人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞的诱导分化

目的观察人骨髓间充质干细胞（HBMCs）的体外培养及向血管内皮细胞的诱导分化结果。方法利用密度梯度离心法将HBMCs从人骨髓中分离出来,体外扩增。将培养至第3代的HBMCs加入含血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（bFGF）的培养基定向诱导,使其向血管内皮细胞分化。用免疫细胞化学和流式细胞学方法检测诱导后的细胞表型。结果原代HBMCs培养3周后细胞呈梭形,诱导后第7天的细胞呈椭圆形或不规则形,第14天细胞大致呈＂铺路石＂样改变,细胞化学方法检测发现其CD31、CD34、vWF因子呈阳性,流式细胞仪测定CD31、vWF因子阳性细胞分别占87.5%、82.6%,CD31、vWF因子均阳性的细胞占71.2%。结论 HBMCs在VEGF、bFGF的诱导下向血管内皮细胞方向分化。     

反义寡核苷酸和更昔洛韦对巨细胞病毒诱导的内皮细胞黏附因子表达的影响

目的观察反义寡核苷酸（ASON）和更昔洛韦（GCV）对巨细胞病毒（CMV）感染后体外培养的内皮细胞（ECs）黏附分子表达的调节作用。方法体外培养人脐静脉血管ECs成单层,加入CMV-AD169株病毒为感染组,同时加入ASON（8.0μmol/L）和GCV（1.8 mg/L）为抑制组,应用ELISA方法及双抗体夹心酶联免疫分析法检测血管ECs黏附因子1（VCAM-1）及可溶性细胞间黏附因子1（sICAM-1）表达的变化。结果ASON和GCV组在24、48、72 h培养液中sICAM-1及VCAM-1水平均比感染组明显降低（P〈0.05,P〈0.01）,而与正常对照组无明显差异。结论体外情况下,ASON和GCV可以抑制CMV感染诱导的sICAM-1和VCAM-1表达。     

体外构建组织工程化同种带瓣管道的研究

利用密度梯度离心法分离出胸骨骨髓10ml间充质干细胞(HMSCs),体外培养、扩增、纯化后加入特定生长因子将其定向诱导分化为内皮细胞(ECs)并作为种子细胞;液氮保存的人同种带瓣管道表面的ECs利用SDS及EDTA等去污剂完全脱去,并作为种植支架。将已培养好的ECs高密度种植在管道支架上,静态培养2周后用扫描电镜观察管道表面再内皮化程度。结果HMSCs在特定环境下定向分化为ECs;人同种带瓣管道表面的ECs被完全脱去,而中心部分的基质细胞及弹性纤维、胶原纤维完整保留;体外构建的组织工程化带瓣管道表面重新覆盖了完整的ECs单层。证实将HMSCs定向诱导分化后的ECs种植于脱ECs的人同种带瓣管道上,构建同种组织工程化带瓣管道具有可行性。     

内皮细胞凋亡与动脉粥样硬化关系的研究进展

血管内皮细胞(ECs)是紧贴血管壁的单层细胞,在血管稳态平衡中有重要作用,易受到炎性细胞和循环因子损害,诱导ECs活化和损伤。动脉粥样硬化(AS)与ECs之间关系密切,ECs损伤是AS形成的早期始动环节,并有实验发现在粥样斑块中ECs、平滑肌细胞和免疫细胞凋亡现象增加,覆盖于血管病变处的ECs促凋亡蛋白如Fas和Bax表达升高,抗凋亡因子     

