hTERT启动子的克隆及hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的转录活性

目的 克隆hTERT启动子核心序列,研究hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞中的联合转录活性。 方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增hTERT启动子核心片段;将其分别插入荧光素酶基因报告质粒pGL3-Basic和pGL3-Enhancer中,构建hTERT启动子调控的表达载体pGL3-hTERTp和由hTERT启动子/SV40增强子联合调控的表达载体pGL3-hTERTp-SV40en,将上述重组质粒分别瞬时转染食管癌细胞Eca-109、EC1和人胚肺成纤维细胞MRC-5,用荧光素酶检测试剂盒检测转染细胞中荧光素酶基因的表达水平并以此计算hTERT启动子和hTERT启动子/SV40增强子在各种细胞中的转录活性。结果 克隆出长213 bp的hTETR启动子核心片段,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子的碱基序列完全一致;成功构建真核表达载体pGL3-hTERTp和pGL3-hTERTp-SV40en;hTETR启动子在食管癌细胞Eca-109和EC1中均有转录活性,在MRC-5细胞中无明显转录活性;hTERT启动子/SV40增强子在食管癌细胞Eca-109和EC1中的转录活性显著高于hTETR启动子的单独转录活性。结论 hTERT启动子在食管癌细胞中具有靶向性转录活性,SV40增强子能显著增强hTERT启动子在食管癌细胞中的转录活性,有可能作为肿瘤靶向性基因治疗的转录调控元件。     

人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的克隆及其在人肺癌细胞中转录活性的研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子，并检测它在多种人肺癌细胞株和人胚肺成纤维细胞株中的转录活性，为肺癌靶向性基因治疗的研究奠定基础。方法以人胚肾293细胞基因组DNA为模板，应用PCR方法克隆hTERT 5’端上游旁侧序列长约1．1kh的启动子片段，经DNA测序无误后克隆人荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建pGL3-hTER Tp重组质粒，用脂质体法瞬时转染人肺癌细胞株A549、SPC-A-1、LTEPa-2、NCI—H446、YTMLC、GLC-82、A2，以及人胚肺成纤维细胞株MRC5，转染48h后检测hTERT启动子在各细胞株中的转录活性。结果琼脂糖凝胶电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1.1kb。DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，其5’端和3’端分别位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp和43bp，片段长度为1084bp。采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒，均显示构建成功。瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示，hTERT启动子在所检测的肺癌细胞株中均有高低不同的转录活性，而在MRC-5细胞株中无转录活性。结论该实验克隆的1084bp大小的hTERT启动子在多种肺癌细胞株中均有转录活性，在人胚肺成纤维细胞中无转录活性。hTERT启动子有可能作为调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗。     

hTERT启动子的克隆及在MCF7乳腺癌细胞中的特异转录活性

背景与目的：利用肿瘤特异性启动子增强肿瘤细胞中治疗基因的转录选择性是达到基因治疗靶向性的有效途径。人端粒酶催化亚基（hTERT）在大部分肿瘤细胞中呈特异性高表达，有可能成为肿瘤特异性启动子。本文扩增了hTERT基因启动子并分别克隆于报告基因重组质粒pEGFP-1和pGL3-Basic，检测并证实hTERT启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性。方法：采用套式PCR法扩增hTERT启动子，将其分别克隆到含报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒pEGFP-1和含Luciferase的重组质粒pGL3-Basic，经脂质体分别转染人乳腺正常上皮细胞系HBL100和乳腺癌细胞MCF7，荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并测定两种细胞中荧光素酶转录表达差异。结果：与正常细胞HBL100相比，hTERT启动子在MCF7细胞呈现强的绿色荧光表达；荧光素酶活性检测与其一致，hTERT启动子在MCF7乳腺癌细胞的荧光素酶相对活性RLU／U值（33784）约相当于HBL100细胞中（2400）的15倍。结论：hTERT启动子在乳腺癌MCF7细胞中具有很强的特异性，为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定实验基础。     

