本进行平行检测,分别采用HCV磁珠法试剂和对照试剂检测血清中RNA水平.结果 对照试剂检测63例临床样本中有22例阳性,41例阴性;磁珠法试剂检测63例样本中有27例阳性,36例阴性,两种试剂的阳性样本具较好的一致性（P=0.000）,磁珠法试剂与对照试剂的定量检测结果具有线性相关性（r=0.935,P＜0.05）.结论 两种试剂都可以应用于HCV临床检测,磁珠法试剂具有更高的灵敏度,是一种比较理想的HCV RNA定量检测试剂.     

HCV RNA定量检测试剂的临床应用

目的:探讨HCV RNA定量检测试剂的临床应用效果。方法:通过和市场上广泛使用的柱提取试剂比实验,对一种丙型肝炎病毒磁珠法核酸提取荧光定量PCR检测试剂的临床使用进行评估。结果:①浓度在5.00E+03～5.00E+06 IU/mL的样本,两种试剂的定量结果与理论靶值均具有很好的对应性,具有较好的重复性和精密度;对于1.00E+03IU/mL以下的样本,磁珠法的定量结果重复性好,定量准确;而柱提取法大部分均未能检出。②对于2种方法检测的339例临床样本,中高病毒载量组柱提取法检测>5.00E+02IU/mL有147例,两种试剂定量结果基本一致,相关性r为0.9413。3 339例临床血清样本中5例样本磁珠法检测为阳性,而柱提取法检测为阴性,P<0.01,二者有显著性差异。这5例样本,丙肝肝炎抗体检测均为阳性。结论:①对于中高病毒载量的样本,两种试剂均具有良好的检测效果;②磁珠法对比柱提取法在低病毒载量区域,灵敏度更高,同时操作相对简单,不易出现污染与脱靶,具有较高的临床应用价值。     

不同核酸提取方法检测HIV病毒载量和耐药基因的研究

目的比较5种核酸提取法提取HIV RNA的效率。方法收集2015年HIV病毒感染者血样,使用不同核酸提取方法平行检测Ct值及载量值,分析检测的检出率、敏感性、变异系数、稳定性,并进行耐药扩增。结果 5种提核酸方法检出率国产磁珠法最高,5种方法差异无统计学意义(χ2=7.98,P=0.09);Ct值从小到大顺序为:国产磁珠法≥离心柱法大批量法≥进口磁珠法试剂盒自带法;重复性比较表明国产磁珠法检测结果较稳定;核酸胶显示国产磁珠法提取RNA浓度最高;提取方法不影响耐药关键位点检测。结论 5种核酸提取方法均能检测HIV信息,国产磁珠法提取病毒核酸进行检测,敏感性和稳定性均较高。     

全自动核酸提纯及实时荧光PCR系统的性能验证与评价

目的 评估全自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统检测新型冠状病毒核酸的性能。方法 根据新型冠状病毒感染防控方案,研究购自上海生工的全自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统、2019-nCoV试剂盒、不同浓度的新型冠状病毒核酸检测标准品,对样品的阴阳性符合率、精密性、变异系数、最低检出限、重复性、检测时长等指标进行检测,并根据检测结果验证、评估自动核酸提取纯化及实时荧光PCR分析系统性能。结果 样本的阴、阳性符合率均为100.00%,精密性阳性符合率均为100.00%,变异系数(coefficient of variation,CV)为≤5.00%,最低检出限循环阈值(cycle threshold, Ct)<43.00,阳性检出率为100.00%,重复性阴、阳性符合率均为100.00%,设备检测时长2h以内。结论 根据本研究结果,该系统特异性强、重复性好,同时最低检出限和精密性均符合现场使用要求,可有效降低操作风险,且检测时长较传统PCR短,可大规模适用于口岸一线。     

新型冠状病毒核酸RT-PCR试验浅析

目的:规范实时荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸的工作程序,保证实验结果的正确可靠。方法:采用磁珠法提取核酸,荧光PCR扩增仪定性,对不同批次的盲样考核、人咽拭子和冷链食品及环境样本在不同的时间段内进行检测,获取实验结果。结果:盲样考核样本32份,其中3通道(FAM、HEX、ROX/IC)阳性样本5份,双通道(FAM、HEX)阳性样本19份,单通道(FAM或HEX)阳性样本1份,阴性样本3份,无靶标基因样本4份;人咽拭子样本25 496份阴性,冷链食品和环境样本558份阴性。经核对,结果全部正确。结论:荧光RT-PCR试验,能够在基层实验室中开展新型冠状病毒核酸检测推广应用。     

全自动检测麝香草酚浊度试验方法的建立

目的　在全自动生化分析仪上建立检测麝香草酚浊度的方法。方法　利用常规使用的试剂通过程序设置在全自动生化分析仪上检测麝香草酚浊度 ,并与传统的手工方法进行比较。结果　在全自动生化分析仪上获得的标准曲线线性良好 (K =13 3 ,S1ABS =6,r =0 .9994) ,线性范围是 0 -4 0U ;测得的麝香草酚浊度结果与传统的手工方法所得结果差异无显著性 (t=0 .80 8,0 .5 0 >P >0 .2 0 ) ,且相关性良好 (r =0 .977)。结论　可以在全自动生化分析仪上进行麝香草酚浊度测定。     