体外人脐静脉内皮细胞的培养鉴定及抗原表达分析

目的探讨体外分离、培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的方法及进行HUVECs的扩增和鉴定,明确HUVECs表面抗原表达情况。方法采集正常人脐带,应用改良的酶消化法进行HUVECs的分离培养;通过细胞形态学观察及免疫荧光化学鉴定HUVECs,应用细胞荧光化学进行内皮细胞（ECs）功能检测;应用流式细胞仪分析内皮细胞的特异性抗原表达。结果观察细胞形态呈铺路石样,Ⅷ因子相关抗原荧光染色阳性,显示出摄取乙酰化低密度脂蛋白、结合荆豆凝集素等ECs的功能特性;流式细胞仪检测CD31、VWF、KDR、CD34抗原表达阳性百分比高,而CD133处于低水平。结论通过本实验改良的分离培养方法,可以在体外获得较高数量的HUVECs,在细胞形态、表面抗原标志、细胞功能等方面具有ECs特征,可以用于血管ECs模型的构建。     

内皮素A型受体反义基因减弱内皮细胞条件培养液刺激的血管平滑肌细胞增殖

目的 :研究内皮素 （Endothelin,ET） A型受体 （ETA）反义寡核苷酸 （Oligonucleotide,OGN）对内皮细胞 （En-dothelial cells,ECs）条件培养液 （ECCM）刺激的人大隐静脉 （hum an saphenous vein,HSV）血管平滑肌细胞 （Vas-cular sm ooth m uscle cells,VSMCs）增殖的影响。方法 :分离、培养 HSV的 ECs和 VSMCs。收集 ECCM,分别用正常的 DMEM（Dulbecco’s Mod Ified Eagle medium ）、含 ET- 1的 DMEM、ECCM和加入 Phophoramidon（ET- 1转化酶抑制剂 ）的 ECCM培养 VSMCs。以放射免疫法测定 ECs培养基中 ET- 1水平 ;分别采用放射受体结合分析法和四唑盐 （MTT）比色实验检测 ETA 蛋白表达和细胞的增殖。结果 :ETA- OGN（15 μm ol/L）以时间依赖的方式抑制ETA 表达。 12～ 4 8h HSV的 ECs培养上清液 ET- 1水平呈现上升的趋势 ,4 8h达到高峰。 ECCM显著刺激 VSMCs增殖 （P<0 .0 1） ,ET- 1能够模拟 ECCM的促增殖作用。在 ECCM中加入 Phosphorimidon,不能使 ECCM的促增殖效应消失 （P<0 .0 5 ）。ETA- OGN（15 μm ol/L）对无血清正常的 DMEM培养基培养的 VSMCs增殖没有显著影响 ,但显著抑制 ECCM和 ET- 1的促增殖作用 （P<0 .0 1vs ECCM）。结论 :ECs通过分泌包括 ET- 1在内的多种因子促进 VSMCs增殖 ,其中 ET- 1发挥主要的作用。 E     

LncRNA-MIAT在肿瘤坏死因子α介导的血管内皮细胞炎症中的表达及作用

目的:体外观察血管内皮细胞(ECs)在肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激下,细胞内长链非编码核糖核酸(LncR NA)心肌梗死相关转录本(LncR NA-MIAT)的表达变化,并探讨LncR NA-MIAT对ECs炎症的调控作用。方法:以TNF-α诱导ECs表达LncR NA-MIAT,采用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)、聚合酶链反应(PCR)及实时荧光定量PCR(qR T-PCR)方法分别检测ECs炎症状态下细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和LncR NA-MIAT的表达情况。应用MIAT小干扰核糖核酸(siR NAMIAT)转染ECs细胞,观察LncR NA-MIAT敲低对ICAM-1表达的影响。结果:Lnc RNA-MIAT随着TNF-α刺激时间的延长与浓度的增高呈上升趋势,刺激24 h、48 h分别与刺激0 h、6 h、12 h比较,Lnc RNA-MIAT表达量均增多,差异均具有统计学意义(P0.05);TNF-α刺激浓度为1.000 ng/ml、10.000 ng/ml分别与刺激浓度为0.000 ng/ml、0.125 ng/ml比较,LncR NA-MIAT表达量增多,差异均具有统计学意义(P均0.05)。ECs经siR NAMIAT转染后,TNF-α诱导的ICAM-1蛋白表达被显著抑制(P0.05)。结论:LncR NA-MIAT可能参与血管ECs的炎症反应,并可能起到促炎作用。     

