ISA720与CpG联合佐剂增强恶性疟原虫抗原的免疫原性

目的评价CpG佐剂对以PfCP-2．9f/ISA720佐剂为基础的联合疟疾抗原的免疫原性。方法使用ISA720及ISA720＋CpG佐剂与恶性疟原虫抗原制备制剂,免疫BALB／c小鼠,考察不同佐剂增强免疫的效果。通过检测免疫血清中特异性IgG的水平、识别天然抗原的能力、分析特异性IgG的亚类分布等指标进行评价。结果CpG佐剂显著提升了联合疟疾抗原在BALB／c小鼠中产生特异性抗体的量（P〈0．01）,免疫血清能有效识别红内期疟原虫天然抗原,IFA滴度显著提高（P〈0．01）,IgG亚类分析显示该佐剂能有效刺激小鼠产生针对PfCP-2．9和Pfclet-3的多种IgG亚类抗体。结论CpG显著提高了联合疟疾抗原的免疫原性。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3功能区片段的制备及其免疫原性分析

目的构建恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3功能片段MSP3(69)与谷胱甘肽(GST)的融合蛋白,并在大肠杆菌中进行表达,分析其免疫原性。方法采用大肠杆菌系统表达融合蛋白GST-MSP3(69),以疟疾病人血清进行Western-blot,并以ISA720、佛氏、氢氧化铝与CpG联合3种佐剂与GST-MSP3(69)融合蛋白乳化,免疫Balb/ca小鼠,分析其免疫原性。结果在大肠杆菌系统中成功表达GST-MSP3(69)融合蛋白,疟疾病人血清能与融合蛋白反应。3种佐剂免疫Balb/ca小鼠均能诱发Balb/ca小鼠产生较高水平的特异抗体,3次免疫后的抗体滴度分别为4.5×105,4.1×105和3.5×105。3次免疫后血清抗体亚型分析显示该蛋白能够诱导Balb/ca小鼠产生较高滴度的亲细胞亚型IgG1和IgG2b,ISA720、佛氏、氢氧化铝与CpG联合佐剂组IgG1分别为8×104、7.8×104、6.8×104,IgG2b分别为1.2×104,1.25×104、1.5×104。统计学分析显示不同佐剂组的抗体滴度及抗体亚型滴度之间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论制备了在大肠杆菌表达的GST-MSP3(69)融合蛋白,该蛋白具有高免疫原性,并产生亲细胞亚型抗体,这些为研究MSP3蛋白功能区的免疫保护作用打下了基础。     

恶性疟原虫多价重组疫苗的研制及其免疫活性的初步鉴定

为了探讨含Ｔ、Ｂ淋巴细胞双重激活表位的重组复合症疾抗原的免疫原性和保护作用，作者设计合成了编码恶性疟原虫红内期３个保护性抗原位点和２个外源性Ｔ细胞激活位点的复合基因ＨＧＦＣ，并构建了多连体复合基因ＨＧＦＣＡＣ。两种复合基因分别与表达载体ｐＷＲ４５０－１重组，并在大肠杆菌中表达出含外源蛋白和β－半乳糖苷酶部分氨基酸的融合蛋白（分子量分别为６５０００和７７０００），表达量为３５％。表达产物可与小鼠及兔抗恶性疟原虫抗体发生特异性免疫反应。用纯化的融合蛋白免疫家兔制备的免疫血清可特异地识别恶性疟原虫抗原，并对疟原虫体外生长有显著抑制作用。抑制程度与免疫血清浓度及作用时间呈正相关，在２０％浓度下作用７２小时，抑制率可达８２％，并引起疟原虫发育不良和死亡。研究结果说明，制备的恶性疟原虫重组复合抗原具有免疫原性和一定的免疫保护作用，可作为恶性疟疫苗候选物。     

恶性疟原虫体外抑制实验方法的改进

以恶性疟原虫融合抗原PfCP-2.9免疫兔血清为待测血清,将起始原虫率从1%降至0.2%～0.5%,采用2种方法作对比,即一组每24 h更换培养液、加入免疫血清,另一组72 h内不更换培养液也不加免疫血清试验方法.培养至72 h,涂片,油镜下计数,计算原虫感染率和抑制率.结果2组的抑制率相近,经统计分析无显著差异.测定不同剂量抗原免疫血清的抑制率,结果显示抑制率与免疫血清中特异抗体滴度呈正相关,2种方法的结果无显著差异.研究表明通过降低起始原虫率可将常规体外抑制实验由需每天换液改为72 h不换液.     