TRIzol法与磁珠法用于丙型肝炎病毒RNA定量检测的比较

目的 比较不同核酸提取方法TRIzol法与磁珠法对丙型肝炎病毒核酸（HCV RNA）定量检测结果的影响。 方法 收集117例丙型肝炎病毒感染阳性患者的血清及其基因分型信息。分别采用TRIzol法与磁珠法提取患者血清样本的HCV RNA,定量PCR检测提取HCV RNA的病毒载量,比较两种提取方法HCV RNA检测结果的差异性。 结果 定量PCR检测结果显示TRIzol法和磁珠法具有良好的线性相关性：y=0.978x+0.063（R2=0.973）。Bland-Altman统计分析显示TRIzol法的检测平均值略低于磁珠法,但无明显统计学差异（P>0.05）. 基因型分析显示1b、2a、3a和6a 亚型之间无显著性差异（P>0.05）.结论TRIzol提取法的HCV定量检测结果和磁珠法相当,且标本用量更少,成本低廉,可在国内广泛使用,且能更大范围地应用在试剂盒的开发和HCV RNA临床检测中。     

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)核酸检测试剂盒临床诊断效能评估

目的: 了解三种严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）核酸检测试剂盒的检测效果及临床诊断效能。方法: 采集40例临床诊断为2019冠状病毒病（COVID-19）和16例非COVID-19住院患者的咽拭子样本。采用湖南圣湘生物科技有限公司（以下简称“圣湘公司”）、硕世生物科技股份有限公司（以下简称“硕世公司”）、深圳华大基因股份有限公司（以下简称“华大基因”）SARS-CoV-2核酸RT-PCR检测试剂盒检测上述样本并分析其敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值。比较一步裂解法和磁珠法、两种不同核酸提取仪（圣湘公司Natch CS S12C全自动核酸提取系统和西安天隆科技有限公司NP968-C核酸提取仪）磁珠法提取咽拭子样本中病毒核酸的效果及其RT-PCR检测结果的阳性符合率、阴性符合率、总符合率及Kappa值。结果: 圣湘公司试剂盒检测SARS-CoV-2核酸的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和Kappa值分别为95.00%、87.50%、95.00%、87.50%和0.825,硕世公司试剂盒分别为90.00%、87.50%、94.74%、77.78%和0.747,华大基因试剂盒分别为82.50%、81.25%、91.67%、65.00%和0.593。一步裂解法和磁珠法提取的病毒核酸检测结果阳性符合率、阴性符合率、总符合率和Kappa值分别为95.24%、100.00%、96.43%、0.909,但一步裂解法仅耗时25 min,而磁珠法需180 min。两种不同核酸提取仪磁珠法提取的RNA检测结果阳性符合率、阴性符合率、总符合率和Kappa值分别为85.00%、100.00%、89.29%和0.764。结论: 圣湘公司试剂盒检测SARS-CoV-2核酸效果略优于其他两家公司试剂盒。一步裂解法提取咽拭子样本中总RNA具有操作简单、省时和检测结果符合率较高的优点。     

麻疹患儿粪便麻疹病毒核酸的检测及临床意义

目的：探讨麻疹患儿肠道排毒情况和粪便病毒核酸快速检测的临床意义。方法38例临床诊断麻疹患儿,入院时均有发热、皮疹等麻疹感染症状。在入院2d内同时采集咽拭子和粪便标本。标本在冷链条件下送传染病诊治国家重点实验室,采用RT- PCR法检测麻疹病毒核酸及Ct值。同时对部分咽拭子和粪便标本扩增均阳性的PCR产物进行基因测序。结果38例患儿粪便麻疹病毒核酸阳性37例,占97.4%,Ct值23.8±3.04;咽拭子病毒核酸阳性35例,占92.1%,Ct值28.0±4.0。两者阳性率比较,差异无统计学意义（χ^2=0.029,P＞0.05）;两组Ct值比较,差异有统计学意义（t=5.23,P＜0.05）。3例患儿咽拭子和粪便标本的麻疹病毒基因型（均为H1a基因亚型）和核苷酸序列完全一致。结论粪便病毒核酸快速检测与咽拭子标本具有相同的临床诊断价值,粪便病毒核酸拷贝数高于咽拭子病毒核酸,且粪便标本的采集具有方便、无痛苦,依从性好,不易受人为因素的影响,值得推广。     