人脐动脉内皮细胞和平滑肌细胞体外培养鉴定及缝隙连接通讯功能测定

目的:应用双光子激光扫描共聚焦显微镜鉴定体外培养的脐动脉内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(SMCs),应用荧光光漂白恢复技术(FRAP)测定血管ECs、SMCs之间的缝隙连接通讯(GJIC)功能。方法:人脐动脉ECs、SMCs分离培养,Ⅷ因子和SMα-actin相关抗原鉴定ECs和SMCs,应用FRAP技术测定血管内皮细胞、平滑肌细胞之间的GJIC功能,记录实时成像结果,应用动态比(M)计算漂白区域内标记荧光的分子中动态分子的比例。结果:第一组ECs和SMCs单独培养,选择漂白细胞与周围至少3个同种细胞相连接,SMCs被漂白后平均M值为31.79±5.69;ECs被漂白后平均M值为23.43±2.11;第二组ECs和SMCs混合培养,选择ECs和SMCs独立相连的2个细胞,SMCs被漂白后平均M值为14.47±3.28,ECs被漂白后平均M值为6.41±0.80。结论:FRAP实时动态恢复曲线可直接观察荧光恢复强度及速度,参照FRAP恢复曲线,M值可做为组间GJIC比较相对定量的可靠指标,通过检测证实ECs和SMCs之间存在GJIC,且荧光由ECs向SMCs方向的传递大于由SMCs向ECs方向的传递。     

肝细胞生长因子联合成纤维细胞生长因子-4诱导人骨髓来源的多能成体祖细胞向肝样细胞分化

目的 探索肝细胞生长因子（HGF）-4成纤维生长因子4-（FGF-4）诱导人骨髓来源多能成体祖细胞（hMAPCs）分化为肝细胞的可行性，为肝组织工程提供新的种子细胞来源。方法 （1）取志愿者适量骨髓后采用梯度密度离心＋贴壁培养获取骨髓间充质干细胞（MSCs），将MSCs通过CD45、GlyA免疫微磁珠负分选得到hMAPCS。（2）将hMAPCs用HGF＋FGF-4进行诱导分化。实验分组：A组：HGF（20ng／m1）＋（FGF-4）10ng／m1诱导hMAPCS；B组（阳性对照组）：L-02人肝细胞株；C组（阴性对照组）：未加任何诱导因素的hMAPCs。（3）免疫细胞化学鉴定不同诱导分化阶段细胞的白蛋白（A1b）、甲胎蛋白（AFP），细胞角蛋白-18（CK-18）等肝细胞特征的表型变化评计数阳性细胞比率。（4）逆转录-聚合酶链反应检测不同诱导分化阶段细胞的A1b、AFP，CK-18的mRNA转录。（5）Western blot检测诱导分化第21，35天后细胞的A1b表达。结果（1）免疫细胞化学结果：A1b、CK18在诱导组中不同时间段基本为阳性着色；AFP在诱导分化第7天为阳性着色，在诱导第14，21天为阴性着色。（2）逆转录聚合酶链反应结果：作为不成熟肝细胞表型的AFP，在诱导分化的第7天有mRNA阳性表达；作为成熟肝细胞表型的A1b及CK-18，在不同时间段mRNA均为阳性表达。（3）Western blot检测诱导分化第21、35天后细胞的A1b表达。结论hMAPCS在一定诱导条件下具有向肝样细胞分化的潜能。     