多西紫杉醇对人胃癌细胞BGC-823 hTERT启动子转录活性及其调控基因c-myc表达的研究

目的:探讨多西紫杉醇对人胃癌细胞BGC-823端粒酶活性和端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA表达、hTERT启动子转录活性及其转录调控基因c-myc蛋白表达的影响。方法:加药多西紫杉醇24、48和72h后收集细胞,MTT比色法测定IC50值;分别采用PCR-ELISA法检测端粒酶活性和RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶hTERT mRNA的表达;Luciferase法检测hTERT启动子活性;Western blot技术检测c-myc蛋白的表达。结果:多西紫杉醇可以明显抑制胃癌细胞BGC-823的端粒酶活性和hTERT mRNA的表达,呈一定的时效、量效关系;进一步研究发现,多西紫杉醇对胃癌细胞端粒酶活性的影响抑制了hTERT启动子转录活性的表达,同时对启动子转录活性调控蛋白c-myc表达的研究也证实了这一点。结论:hTERT mRNA的表达与胃癌的发生和演进有关,癌基因c-myc可能通过参与hTERT启动子转录活性的表达调控而调控hTERT mRNA表达。多西紫杉醇抑制胃癌细胞BGC-823的增殖可能与其抑制BGC-823细胞hTERT启动子转录活性和c-myc蛋白表达相关。     

人端粒酶逆转录酶基因转录调控研究进展

人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶活性的限速因子,因此hTERT活性调控被认为是人端粒酶活性调节的一个主要机制.目前有关hTERT活性调控的研究主要集中在hTERT基因转录水平.研究表明已知的几种转录因子、细胞分化诱导剂、某些病毒相关蛋白以及DNA甲基化和乙酰化状态可能在转录水平对hTERT表达起调控作用.     

人端粒酶逆转录酶基因转录调控研究进展

人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶活性的限速因子，因此hTERT活性调控被认为是人端粒酶活性调节的一个主要机制。目前有关hTERT活性调控的研究主要集中在hTERT基因转录水平。研究表明已知的几种转录因子、细胞分化诱导剂、某些病毒相关蛋白以及DNA甲基化和乙酰化状态可能在转录水平对hTERT表达起调控作用。     

重组人可溶性凋亡素-2在人喉癌株中表达及其体外诱导凋亡作用的实验研究

目的:研究凋亡因子TRAIL结合端粒酶启动子对肿瘤的特异性杀伤作用。方法:刺激人外周血淋巴细胞增殖,提取总RNA。采用RTPCR扩增IL2信号肽基因和TRAIL基因的融合基因,并克隆入真核表达载体pGL3181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3181hTERT/TRAIL。用Westernblot鉴定喉癌细胞株Hepa2中表达产物。将该重组载体经阳离子脂质体转染入人喉癌细胞株Hepa2中,用电镜观察细胞的形态变化,用流式细胞仪技术(FCM)分析转染后细胞凋亡率及细胞周期的变化。结果:PCR扩增得到了613bp的cDNA片断。与GenBank中报道的IL2信号肽和TRAIL凋亡诱导功能区cDNA序列完全一致,成功构建了重组真核表达载体pGL3181hTERT/TRAIL。Westernblot结果显示,获得的瞬时转染TRAIL在喉癌细胞Hepa2中特异表达,且能诱导其凋亡。结论:重组真核表达载体pGL3181hTERT/TRAIL的成功构建,为肿瘤基因治疗的靶向性提供了可行的理想工具。     