修饰后日本血吸虫Sjc-97基因的真核表达及其免疫原性

目的:研究日本血吸虫大陆株副肌球蛋白基因第3区域片段(Sjc-97f3)毕氏酵母表达产物的免疫原性.方法:根据毕氏酵母密码子使用频率重新设计Sjc-97核苷酸序列,依据不对称PCR原理人工合成Sjc-97f3,并在毕氏酵母中表达.表达产物通过Ni-NTA亲和层析和凝胶过滤层析方法纯化,再分别与ISA720和Al(OH)3佐剂乳化后,免疫C57BL/6和昆明小鼠,通过尾蚴膜反应和ELISA反应检测特异性抗体.结果:Sjc-97f3基因在毕氏酵母中获得了高水平分泌表达,其表达产物能与日本血吸虫免疫血清进行特异性免疫反应.经与佐剂乳化后,该蛋白具有良好的免疫原性.ELISA结果显示重组蛋白在小鼠体内可激发明显的抗体反应,但2种佐剂所诱导的抗体水平以ISA720佐剂为高; 该抗原在不同品系小鼠中的抗体水平存在显著差异(P<0.01),昆明鼠的抗血清滴度远高于C57BL/6小鼠.小鼠免疫血清能识别日本血吸虫表面抗原,产生特异的尾蚴膜反应. 结论:密码子优化的Sjc-97f3在毕氏酵母中获得高效表达,其产物具有良好的免疫原性.     

竞争ELISA法分析恶性疟原虫单克隆抗体的识别表位

目的分析6株恶性疟原虫PfCP-2.9融合抗原的单克隆抗体识别相同或相关表位情况。方法以PfCP-2.9重组蛋白为抗原进行ELISA板包被,用辣根过氧化物酶分别标记6株PfCP-2.9单克隆抗体,并以此作为竞争检测抗体,与这6株未标记的单抗进行相互之间的竞争检测。结果根据竞争ELISA结果可将6株单抗分为2组,2组单抗之间无竞争,而在各组内的单克隆抗体发生相互之间的竞争。结论存在相互竞争的单抗可能识别同一表位或相关表位,研究结果为表明这些单抗识别特性提供信息。     

恶性疟原虫FCC-1/HN株DNA疫苗 在小鼠体内的免疫反应

:【目的】探讨恶性疟原虫DNA疫苗在小鼠体内的免疫反应。【方法】将恶性疟原虫FCC 1/HN株重组质粒pcDNA3 Pfs2 5及 pcDNA3 EBA175 /HRPⅡ经骨骼肌途径分别单独注射或两者混合注射免疫BALB/c小鼠 ,观察免疫后不同时间点血清中IgG抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、CD4 /CD8 T细胞亚群比值和NK细胞杀伤活性的变化。【结果】pcD NA3 EBA175 /HRPⅡ与 pcDNA3 Pfs2 5分别单独肌肉注射或两者混合肌肉注射免疫小鼠后 ,均可见血清IgG抗体滴度增高 ;针对恶性疟原虫抗原的特异性T淋巴细胞增殖反应增强 ;CD4 /CD8 T细胞比率下降以及NK细胞杀伤活性增强。【结论】提示肌肉注射为一有效的DNA疫苗免疫途径 ,采用编码恶性疟原虫有性期阶段或无性红细胞阶段的重组质粒单独或两者混合免疫小鼠 ,均能诱导明显的体液免疫反应、细胞免疫反应和NK细胞杀伤活性。     

恶性疟原虫FCCL/HN株CSP基因表达产物免疫鼠体内抗原定位研究

目的用恶性疟原虫FCC1/HN株CSP基因表达产物免疫小鼠,观察其在宿主体内各组织的抗原分布情况.方法提取目的基因PfCSP在HeLa细胞中的表达产物,免疫注射BALB/c小鼠.取免疫后4周及7周小鼠心脏、肝脏、脑、脾及肌肉,通过免疫酶组织化学法及间接免疫荧光法检测组织内的抗原.结果免疫7周后的BALB/c小鼠肝脏组织枯否氏细胞内及肝细胞膜上可见棕黄色特异性抗原-抗体反应,而免疫鼠心、脑、肌肉未出现明显的阳性反应.结论恶性疟原虫FCC1/HN株CSP基因表达蛋白能被肝实质细胞特异性识别,其免疫后的抗原分布主要在肝脏.     