黄芪诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的观察黄芪注射液诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化的特点。方法使用稀释浓度为200mg／ml的黄芪注射液诱导BMSCs，分别在1、3、6d倒置显微镜观察细胞形态变化，免疫细胞化学方法观察巢蛋白（nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白-2（MAP-2）的表达。结果诱导后可见细胞形态发生改变，自胞体长出突起，随诱导时间延长，长出突起的细胞数量增多，突起进一步伸长，部分突起末端呈分叉状，可见网络状连接。免疫细胞化学示：nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阳性细胞在诱导第3天较多，MAP-2阳性细胞在第6天较多。结论黄芪首先诱导BMSCs向神经干细胞分化，然后促进其向神经元或神经胶质细胞的非特异性分化，并促进已分化的细胞进一步成熟、老化。     

梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤成熟人神经母细胞瘤细胞的修复作用及其机制

目的 观察梓醇对氧糖剥夺/复氧复糖损伤的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(SH-SY5Y细胞)的修复作用，并探讨其作用机制。方法 将SH-SY5Y细胞分为对照组、诱导组、模型组、梓醇组。对照组：SH-SY5Y细胞不做任何处理；诱导组：用ATRA诱导SH-SY5Y细胞72 h，将其诱导为成熟神经元；模型组：ATRA诱导SH-SY5Y细胞72 h后，将完全培养基换成无糖的EBSS溶液置于三气培养箱（氧气1%，二氧化碳5%，氮气94%）4 h，氧糖剥夺结束后换回完全培养基（含糖），复氧12 h；梓醇组：细胞经模型组同样处理后，加入含不同浓度梓醇（50、100、200μmol/L）的完全培养基常规培养72 h。采用CCK-8法检测各组细胞的活力；细胞划痕实验观察细胞的迁移、穿越能力；β-Ⅲ-tubulin免疫荧光染色标记轴突，并测量其长度；Western blotting法检测细胞中神经生长相关蛋白（GAP43）、骨桥蛋白（OPN）、磷酸化的胰岛素生长因子1受体（p-IGFR）、抑癌基因（PTEN）、雷帕霉素分子靶点（mTOR）、磷酸化核糖体S6蛋白（p-S6）。结果 与对照组相比，诱导组存活...     

依达拉奉对骨髓间充质干细胞诱导分化后神经元样细胞生长状态的影响

目的探讨依达拉奉对骨髓间充质干细胞（MSCs）诱导分化后神经元样细胞生长状态的影响。方法MSCs由正常成年人骨髓经密度梯度离心加贴壁培养法获得，取第（4～6）代MSCs以1Mm二巯基乙醇（BME）预诱导24h后，用丁羟基茴醚（BHA）、二甲基亚砜（DMSO）和不同浓度依达拉奉诱导分化，采用免疫细胞化学法鉴定神经细胞特异性抗原标记神经元特异性烯醇化酶（NSE）和微管相关蛋白-2（MAP-2）的表达。唑盐比色实验（MTT）法检测诱导前和诱导后0，5h、6h、24h、3d细胞生长情况。结果成功分离培齐人MSCs，诱导分化后大部分MSCs变成神经元样细胞并表达NSE和MAP-2。依达拉奉组诱导后的细胞生长能力较好。结论依达拉奉能使诱导后的细胞保持较好的生长状态．减少凋亡细胞数量。     

体外诱导骨髓基质细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的观察大鼠骨髓基质细胞（MSCs）的生长特点及在体外诱导条件下分化为神经元样细胞的能力，并寻找最佳诱导时间。方法无菌条件下，收集大鼠股骨骨髓，分离出MSCs进行培养、扩增、纯化。用神经妥乐平（NT）进行诱导。在不同时间用巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染色鉴定阳性细胞。结果MSCs经诱导后呈神经元样形态。免疫组化鉴定显示Nestin阳性细胞表达在诱导第3天时最多，为48．20％&#177;5．61％，NSE阳性细胞表达在第5天时最多，为31．50％&#177;7．32％。结论MSCs在体外诱导条件下可经神经前体细胞转化为神经元样细胞，且第5天为最佳诱导时间。     

