TthDNA聚合酶在丙型肝炎病毒RNA检测中的应用

用ＴｔｈＤＮＡ聚合酶行逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增丙型肝炎病毒（ＨＶＣ）５′端非编码序列，对２６２例肝炎患者血清进行ＨＣＶＲＮＡ测定，结果ＨＣＶＲＮＡ阳性者５３例，阳性率２０．２％，凡阳性者用酶联免疫吸附法测其抗ＨＣＶＩｇＧ，其中３０例测到抗ＨＣＶ，阳性重叠率５６％（３０／５３）；ＨＣＶ ＲＮＡ阳性中的１５例同时用成髓细胞瘤病毒酶行传统逆转录－套式聚合酶链反应检测对照，１４例阳性，符合率     

逆转录PCR检测丙型肝炎病毒RNA

丙型肝炎病毒(HCV)是单股正链RNA病毒，流行病学研究表明大约90％的输血后肝炎均由HCV引起，原发性肝癌的发生也与HCV感染相关。目前HCV的实验室诊断主要依靠抗HCVIgG检测，但急性期抗体检出率仅能达到60％，部分病例可呈阴性反应。由于HCV在血液及肝组织中的感染滴度很低，因此采用一般的核酸分子杂交技术难于检出HCVRNA。目前开展HCV基因扩增方法直接检测HCVRNA，以期达到早期．灵敏．特异性诊断目的。     

逆转灵—套式聚合酶链反应检测丙型肝炎病毒RNA

采用逆转录－套式聚合酶链反应检测２８０例疑为ＨＣＶ感染的病人血清，并同时做抗－ＨＣＶ－ＩｇＧ检测。结果５１例ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性，其中２６例抗ＨＣＶ－ＩｇＧ阳性；在２５４例抗ＨＣＶ－ＩｇＧ阴性血清中有２５例ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性。     

逆转录PCR检测丙型肝炎病毒RNA

逆转录ＰＣＲ检测丙型肝炎病毒ＲＮＡ王捷，杨太成，江悦华，王晓怀（广州军区总医院医学实验科，５１００１０）丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）是单股正链ＲＮＡ病毒，流行病学研究表明，大约９０％的输血后肝炎均由ＨＣＶ引起，原发性肝癌的发生也与ＨＣＶ感染相关［１］。目前...     

酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物

建立一灵敏，快速的检测丙型肝炎病毒逆转录－套式聚合酶链反应产物的酶免疫法。方法，对第２次ＰＣＲ所用的引物进行双标记，使扩增产物同时被修饰有生物一不和荧光素成分，再经过固相的链亲合素进行捕获，辣根过氧化酶记的抗－ｆｌｕｏｒｅｓ－ｃｅｉｎ反应后显色测定     

丙型肝炎病毒RNA非结构区套式聚合酶链反应

目的探讨不同引物对ＨＣＶＲＮＡ检出率的影响，建立敏感的ＮＳ５区基因扩增技术。方法选择不同引物，采用非结构５（ＮＳ５）区套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）及联合式「ＨＣＶ非编码区（５ＮＣＲ）与ＮＳ５联合」技术检测１０例抗ＨＣＶ阳性献赠及３７例输血后丙型肝炎患 血清ＨＣＸＶＲＮＡ。结果 １０例抗ＨＣＶ阳性一献血员应用联合式ＰＣＲ，以ＮＳ５－３＋ＮＳ５－４、ＳＦ２＋ＮＳ５－４、Ｋ１＋ＮＳ５－４、ＮＳ５－１＋ＮＳ     

逆转录聚合酶链反应检测血清中丙型肝炎病毒RNA

本文用本所自己合成的引物，对３０份怀疑ＨＣＶ感染血清进行ＨＣＶＲＮＡＲＴ－ＰＣＲ检测。该３０份血清中，２２份抗－ＨＣＶ阳性，其中１８份ＨＣＶＲＮＡ为阳性，８份抗－ＨＣＶ阴性血清及怀疑阳性血清中，２份ＨＶＣＲＮＡ为阳性。结果提示，抗－ＨＣＶ抗体试剂盒用于检测急性ＨＣＶ感染有其不足之处，结合ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ的方法可提高急性ＨＣＶ感染的检出率。     