重组恶性疟原虫红细胞结合抗原175功能区的制备及联合免疫

目的:全合成恶性疟原虫eba-175Ⅱf2基因并在毕氏酵母中进行高效分泌表达,用该重组蛋白与我室研制的疟疾疫苗候选抗原PfCP-2.9进行联合免疫以观察是否存在竞争性免疫抑制.方法:采用不对称PCR法拼接合成eba-175Ⅱf2基因(959 bp),用电转化方法将合成基因导入毕氏酵母中并进行诱导表达,采用离子交换层析和分子筛层析纯化EBA-175ⅡF2蛋白.结果:全合成eba-175Ⅱf2基因在毕氏酵母中高效分泌表达.重组EBA-175ⅡF2和PfCP-2.9联合免疫后,以ELISA 和IFA检测,针对2个蛋白联合免疫的抗体滴度明显高于2个蛋白单独免疫的滴度.结论:重组EBA-175ⅡF2和PfCP-2.9联合免疫时不存在竞争性免疫抑制,这2个重要的疟疾疫苗候选抗原具有潜在联合应用前景.     

EBV编码潜伏膜蛋白2A抗原表位的串联表达及其免疫原性分析

目的:制备具有免疫原性的EB病毒潜伏膜蛋白2A (latent membrane protein 2A,LMP2A)的表位串联蛋白并分析其免疫学特性?方法:用DNAstar软件分析LMP2A的抗原表位,将预测的免疫原性较强的两个表位通过基因合成串联在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,经大肠杆菌BL21表达并纯化?制备的含LMP2A表位重组蛋白经SDS-PAGE?Western blot鉴定后,免疫小鼠制备多克隆抗体,以ELISA检测抗体的效价,免疫组织化学法检测该抗体对天然LMP2A的特异性?结果:通过原核表达与纯化,获得高纯度的表位融合蛋白,经小鼠免疫并制备效价高且特异性的小鼠抗LMP2A的多克隆抗体,该抗体可用于ELISA和免疫组织化学分析?结论:本研究制备的表位融合蛋白,具有天然抗原的免疫原性,可制备能特异性识别天然LMP2A分子的多克隆抗体,为利用表位融合蛋白筛选全人源基因工程抗体奠定了基础?     

白细胞介素-12和白细胞介素-18质粒对HBcAgDNA疫苗诱导小鼠(H-2d)体液免疫应答的影响

目的：观察编码白细胞介素（IL）－12和IL－18的真核表达载体[pcDNA3.1/IL-12(以下简称IL－12质粒）和pcDNA3.1/IL-18(以下简称IL－18质粒）]对HBcAg DNA疫苗（pJW4303/HBc)诱导BalB/c(H-2^d)小鼠免疫应答的影响。方法：肌肉注射接种IL－12质粒、IL－18质粒和HBcAg DNA疫苗，ELISA法检测小鼠血清抗HBc IgG亚类（IgGl,IgG2a)水平。结果：免疫6周后，联合注射IL－12、IL－18和IL－12＋IL－18组小鼠血清的抗HBc终点滴度均明显高于单纯注射HBcAg DNA疫苗组小鼠（P＜0．05），抗HBc IgG亚类以IgG2a占优。结论：IL－12、IL－18以及IL－12＋IL－18联合HBcAg DNA疫苗注射能够提高小鼠血清中抗HBc水平。     

恶性疟疾多价疫苗的构建及表达

目的 构建恶性疟原虫多表位融合抗原基因(PfCP2E9),并在毕氏酵母中进行高效分泌表达.方法 选取本实验室前期构建的融合蛋白PfCP-2.9与疟原虫红内期疫苗候选抗原EBA175IIF2,按一定的次序拼接成该融合基因,并克隆至酵母表达载体,用电转化方法将拼接基因导入毕氏酵母中进行分泌表达.结果 拼接的基因在毕氏酵母中高水平分泌表达.结论 构建的恶性疟原虫多表位融合抗原基因能在毕氏酵母中高水平分泌表达,为探讨其免疫学功能及作为多价联合疫苗的成分提供了基础.     

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

OBJECTIVE: To prepare a monoclonal antibodies (mAbs) against glutamate dehydrogenase (GDH) of Plasmodium falciparum (FCC1/HN strain) and establish colloidal gold-immunochromatographic assay (GICA) for diagnosis of Plasmodium falciparum malaria. METHODS: Recombinant GDH was used to immunize Balb/C mice and the mAbs against GDH were prepared using hybridoma technique followed by identification of IgG isotype and its affinity. Protein-G affinity chromatography was employed to purify the antibodies, which were labeled with colloidal gold for establishment of GICA for Plasmodium falciparum detection. RESULTS: Six mAbs were obtained and identified as IgG1(kappa) of IgG isotypes with affinity constants (Kaff) ranging from 1 x 10(-8) to 2.8 x 10(-10). GICA had a sensitivity of 86.66%; and specificity of 96.43%; for Plasmodium falciparum detection compared with routine microscopic examination. CONCLUSION: The established GICA is rapid and accurate for Plasmodium falciparum detection with such potential utility as for instant diagnosis of Plasmodium falciparum malaria.     

