弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区在大肠杆菌中的表达

目的：克隆并表达弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段，为下一步表达蛋白纯化奠定基础方法：将弓形虫SAG1基因成熟蛋白编码区片段克隆入高效融合表达载体pET32α，转化大肠杆菌B121(DE3)，37℃、IPTG诱导表达，SDS—PAGE分析表达产物结果：成功构建重组质粒pET32α—SAG1，经诱导后表达出含外源基因的融合蛋白，SDS—PAGE分析表达产物分子质量约44kDa，结论：弓形虫SAG1成熟蛋白编码区在原核表达系统pET32α/BL21(DE3)中获得成功表达，为下一步表达蛋白纯化提供试验依据。     

重组人Importin α的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的重组表达人细胞核输入蛋白α（Importin α）,制备多克隆抗体。方法提取人肝癌细胞HepG2中的总RNA,RT-PCR法扩增Importin α基因。构建pGEX-6P-1-Importin α融合表达载体,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基硫代β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达GST-Importin α重组蛋白,经谷胱甘肽亲和层析纯化,然后免疫小鼠,制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价。结果 RT-PCR扩增出的Importin α基因片段（1300bp）与理论大小一致。SDSPAGE和蛋白质印迹分析纯化GST-Importin α重组蛋白相对分子质量为83kD,与质谱分析的相对分子质量结果相符。重组蛋白免疫小鼠后收获抗血清,ELISA显示抗体效价高。结论在大肠埃希菌中成功表达并纯化Importin α蛋白,获得多克隆抗体,为进一步研究输入系统及其应用打下基础。     

弓形虫SAG1基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测

目的 在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染。方法 将截短的SAG1基因经PCR扩增后,定向亚克隆入原核表达载体pET-30a( ),酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导表达,对融合的表达产物进行纯化和复性,通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性。结果 成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31．58％。经过简易的纯化和复性过程,该重组抗原（rSAG1）能被弓形虫感染的人血清所识别。用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性。结论 截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化和复性后,能有效检测弓形虫的感染,可用于构建弓形虫病检测试剂盒。     

人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中的构建与表达研究

目的构建NKG5突变基凶的原核表达载体并进行表达研究。方法采用寡核苷酸合成的方法,拼接成为NKG5-Set的编码序列．克隆到pGEMT载体上,测序正确后,再切下编码序列连接到质粒pGEX-4T—1中,重组表达载体转化大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,用IPTG诱导使融合蛋白高效表达。结果成功获得重组表达载体pGEX-4T-1-NKG5-Ser,转染大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达后,SDS—PAGE和免疫印迹反应均显示显示出相对分子量（Mr）为35kD的蛋白条带,证明融合蛋白表达成功。结论获得了突变NKG5与GST的融合蛋白,为进-步的工作打下了基础。     

丙型肝炎NS5A基因多克隆抗体的制备

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）NS5A蛋白原核表达载体,获得高产量的纯化目的蛋白,并制备其多克隆抗体。方法：应用聚合酶链反应技术,PCR扩增获得NS5A基因,将NS5A基因插入至原核表达载体pET-32a（＋）中,转化大肠埃希菌DH5α提取质粒,验证正确后,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导,获得NS5A融合蛋白的可诱导性表达．通过SDS—PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实融合蛋白表达的特异性。利用Ni^＋亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。纯化蛋白免疫新西兰兔,利用Western blot和ELISA法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。结果：NS5A融合蛋白表达成功,成功获得了融合蛋白及兔抗NS5A多克隆抗体。结论：成功表达NS5A基因融合蛋白．获得高特异性、兔抗NS5A多克隆抗体,为研究NS5A基因的生物学功能提供了重要制剂。     

弓形虫SAGl基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测

目的在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染.方法将截短的SAG1基因经PCR扩增后,定向亚克隆入原核表达载体pET-30a(+),酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,对融合的表达产物进行纯化和复性,通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性.结果成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31.58%.经过简易的纯化和复性过程,该重组抗原(rSAG1)能被弓形虫感染的人血清所识别.用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性.结论截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化和复性后,能有效检测弓形虫的感染,可用于构建弓形虫病检测试剂盒.     

弓形虫ZS株P22基因片段的克隆、表达与融合蛋白的纯化

目的 克隆弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因，构建原核重组表达质粒pThioHieA，B，C／P22，并在大肠杆菌(Top10)中进行表达及纯化融合蛋白。方法 PCR扩增及限制性内切酶Pst Ⅰ和Bgl Ⅱ双酶切496bp的弓形虫表面抗原P22编码基因目的片段，胶回收纯化，插入表达质粒裁体pThioHisA，B，C多克隆位点，构建置组体pThioHisA，B，C／P22，并转化大肠杆菌(E.coli)Topl0，筛选阳性克隆，以限制性酶切分析及测序鉴定后，以异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导，在E.coli Top10中表达，用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物并纯化．结果 PCR扩增出约496bp的P22编码基因目的片段，与预期片段大小相符；所构建的pThioHisA，B，C／P22重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定，与预期结果一致；SDS—PAGE与免疫印迹显示，表达融合蛋白产物约35．4kD．结论 成功构建弓形虫ZS株表面抗原P22编码基因pThioHisA，B，C／P22表达质粒，诱导表达弓形虫表面抗原P22蛋白，并纯化该融合蛋白。     