丙型肝炎病毒RNA非结构区套式聚合酶链反应

目的探讨不同引物对ＨＣＶＲＮＡ检出率的影响，立敏感的ＮＳ５区基因扩增技术。方法选择不同引物，采用非结构５（ＮＳ５）区套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）及联合式［ＨＣ非编码区（５′ＮＣＲ）与ＮＳ５联合］ＰＣＲ技术检测１０例抗ＨＣＶ阳性献血员及３７例输血后丙型肝患者的血清ＨＣＶＲＮＡ。结果１０例抗ＨＣＶ阳性献血员应用联合式ＰＣＲ，以ＮＳ５－３＋ＮＳ５－４、ＳＦ２＋ＮＳ５－４、Ｋ１＋ＮＳ５－４、ＮＳ５－１＋ＮＳ５－４引物及套式ＮＳ５－１＋ＮＳ５－４引物扩增时，其ＲＮＡ检出率分别为５／１０、６／１０、７／１０、８／１０和９／１０；而３７例输血后丙型肝炎患者中３５例ＲＮＡ阳性，检出率为９５％，其中１８例１ｂ型和１９例２ａ型样品的检出率分别为１００％和８９％。结论ＨＣＶＮＳ５区的ＲＮＡ检出率与引物的选择有关     

应用逆转录套式PCR检测血清丙型肝炎病毒RNA

应用逆转录套式PCR检测了经ELISA检测抗－HCV的86份血清，抗－HCV阳性血清66份，用PCR检测有37份是阳性，阳性符合率为56．1％，抗－HCV阴性血清20份，用PCR检测有8份是阳性，两种方法检测结果总符合率为57．0％。单项ALT升高、HB、HC和血液病患者HCV、RNA阳性率分别为37．5％，55．6％，62．5％和53．8％。用PCR检出HCV－RNA时间早于抗－HCV阳转时间，而且敏感性高于后者，是一种早期、灵敏及特异的HCV感染诊断方法。检测HCV－RNA有助于发现抗－HCV阴性的急、慢性丙型肝炎，根据HCV－RNA的连续检测，结合抗－HCV的消长状态，可用于丙型肝炎的预后判断和干扰素等药物疗效评价指标。     

酶免疫法检测丙型肝炎病毒RNA的聚合酶链反应产物

目的建立一灵敏、快速的检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ逆转录－套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）产物的酶免疫法。方法对第２次ＰＣＲ所用的引物进行双标记，使扩增产物同时被修饰有生物素和荧光素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）成分，再经过固相的链亲合素进行捕获、辣根过氧化物酶标记的抗－ｆｌｕｏｒｅｓ－ｃｅｉｎ反应后显色测定。结果所建立的方法与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳法相比灵敏、快速、准确，结果判断客观，重复性也较好；所测结果可反映ＰＣＲ产物量的多少，但不能准确表示模板量的大小。结论建立的方法可取代电泳法而成为ＨＣＶＲＮＡ常规ＰＣＲ反应产物的检测技术。     

特异核酸捕获RT-PCR技术建立及在HCV RNA检测中的应用

目的 解决ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ方法的重复性较差问题,使其成为常规实验室检测方法。方法 采用亲合素生物素系统将ＨＣＶ特异的核酸片段包被在微孔板上,利用特异核酸捕获样本中的ＨＣＶＲＮＡ然后进行逆转录和ＰＣＲ扩增,从而建立了特异核酸捕获ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＣＶＲＮＡ方法,并与酶消化法和抽提法进行比较,评价其敏感性、特异性、重复怀及抗污染能力。结果 特异性核酸获ＲＴ－ＰＣＲ获得的电要带较为清晰,其特     