Immune responses to the expressed products of the CSP antige n gene of Plasmodium falciparum southern China isolate FCC1/HN in Hela cell

Objective To construct a eukaryotic expression system with pcDNA3-PfCSP/Hela for the Circ umsporozoite protein (CSP) gene of Plasmodium falciparum (P.falciparum), t o observe the immune responses in BALB/c mice induced by the expressed proteins .Methods The recombinant plasmid pcDNA3-PfCSP was transformed into the Hela cell line. The expressed protein was isolated and analyzed by using SDS-PAGE and used for immunization of BALB/c mice by subcutaneous, intravenous, and intraperitone al adminstration.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), Dot-ELISA, Wester n blot, T lymphocyte proliferation test, natural killer cell(NKC) activity assay , and CD4(+) and CD8(+) T cell detection were used for observation of humoral an d cellular immune responses.Results Immune sera strongly reacted with the expressed protein, antibody titer was up to 1∶6400 as detected by ELISA.Western blot analysis revealed a specific b and at 38.3 Kda.When the spleen cells of normal and immunized BALB/c mice we re specifically stimulated with expressed protein, the optical densities were 0 .12±0.03 and 0.34±0.04, respectively.The latter were significantly highe r than the former (P&lt;0.01).We used the MTT colorimetric assay to measure NKC activity of mice spleen.The results showed that the NKC activity of immuni zed BALB/c mice was remarkably higher than that of the controls (P&lt;0.05). CD4(+) and CD8(+) T cells were detected by using monoclonal antibody immunofluor escence methods.The results showed that the percentage of CD4(+) and CD8(+) T cells of immunized group were significantly higher than that of control group ( P&lt;0.05).Conclusions The humoral and cell-mediated immune responses and elevated NKC activity to pr oducts made with a eukaryotic expression system could be specifically detected i n BALB/c mice.These findings indicate that the expressed protein could enhance the immune function in mice.     

Immune responses to the expressed products of the CSP antigen gene of Plasmondium falciparum south in China isolate FCC1/HN in Hela cell

Immune responses to the expressed products of the CSP antigen gene of Plasmondium falciparum south in China isolate FCC1/HN in Hela cell@Yu XB @Liu YW @Luo SH     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的 制备抗恶性疟原虫EBA-175的单克隆抗体(McAb),为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法 以恶性疟原虫EBA-175(II区F2段)重组抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。结果 筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4A1、4C3、4H9,6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1,1株为IgG2a,6株McAb的培养上清ELISA效价为1:256~1:512,腹水效价为1:12800~1:25600,间接ELISA显示其中4株McAb1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合,而只有1F3、4A1、4H9在Westernblot试验中识别恶性疟原虫M_r约35000的虫源蛋白。结论 获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

抗恶性疟原虫EBA-175单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的制备抗恶性疟原虫EBA—175的单克隆抗体（McAb），为恶性疟原虫的诊断及疫苗研究奠定基础。方法以恶性疟原虫EBA-175（Ⅱ区F2段）重组抗原免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，间接ELISA筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株．测定其免疫球蛋白亚类及其效价，ELISA、Western blot试验分析其特异性。结果筛选获得6株稳定分泌抗重组EBA-175McAb的杂交瘤细胞株1F3、2E8、2H5、4Al、4C3、4H9，6株McAb经鉴定其亚类5株为IgG1，1株为IgG2a，6株McAb的培养上清ELISA效价为1：256～1：512，腹水效价为1：12800-1：25600，间接ELISA显示其中4株McAb 1F3、2H5、4A1、4H9能与恶性疟原虫抗原发生特异性结合，而只有1F3、4A1、4H9在Western blot试验中识别恶性疟原虫Mr约35000的虫源蛋白。结论获得了能稳定分泌高特异性抗EBA175McAb的杂交瘤细胞。     

乙型肝炎病毒核心抗原基因疫苗对小鼠的体液和细胞免疫原性观察

目的 观察不同品系小鼠（Ｈ－２＾ｂ,Ｈ－２＾ｄ）经乙型肝炎病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇ）基因疫苗免疫后特异性辅助性Ｔ细胞反应类型和特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。方法 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法鉴定该基因疫苗的体外表达产物;基因枪法和肌内注射法接种该基因疫苗;间接ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢｃ ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）水平;＾５１铬释放法测定小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性细胞毒性Ｔ细胞活性。结果