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆表达、纯化与鉴定

目的：构建弓形虫SAG1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白SAG1,分离纯化并检测其免疫反应性。方法：设计一对特异引物,体外扩增SAG1目的基因（双酶切纯化后）定向克隆至质粒pET29a（＋）中,转化到大肠埃希菌（Escherichia coli）BL21,采用PCR、双酶切和测序等方法鉴定,并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的表达情况,经镍离子柱纯化重组蛋白后,用蛋白质印迹（Western blotting）分析与小鼠弓形虫阳性血清的免疫反应性。结果：重组质粒经PCR、双酶切反应和测序鉴定,产物的大小与结构均与预期值相符,经IPTG诱导后,稳定表达相对分子量（Mr）为28950的蛋白,纯化后的重组蛋白经Western blotting分析显示,与小鼠弓形虫感染血清有特异性反应条带。结论：成功构建重组表达质粒pET29a（＋）-SAG1,使弓形虫表面抗原SAG1在体外获得表达,分离纯化的SAG1重组蛋白有免疫反应性。     

间日疟原虫MSP1 C重组蛋白的制备及其在血清学诊断中的应用

目的在大肠埃希菌（E，coli）中表达、纯化间日疟原虫裂殖子表面蛋1C端重组蛋白（rGST—PvMSP1C）作为诊断抗原，评价其在间日疟血清学诊断中的应用价值。方法将含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C的工程菌E．coil BL21（DE3）以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS—PAGE与Western—blot免疫印迹进行鉴定；采用GST融合蛋白层析柱进行分离纯化；以纯化重组蛋白包被酶标板，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测间日疟患者血清中的特异性IgG抗体。结果含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C工程菌经IPTG诱导表达的rGST—PvMSP1C重组蛋白大小约63ku，能够被间日疟患者的血清所识别。纯化的重组蛋白SDS—PAGE电泳显示一条预期大小的蛋白条带；以重组蛋白作诊断抗原，67份镜检阳性的间日患者血清标本ELISA均为阳性。55份健康人血清ELISA均为阴性．5份恶性疟患者血清及7份血吸虫患者血清检测结果亦为阴性。结论在大肠埃希菌中表达纯化的间日疟原虫rGST—PvMSP1C蛋白具有免疫反应性，以其作为诊断抗原建立的血清中特异性IgG抗体ELISA检测方法具有良好敏感性和特异性，在间日疟的免疫学诊断中具有一定的推广使用价值。     

重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。     

弓形虫SAG1的高密度发酵表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 探讨弓形虫SAG1在大肠杆菌中的高密度发酵表达及其批量制备流程.方法 利用高密度发酵大肠杆菌批量表达rSAG1,经Ni-NTA、Sephadex G-75及切胶等纯化工艺对重组蛋白进行纯化,用Western blotting鉴定其免疫反应性,ELISA验证rSAG1检测弓形虫抗体的敏感性与特异性.结果 高密度发酵诱导4 h后工程菌液的OD600达到20.21:平均每升发酵液可收获工程菌26.10 g;目标蛋白的表达量占菌体蛋白的25.82%;经Ni-NTA、Ni-NTA联合Sephadex G-75及Ni-NTA联合切胶纯化的rSAG1蛋白纯度分别为72.36%、98.54%和97.39%;Western blotting结果显示联合纯化的rSAG1与弓形虫免疫兔血清晕单一反应条带,与正常兔血清未出现反应带;Ni-NTA联合Sephadex-G75纯化的rSAG1对25例感染小鼠血清和38例抗体阳性患者血清的检出率分别为96%和94.7%.结论 利用高密度发酵技术高效表达、Ni-NTA联合Sephadex G-75纯化的rSAG1具有较高纯度和良好的免疫反应性,该工艺可以用于rsAG1抗原的批量生产.     

弓形虫复合基因SAG1-BAG1的构建、表达及重组抗原的免疫反应性分析

目的构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1及分析重组抗原的免疫反应性。方法利用PCR扩增弓形虫SAG1基因,利用RT-PCR扩增弓形虫BAG1基因,通过酶切连接分别将SAG1、BAG1基因克隆到pET28a表达载体中构建复合基因SAG1-BAG1。将质粒pET28a-SAG1-BAG1转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,Western-blot分析该重组蛋白的免疫反应性。结果复合基因SAG1-BAG1全长约1 407 bp,重组蛋白相对分子质量约为50 000,表达量约占菌体总蛋白的10%,Western-blot分析显示重组蛋白具有良好的免疫反应性。结论成功构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1。     