新型EB病毒全自动核酸定量检测系统在儿童传染性单核细胞增多症快速诊断中的价值

  目的  对新型EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)全自动核酸定量检测系统进行性能验证,并探讨该系统在儿童传染性单核细胞增多症(IM)快速诊断中的价值。  方法  EBV全自动核酸定量检测系统包括核酸提取和实时荧光PCR(FQ-PCR)定量检测,分别采用PANA9600S全自动旋转式核酸工作站进行全血标本的核酸提取,ABI7500荧光PCR仪进行FQ-PCR扩增。然后验证EBV全自动核酸检测系统的性能指标,包括准确性、精密度、线性范围、检测限、防污染能力、交叉反应和抗干扰能力等。最后将EBV全自动核酸检测系统用于50例2018年11月—2019年6月温州医科大学附属第二医院的门诊及住院疑似IM患儿的核酸定量检测,并将EBV核酸检测结果与其他指标进行比较。  结果  EBV全自动核酸定量检测系统的准确性好,高、中、低水平的定量标准品均在定值范围内。检测精密度高,批内及批间精密度的CV值均＜5%。该检测系统在1.0×103~1.00×108 copies/mL线性范围内,线性相关系数≥0.980,检测限为5.0×102 copies/mL。另外,该检测系统的防污染能力良好,无交叉反应,抗干扰能力强。对50例儿童疑似EBV感染者的外周血进行核酸检测,阳性检出率为80.0%,EBV定量值在5.45×102~1.46×108 copies/mL,明显高于血清EBV IgM抗体检测(P=0.031)和血常规异型淋巴细胞检测(P < 0.001)。  结论  EBV全自动核酸定量检测系统的各项性能指标良好,可满足临床检测要求,可较好地用于疑似儿童IM的快速诊断,值得临床应用推广。      

两种不同释放剂核酸提取法的新型冠状病毒RT-PCR内标检测结果比较

目的 对新型冠状病毒核酸释放剂一步提取法进行优化,提高内标在荧光定量逆转录PCR中的检出效率,降低因内标未检出带来的复查率,提高核酸检测报告时效性.方法 对深圳市宝安中医院PCR实验室的新型冠状病毒核酸检测标本,采用本实验室优化方法用释放剂一步法提取核酸,与试剂盒说明书原方法进行比较,观察两种方法提取核酸后内标扩增曲线...     

磁珠法半自动提取全血基因组DNA条件的优化

目的:探讨磁珠法提取基因组DNA的影响因素,建立快速、高效、批量提取全血基因组DNA的优化方案。方法:使用磁珠法核酸自动提取系统从全血中提取基因组DNA,紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度。采用正交试验设计分析裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个因素的主效应和全血量与裂解时间、磁珠量,裂解时间与磁珠量的二阶交互作用对所提取DNA浓度和纯度的影响。结果:裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个主效应对DNA浓度的影响均存在统计学差异(P<0.05),当裂解时间为15 min,全血量为100μl,磁珠量为80μl,乙醇浓度为80%时,DNA平均浓度最高。磁珠量、裂解时间和全血量的交互作用对DNA OD260/OD280的比值有影响(P=0.008和P=0.013)。当磁珠量为40μl,裂解时间为15 min,全血量为100μl时,OD260/OD280的比值较好。磁珠量和乙醇浓度影响DNA OD260/OD230的比值(P=0.017和P<0.05),磁珠量为40μl,乙醇浓度为80%时,OD260/OD230的比值更好。结论:当DNA得率优先考虑时,可以选择裂解时间15 min、全血量100μl、磁珠量80μl、乙醇浓度80%的提取条件;而对DNA纯度要求较高时,可以将磁珠量改为40μl,以获得最优DNA提取效果。     

血清乙肝病毒DNA的快速提取及定量 PCR测定中应用的探讨

目的寻找简单、快速地提取血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA并能应用于定量PCP,测定的方法.方法使用碱裂解法、酚氯仿法和煮沸裂解法同时提取血清HBV DNA,比较荧光定量PCP测定的重复性和测定值的差异.结果碱裂解法所得HBV DNA量高于酚氯仿法和煮沸裂解法(P＜0.05),并且碱裂解法所得结果的重复性好于酚氯仿法和煮沸裂解法(CV分别为0.21,0.28和0.33).结论碱裂解法提取HBV DNA简单、快速,适用于HBV DNA荧光定量测定.     

四种微量石蜡组织DNA提取方法的比较

目的:探讨从微量福尔马林固定石蜡包埋组织(formalinfixation and paraffin embeddedtissues,FFPET)中提取DNA的简单而高效的方法。方法:采用Chelex-100提取法、酚氯仿抽提法、单纯消化法、水煮法4种方法提取组织DNA;应用聚合酶链反应扩增100~500bp长度DNA片段,然后进行电泳分析,1年后重复PCR电泳分析。结果:小于200bp长度DNA片段扩增,Chelex-100提取法、单纯消化法阳性率分别为88.8%、78.8%,明显优于酚氯仿抽提法(15.0%)(P<0.01)及水煮法(21.3%)(P<0.01)。随着扩增长度的增加,PCR扩增效率逐渐降低,Chelex-100提取法PCR反应总阳性率为82.5%,单纯消化法为66.5%,水煮法为13.4%,酚氯仿抽提法为13.4%。1年后重复PCR总阳性率分别为80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。结论:Chelex-100提取法方便简单,适用于微量石蜡组织DNA扩增分析;单纯消化法及水煮法在一定条件下适用于微量石蜡组织短片段DNA的扩增。