改良二氧化硅吸附法检测丙型肝炎病毒核酸

建立了改良二氧化硅吸附法检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ的方法。将待检血清５０μｌ、二氧化硅悬液２０μｌ、裂解液３００μｌ（含硫氰酸胍、ＥＤＴＡ、ＴｒｉｔｏｎＸ—１００、Ｔｒｉｓ·Ｃｌ）混匀置室温６０分钟，病毒颗粒裂解释放的核酸吸附在二氧化硅颗粒上，经离心和双蒸水洗脱，所得ＨＣＶＲＮＡ模板以５＇ＮＣ区引物作套式聚合酶链反应扩增。使用该方法可检出１０μｌ血清中的ＨＣＶＲＮＡ。１１０份抗－ＨＣＶ阳性血清中ＨＣＶＲＮＡ的检出率为８２．７％。实验全过程约７小时，为丙型肝炎检测提供了快速、简便、灵敏的新方法。     

标准物质在乙型和丙型肝炎病毒核酸检测标准化中的重要性

病毒核酸是HBV和HCV感染诊断和治疗监测的重要标志物，病毒核酸标准物质是不同实验室间检测结果可比性、试剂溯源性、测量程序的评价和质量控制的物质基础。无生物传染危险性且稳定的标准物质的研究是HBV和HCV核酸检测标准物质的发展方向。     

实时荧光逆转录PCR检测戊型肝炎病毒RNA的临床应用

目的 探讨实时荧光逆转录(RT)-PCR方法检测急性戊型肝炎患者血清戊型肝炎病毒(HEV)RNA的意义.方法 采用实时荧光RT-PCR方法,对HEV ORF3基因保守区进行扩增和检测.收集北京佑安医院住院和门诊434例急性戊型肝炎患者血清;甲型肝炎患者40例、乙型肝炎患者100例、健康献血员110名作为对照组;提取HEV RNA进行荧光RT-PCR检测.结果 434例急性戊型肝炎患者血清中232例(53.5%)为HEV RNA阳性.对照组血清HEV RNA检测均为阴性.与血清抗-HEV IgM检测比较,434例急性戊型肝炎患者HEV RNA检测的总符合率为67.1%,两种检测方法差异有统计学意义(Kappa=0.308,P=0.000).5例患者的首份血清检测为HEV RNA阳性,但抗-HEV IgM为阴性,系列追踪检测,相继出现抗-HEV IgM阳性.急性戊型肝炎患者的血清HEVRNA的检出多在发病的2～10 d内.结论 荧光RT-PCR方法有较高的特异性,应用实时荧光RT-PCR方法能对Ⅰ和Ⅳ戊型肝炎病毒感染的患者血清中的RNA进行定性检测.在临床使用可以提高对HEV早期诊断的水平.     

HCV核心抗原酶联免疫检测与HCV—RNA定量检测敏感性的比较

[目的]比较ELISA法测定总HCV—cAg与荧光定量PCR法测定HCV—RNA两种检测方法对诊断HCV感染的敏感性,分析HCV—cAg ELISA法诊断试剂的重要意义。[方法]ELISA法测定血清样本中的HCV抗体,改进型ELISA法测定血清样本中的HCV—cAg,实时荧光定量PCR法测定血清样本中的HCV—RNA,阳性样本经重复实验确认。[结果]通过用HCV抗体检测试剂对门诊病人或献浆员进行筛查,获得HCV抗体阳性血清样本264例。对这些病例别进行ELISA法测定总HCV—cAg实验和荧光定量PCR法测定HCV—RNA实验,测到HCV—cAg阳性病例101例,HCV—RNA阳性病例115例。经统计学分析,两种检测方法的敏感性差别不太大（0．01〈P〈0．05）。[结论]HCV—cAgELISA法检测和HCV—RNA定量检测具有相近的敏感性,日存某种稗序上HCV—cAg ELISA法榆测可以作为HCV—RNA定量榆测的有效替代。     