DNA病毒和RNA病毒对宿主细胞糖酵解的调控机制研究进展

病毒需要利用宿主细胞为其复制提供原料。人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）、单纯疱疹病毒（Herpes simplex virus,HSV）、卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV）、EB病毒（Epstein-barr virus, EBV）和腺病毒（Adenovirus, AdV）等DNA病毒和丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）、登革病毒（Dengue virus, DENV）、人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）和甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）等RNA病毒均可通过诱导宿主细胞糖酵解，为病毒复制和组装提供能量。DNA病毒HCMV可通过促进钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶表达、抑制葡萄糖转运蛋白1(Glucose transporter 1, GLUT 1)表达，诱导宿主细胞糖酵解，参与早期病毒复制；HSV可能通过激活糖酵解途径限速酶，诱导宿主细胞糖酵解，促进病毒核苷酸的合成；KSH...     

原代骨髓基质细胞联合细胞因子体外诱导ES-D3细胞造血分化的研究

目的：研究原代骨髓基质细胞联合细胞因子（VEGF，SCF和TPO）体外诱导ES-D3细胞造血分化的效率，探讨体外高效诱导胚胎干细胞生成造血干／祖细胞的方法。方法：取6～8周昆明鼠骨髓制备小鼠骨髓基质细胞（BMSC）饲养层。采用二步诱导法，先将ES-D3细胞诱导分化为拟胚体（EB），再将EB置于4种体系下诱导分化造血干／祖细胞；第1组：自发分化对照组；第2组：细胞因子组（VEGF加SCF加TPO）；第3组：BMSC饲养层组；第4组：BMSC饲养层加细胞因子组（BMSC加VEGF加SCF加TPO）。诱导分化1周的部分细胞行造血祖细胞集落培养。流式细胞仪检测诱导培养7d和14d的各组细胞中干细胞特异抗原（CD34）、祖细胞特异抗原（c-kit）、粒细胞表面抗原（CD11b）、红系细胞特异抗原（Ter119）阳性表达率。间接免疫荧光染色法显示CD34、c-kit、CD11b、Te〉119阳性细胞。RT-PCR检测造血转录因子GATA-2、FIk-1、SCL、p-H1和p-major珠蛋白的表达。结果：诱导7d生成的细胞均表达造血CD34和Pkit，诱导14d生成的细胞表达单核巨噬细胞、CD11b和Te〉119，且诱导细胞表达造血转录因子（GATA-2、SCL、β-H1、β-major）基因mRNA，培养在特定条件下可形成造血祖细胞集落。从生成造血细胞和造血集落的数量分析，骨髓基质细胞饲养层与细胞因子合用时诱导效率明显高于单用组和对照组（P〈0．05或0．01）。结论：骨髓基质细胞饲养层与细胞因子合用，体外可以促进ES-D3细胞的早期造血分化，产生的造血前体细胞可进一步形成造血集落并分化成熟，表达与造血转录和早期造血分化相关的基因。     

日本血吸虫可溶性成虫抗原及虫卵抗原对CD4+ T 细胞分化的影响

目的 目的 观察并比较日本血吸虫可溶性成虫抗原 （SWA） 及虫卵抗原 （SEA） 在诱导CD4+ T细胞分化中的不同作用。 方法 方法 分别用SWA、 SEA免疫C57BL/6小鼠后分离脾细胞， 或用SWA、 SEA体外刺激正常小鼠来源的脾细胞后， 采用流式细胞术 （FCM） 检测脾细胞中产生IFN?γ及IL?4的细胞比例， 以及CD4+ T细胞中Th1、 Th2细胞亚群的比例。 结果 结果 SWA比SEA更能优势诱导CD4+ T细胞产生IFN?γ （P < 0.05），SEA比SWA更能优势诱导CD4+ T淋巴细胞产生IL?4 （P < 0.05）。结论 结论 SWA较SEA更能优势诱导Th1细胞分化， SEA较SWA更能优势诱导Th2细胞分化。     