HeLa细胞ezrin基因基本启动子区转录调控元件的鉴定

 目的 鉴定HeLa细胞中调控ezrin基因基本启动子活性的顺式作用元件,探讨ezrin基因在HeLa细胞的表达调控机制。 方法 采用碱基定点突变实验和双荧光素酶报告基因分析系统,检测在HeLa细胞中Sp1结合位点(-75/-69, 相对于转录起始位点)和AP 1结合位点(-64/-58)对人ezrin基因基本启动子活性的影响;采用电泳迁移率变动分析法(EMSA)实验,检测ezrin基因基本启动子区序列与HeLa细胞核蛋白提取物的特异性结合活性。 结果 在HeLa细胞中,单独删除和置换Sp1结合位点或AP 1结合位点,ezrin基因基本启动子活性降低50％左右;同时置换Sp1结合位点和AP 1结合位点,启动子活性几乎完全丧失。ezrin基因基本启动子序列能够与HeLa细胞核蛋白提取物相结合。 结论 HeLa细胞中,Sp1结合位点和AP 1结合位点为ezrin基因基本启动子区的重要转录调控元件,有可能存在某种转录因子与之结合,激活ezrin基因转录。     

hTERT启动子克隆及其肿瘤细胞特异性的研究

目的:探讨克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子对肿瘤细胞特异性的意义.方法:全基因合成hTERT启动子核心序列TP258,克隆入T载体,构建pUCmT-TP258测序;Sal Ⅰ BamH Ⅰ酶切pUCmT-TP258,将其片断插入pGL3-Basic/Xho I Bgl Ⅱ位点,构建pGL3-TP258质粒载体.将pGL3-Basic、pGL3-control和pGL3-TP258转染培养的人结肠癌细胞株(CaCo-2)、人乳腺癌细胞株(MCF-7)、原代肾癌细胞(RCC)和人正常成纤维细胞(UFC、BJ、MRC-5),测定Luciferase活性,计算其相对活性.结果:在端粒酶阳性的肾癌细胞RCC、结肠癌细胞CaCo-2和乳腺癌细胞MCF-7中,TP258启动子相对活性很高,分别为32.40±15.32、37.70±6.38和12.80±7.28;而在正常的UFC、BJ和MRC-5细胞中,TP258活性很低,分别是0.40±0.14、0.26±0.13和0.38±0.05,两组闻差异有统计学意义,P=0.003 5.结论:hTERT核心启动子TP258在肿瘤细胞中活性明显高于在正常细胞中的活性,具有肿瘤特异性.TP258可以介导基因在肿瘤中的定向表达,实现基因表达的靶向性.     

口腔鳞癌细胞中ITGB6基因主要转录调控区域的定位分析

目的： 鉴定ITGB6基因在口腔鳞癌细胞中的主要调控区域,为研究ITGB6基因在口腔鳞癌细胞中的转录调控机制奠定基础。方法：构建含有ITGB6基因转录起始点上游5' 端侧翼区不同长度DNA序列的重组pGL2荧光素酶报告基因质粒,转染口腔鳞癌细胞株TCA8113和SAS,利用双荧光素酶报告基因系统检测启动子转录活性,并通过生物信息学方法预测ITGB6基因中潜在的主要转录因子结合位点。结果：获得一系列不同长度ITGB6基因5' 侧翼区序列的重组荧光素酶报告基因质粒;当ITGB6基因5' 端侧翼片段截短到-187～-35和-35～+27之间时,启动子活性均显著下降;生物信息学分析显示,在-187～-35区域有2个Ets-1的潜在结合位点,而在-35～+27区域有1个IRF-4潜在结合位点。结论：在口腔鳞癌细胞中,ITGB6基因-187~-35和-35~+27区域是主要的转录因子结合区。     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

Assessment of the degree of carcinogenicity of small doses of nitrites

Chronic experiments on CBA and C57B1 mice and acute experiments on CBA mice established: (a) carcinogenic effect of sodium nitrite given continuously with drinking water (0.1; 1.0 and 10.0 maximum allowable concentration) in combination with morpholine fed with bread, and (b) endogenous synthesis of nitrosomorpholine as a result of simultaneous intragastric administration of same doses of sodium nitrite and morpholine. Also, nitrosomorpholine and N-nitrosodimethylamine synthesis was observed in vitro following addition of low-dose sodium nitrite, morpholine and amidopyrine to human gastric juice. Carcinogenic hazard associated with low-dose nitrite consumption in humans is discussed.     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。