HCV RNA基因分型多色荧光PCR筛查和确认方法的建立

目的建立多色荧光丙型肝炎基因分型检测方法。方法针对HCV5＇NCR区特异性基因设计一对通用引物和Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ型特异性探针,Ⅰ型和Ⅲ型探针标记FAM荧光染料,Ⅱ/Ⅳ型标记VIC荧光染料,分别建立Ⅰ/Ⅱ型和Ⅲ/Ⅳ型两管双色荧光PCR扩增系统。分别采用测序和本研究方法对97份丙型肝炎阳性血清进行分型,比较两种方法分型结果的一致性,并对双色荧光法检测的2889例HCV分型结果进行分析。结果在97份丙型肝炎阳性血清中,双色荧光法分出Ⅰ型65例（67.0%）,Ⅱ型25例（25.8%）,Ⅲ型2例（2.1%）,Ⅰ/Ⅱ混合型3例（3.1%）,有2例HCVRNA定量为（1～3）×103IU/ml弱阳性标本未分出型;测序法分出Ⅰ型61例（62.9%）,Ⅱ型24例（24.7%）,Ⅲ型2例（2.1%）,Ⅰ/Ⅱ混合型2例（2.1%）,有8例HCVRNA定量结果为（1～5）×103IU/ml的阳性标本测序法未分出型,有1例Ⅰ/Ⅱ混合型标本测序无法判断,而荧光法分型明确。我院采用本研究建立的方法检测2889例临床丙型肝炎标本,2268份分出基因型,其中Ⅰ型1545例（68.1%）,Ⅱ型702例（31.0%）,Ⅰ/Ⅱ混合型18例（0.8%）,Ⅲ型3例（0.1%）,高HCV载量血清全部涵盖在Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型中,未发现Ⅳ型和其他型的病例。结论本研究建立的双色荧光HCV基因分型的方法具有良好的敏感性、特异性、可重复性且省时省力,由于近99%的HCV阳性血清为Ⅰ/Ⅱ型,所以临床可选择Ⅰ/Ⅱ型试剂进行常规检测,对高病毒载量而非Ⅰ/Ⅱ型的标本可采用Ⅲ/Ⅳ型试剂进一步分型明确。     

丙肝患者在治疗过程中血清RNA与抗HCV定量检测及其生化指标的相关性研究

目的比较不同实验诊断方法在丙型肝炎(丙肝)检测中的应用价值,了解丙型肝炎病人在治疗过程中HCV-RNA含量与血清ALT、前白蛋白、胆红素等生化指标变化的相关性。并探讨HCV RNA定量与ALT、PA、TBIL指标之间的关系。方法对57例丙型肝炎分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、增强化学发光法(CIA)和荧光定量聚合酶链反应(RFQ-RT-PCR)进行检测,应用AU2700型自动生化仪及其生化检测试剂检测全部标本ALT、PA、TBIL指标。结果ELISA、CIA及PCR方法检测样本丙肝阳性率分别为77.2%、78.9%和84.2%;三组χ2检验没有统计学意义,HCVRNA含量呈阳性的样本中,ALT异常率与HCVRNA含量间呈正相关P<0.01,而ALT数值的变化与HCV RNA含量并无相关性(P>0.05)。PA在治疗前后升高差异显著(P<0.05),可与HCVRNA、ALT联合监测丙肝治疗过程中肝功变化。结论 ELISA诊断试剂盒较CIA法检测丙肝抗体同样具有较高的灵敏度和准确性,在临床诊断中联合PCR检测HCVRNA能提高HCV感染诊断的阳性率;HCVRNA含量反映了病毒复制的活跃程度和患者的病程变化,并且在丙肝治疗进程中能与ALT、PA联合监测疗效。     

应用NASBA技术对献血者血浆/血清进行HCVRNA检测

目的　探讨对献血者混合血浆标本检测HCVRNA的必要性和可行性。方法　每 5 0份血浆混合为一组 ,用NucliSensExtractor提取核酸 ,以NASBA技术扩增HCVRNA和用ECL检测扩增产物。标本贮存 ,核酸提取、扩增、检测过程设立系统对照和阳性对照。结果　在抗 HCVELISA阴性的献血者 10 0 0 0人中发现 2例HCVRNA阳性。结论　用NASBA技术对混合血浆进行HCVRNA检测可有效控制输血后丙型肝炎的发生。