芪丹通脉片调节TLR4信号通路抑制巨噬细胞泡沫化的研究

目的 观察益气活血中药芪丹通脉片对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的RAW264.7细胞泡沫化进程、炎症指标及Toll样受体（TLR）4信号通路的影响。 方法 培养RAW264.7细胞，随机分为对照组、ox-LDL组及ox-LDL +芪丹通脉片（QDTM）组，各组细胞干预后进行泡沫化诱导，分析各组细胞油红染色阳性面积，计算各组细胞泡沫化诱导率，收集细胞，ELISA法检测炎性因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白介素（IL）-6、C反应蛋白（CRP）表达水平，Real-time PCR及Western blot分析TLR4、分子核因子（NF）-κB表达水平。 结果 与对照组相比，ox-LDL组细胞泡沫化诱导率、TNF-α、IL-6、CRP水平显著升高（P < 0.05），TLR4、NF-κB表达水平明显上调，QDTM干预后，ox-LDL+QDTM组细胞泡沫化诱导率及TNF-α、IL-6、CRP水平较ox-LDL组显著下调（P < 0.05），同时TLR4、NF-κB表达水平较ox-LDL组明显下降。 结论 QDTM能抑制TLR4信号通路及炎症反应、降低RAW264.7细胞泡沫化诱导率，抑制巨噬细胞泡沫化。     

血流影响下内皮细胞与平滑肌细胞的交互作用

血管壁的内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(SMCs)的交互作用对维持血管功能和动脉粥样硬化(AS)的发生发展有着重要意义。局部血流动力学环境,尤其是流体剪切力(FSS)与血管壁之间的相互作用对AS斑块的分布起着重要作用。FSS下ECs和SMCs的交互作用会对ECs和SMCs的形态和表型、增殖和迁移、炎性细胞的黏附产生影响。本文主要对FSS下ECs和SMCs的交互作用作一综述。     

60Co源照射诱导肺癌细胞凋亡及其凋亡小体体外负载自体及同种异体树突状细胞的实验研究

目的通过放射线诱导肺癌细胞凋亡小体，并使其在体外负载自体及同种异体树突状细胞（DC），为诱导特异性肿瘤细胞免疫治疗提供大量抗原提呈细胞。方法手术切除肺癌组织并分离培养肺癌细胞；利用免疫组化法鉴定肺癌细胞；利用60^Coγ射线照射肺癌细胞诱导凋亡小体；通过流式细胞术（FCM）、DNA琼脂糖凝胶电泳（直接上样法）法检测细胞凋亡；应用共同孵育法使自体及同种异体DC体外负载肺癌细胞凋亡小体，并进行扫描电镜观察。结果通过组织分离法获得单个肿瘤细胞，经60^Coγ射线照射可诱导大量凋亡小体，和自体及同种异体DC共孵育后，凋亡小体被DC吞噬或包裹。结论60^Coγ射线照射诱导的凋亡小体可作为抗原负载自体及异体DC用于诱发特异性抗肿瘤免疫反应，为肿瘤的主动免疫治疗提供了新的途径。     

大鼠胎血与骨髓间充质干细胞分化能力的体外研究

目的：比较大鼠胎血和骨髓中间充质干细胞（MSC）体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同。方法：采用标准Ficoll-hypague技术分离大鼠胎血骨髓的单个核细胞（MNC），收获MSC传代培养，流式细胞仪检测细胞的免疫表型。β-巯基乙醇、二甲基亚砜、叔丁基对羟基茴香醚诱导MSC向神经元分化，免疫细胞化学法检测其特异性标志巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：2种MSC细胞形态、免疫表型无明显差异。定向诱导后，2种细胞均表达Nestin、NSE，但GFAP阴性。结论：大鼠胎血和骨髓MSC的细胞形态、生物学特性无明显差别；两者诱导分化为神经元碰细胞的能力无显著差异。胎血应是MSC的又一来源。