截短形式弓形虫SAG1抗原在大肠杆菌中的可溶性高效表达、纯化及免疫反应性鉴定

目的 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达弓形虫SAG1基因的截短片段，并进行纯化及免疫反应性鉴定。方法 利用，VcoI、HindⅢ双酶切，从本室建立的pET-30a( )-SAG1重组质粒中获取SAG1基因的截短片段，并将目的片段连接到经同样双酶切的质粒pET32a中，构建表达重组质粒pET-32a( )-trSAG1。将重组质粒转入E．coli BL21中并进行诱导表达。表达蛋白经Ni—NTA agarose纯化后，Western—blotting分析其免疫反应性。结果 成功构建重组质粒pET-32a( )-trSAG1，通过IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组SAG1蛋白，相对分子质量40000，Western—blotting结果显示纯化的重组蛋白具有良好的免疫反应性，ELISA试验表明重组SAG1蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别。结论 在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达了弓形虫SAG1基因的截短片段，表达蛋白能被弓形虫免疫兔血清及弓形虫感染人血清识别，有望成为一种有价值的诊断抗原。     

弓形虫分泌蛋白ROP5的全基因原核重组表达与抗原性鉴定

目的在大肠杆菌工程菌中重组表达刚地弓形虫RH株棒状体蛋白5(ROP5)的融合蛋白GST-6×His-ROP5,并初步评价重组蛋白的抗原性。方法体外细胞培养弓形虫速殖子,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增ROP5基因全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS工程菌中诱导表达重组融合蛋白,最后通过Western blotting鉴定重组蛋白rROP5的抗原性。结果构建了弓形虫ROP5全基因重组表达质粒,诱导表达了GST-6×His-ROP5融合蛋白,分子量为96 kDa,与预测结果相符,重组蛋白与人源抗血清有显著免疫印迹反应。结论本研究获得了弓形虫ROP5全长重组蛋白,为进一步改进弓形虫诊断抗原,研究蛋白结构以及分泌蛋白与宿主细胞的相互作用奠定了基础。     

弓形虫主要表面抗原1截短型片段的纯化与鉴定

目的:表达和纯化弓形虫SAG1,分析其免疫原性。方法:将诱导表达SAG1后菌体裂解,离心,分别收集其上清和沉淀;亲和层析分离纯化裂解上清液中的SAG1,SDS-PAGE和Western blot鉴定SAG1纯度和免疫原性。结果:诱导后重组体pGEX-SAG1/Bl21超声裂解上清液、8M脲溶解沉淀的上清中都含有融合蛋白GST-SAG1,从超声裂解上清液中纯化获得融合蛋白GST-SAG1。结论:亲和层析获得具有免疫原性的SAG1。     

弓形虫表面抗原P35重组蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 构建弓形虫R0H株表面抗原P35基因重组表达质粒P35／pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中进行表达、纯化及鉴定。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从弓形虫CDNA库中扩增出编码P35抗原的基因片段，克隆入表达载体pGEX-2T，并在大肠杆菌JMl09中融合表达，经GSTmp^TM亲和层析柱纯化出P35重组融合蛋白，以SDS-PAGE电泳鉴定纯度、Western-blot鉴定抗原性。结果成功构建了重组表达质粒P35／pGEX-2T，融合表达产物的分子质量约为70kDa；该蛋白抗原能为谷胱甘肽S转移酶(GST)单克隆抗体及弓形虫感染的兔血清所识别。结论弓形虫表面抗原P35在大肠杆菌中有效表达，纯化蛋白有良好的免疫活性。     

刚地弓形虫谷胱苷肽巯基转移酶-醛缩酶融合蛋白的制备及纯化

目的体外制备刚地弓形虫醛缩酶(aldolase)蛋白并纯化。方法以刚地弓形虫cDNA链为模板,聚合酶链反应扩增aldolase基因,克隆至质粒pGEX-4T-1上,转化至大肠杆菌BL21;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达,亲和层析纯化表达产物。结果获得了aldolase基因序列,构建了aldolase/pGEX-4T-1原核表达系统,表达并纯化了谷胱苷肽巯基转移酶-醛缩酶(GST-aldolase)融合蛋白。结论体外获得了纯化的GST-aldolase蛋白,为后续的aldolase功能研究奠定了基础。     

恶性疟原虫PfRh5F2片段pTGub21b表达载体的构建及融合蛋白表达鉴定

目的克隆表达恶性疟原虫网状细胞结合蛋白同源体5(PfRh5)F2片段,并评价其抗原性。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pTGub21b中,构建PfRh5F2/pTGub21b原核表达载体。IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,并用Western blot检测其抗原性。结果成功构建了PfRh5F2/pTGub21b原核表达系统,并在大肠杆菌中可溶性高效表达,表达产物能被恶性疟患者血清识别,而重组抗原免疫鼠血清也能识别恶性疟患者血样中的相应抗原。结论恶性疟原虫PfRh5 F2片段在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核重组表达质粒的体外表达分析

目的:分析弓形虫致密颗粒蛋白GRA8真核表达质粒的体外表达。方法:大量提取纯化重组真核表达质粒pVAX1-GRA8,瞬时转染培养的vero E-6细胞,RT-PCR和免疫印迹法检测GRA8在细胞中的表达。结果:从转染pVAX1-GRA8后的vero E-6细胞的RNA中扩增出GRA8的特异条带,转染细胞存在弓形虫感染血清识别的特异蛋白质条带。结论:真核表达质粒pVAX1-GRA8在vero E6细胞中获得表达。