睾丸特异性表达GFP小鼠的繁殖及其表型鉴定

目的 繁殖睾丸特异性表达绿色荧光蛋白（GFP）小鼠,为进行小鼠生殖系统的研究提供有效的工具。方法 将Ddx4-cre转基因雄鼠与Rosa26mT/mG转基因雌鼠交配,通过Cre/loxP重组系统产生睾丸特异性表达GFP小鼠,利用分子、病理及活体成像的方法,从器官、细胞、分子水平上对该鼠进行表型鉴定。结果 分子水平的结果表明在这种小鼠的睾丸组织中发生了Cre酶介导的特异性基因重组;从器官水平上可以看到在这种小鼠的睾丸组织中具有GFP的表达;睾丸冰冻切片及精子荧光观察显示GFP主要表达于次级精母细胞、精子细胞和精子中。结论 睾丸特异性表达GFP小鼠繁殖成功。     

研究活细胞生命现象的新途径──绿色荧光蛋白基因的重组与表达

绿色荧光蛋白（ｇｒｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ，简称ＧＦＰ）是从发光水母（ＡｅｇｕｏｒｅａＶｉｃｔｏｒｉａ）分离出来的一种荧光蛋白，它在蓝光或近紫外光的激发条件下，不需加入任何反应底物就可发射绿色荧光，并由此而命名。纯化了的ＧＦＰ由２３...     

绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定

目的构建能表达绿色荧光蛋白的载体———pCDNA3.1-GFP。方法使用基因重组方法从质粒pGreenlantern中获取绿色荧光蛋白基因片段,克隆入PCDNA3.1的多克隆区,构建成PCDNA3.1-GFP,通过限制性核酸内切酶NotI与BamHI对所建质粒进行分析后,转染HepG2细胞并观察绿色荧光蛋白表达。结果经限制性内切酶及转染HepG2细胞表达鉴定,证实成功构建了PCDNA3.1-GFP。结论成功构建成携有绿色荧光蛋白报告基因哺乳动物表达载体,该质粒可用于融合表达目的蛋白,并将目的蛋白表达定位。     

大鼠睾丸AQP8和绿色荧光蛋白融合蛋白表达载体构建

目的：克隆Wistar大鼠睾丸水通道蛋白(AQP8)cDNA,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与大鼠AQP8的融合蛋白真核细胞表达载体。方法：用RT-PCR钓取AQP8 cDNA编码区全长序列,测序鉴定,将AQP8 cDNA亚克隆于pEGFP-C1基因的下游。结果：①AQP8 cDNA测序结果与登录在GenBank上的大鼠AQP8基因序列（GenBank登录号：NM_019158）高度同源,但PCR产物的序列分析结果中发现4个碱基序列与已发表的AQP8序列不同：NM_019158的第135~137位碱基分别是C、A和G,而测序结果缺乏这3个碱基,NM_019158的第311位为A,而测序结果为G;②酶切鉴定在表达载体pEGFP-C1中AQP8 cDNA融合于EGFP基因的下游。结论：pEGFP-C1-AQP8融合蛋白的表达载体构建成功。     

绿色荧光蛋白应用的研究进展

绿色荧光蛋白 (ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ ,ＧＦＰ)来源于海洋生物水母 ,近年来在生物化学和细胞生物学中成为最广泛应用的标记性蛋白质之一。随着对基因的表达调控 ,蛋白质在活细胞中自然状态下的变化等重要问题研究的深入 ,迫切需要一种操作方便、不用加外源底物就能在活细胞中检测的分子探针。 1994年发现的ＧＦＰ[1] 就能满足以上要求 ,它将彻底改观过去的研究方法 ,在分子生物学研究中有广泛的应用前景。1　ＧＦＰ的性质ＧＦＰｃＤＮＡ从水母 (Ａｅｑｕｏｒｅａｕｉｃｔｏｒｉａ)中分离得到 ,是在研究水母的发光…     

视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的：从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子（ROP）并建立ROP－绿色荧光蛋白（GFP）融合基因转基因小鼠模型。方法：用PCR法从基因组内扩增ROP，通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体，并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pMOP-EGFP表达质粒经Not I酶切线性化后，用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核，制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建小鼠，基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传化后，取眼球进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察视网膜下GFP的表达。结果：从基因组内扩增出了2.1kb的小鼠ROP，成功构建了小鼠ROP－GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建，分别命名为C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU21,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论：成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠，它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制，还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。     

构建RNA干扰载体特异性抑制绿色荧光蛋白表达的研究

目的:利用PCR构建RNA干扰质粒载体的方法,促进RNA干扰技术的广泛开展.方法:PCR方法获得小鼠U6 27启动子序列,以及干扰绿色荧光蛋白(EGFP)表达的siRNA的相应DNA模板序列.将其序列克隆入pUC19,获得RNA干扰载体pU6-siEGFP.将pU6-siEGFP及pcDNA3.1/EGFP共转导COS-7细胞,观察EGFP表达情况.结果:所构建的pU6-siEGFP能够成功干扰COS-7细胞中EGFP的表达.结论:PCR方法成功构建了RNA干扰载体,为RNA干扰技术在更多实验室的广泛开展奠定基础.     

增强型绿色荧光蛋白的基因克隆、表达及蛋白纯化

目的研究增强型绿色荧光蛋白(EnhancedGreenFluorescentProtein,EGFP)基因在大肠杆菌中的基因克隆、重组表达及纯化。方法采用PCR方法克隆EGFP全长cDNA序列,构建原核表达载体pGEX4T-1-EGFP,经过DNA序列测定证实其序列正确,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,用谷胱甘肽-Sepharose4B层析法纯化GST-EGFP融合蛋白。结果成功地克隆了EGFP全长cDNA序列,并进行原核表达以及蛋白的纯化,GST-EGFP的表达量占菌体蛋白量的40%以上。经纯化后纯度高于90%。菌体超声裂解后上清液及其纯化产物在长波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光。结论本研究为应用EGFP追踪细胞吞噬功能等动态活动奠定了实验基础。     

绿色荧光蛋白-小鼠纤维介素蛋白融合基因表达载体的构建和表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)和小鼠纤维介素蛋白(mfgl2)的融合蛋白表达载体，在仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达，为mfgl2的RNA干扰体外研究提供简便的判断手段。方法：用PCR从mfgl2cDNA文库中扩增出mfgl2cDNA片段，插入到GFP表达载体pEGFP—N2中GFP基因序列的上游，构建成GFP—mfgl2融合基因表达载体pEGFP—mfgl2，将该载体转染到CHO细胞后24—48h，通过荧光显微镜观察并摄片。结果：扩增出长约1．3kb的基因片段，经双酶切鉴定和测序鉴定无误；重组载体转染CHO细胞后，在荧光显微镜下可观察到GFP的表达。结论：成功构建了pEGFP．mfgl2融合基因表达载体；重组载体可在CHO细胞中表达出GFP—mfgl2融合蛋白，为下一步进行mfgl2RNA干扰研究提供了简便的判断手段。     

绿色荧光蛋白在肿瘤研究中的应用

自20世纪60年代被发现以来,绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）因其化学性质稳定、无光漂白现象、用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质等引起科学家的广泛关注。目前．GFP基因作为报告基因广泛应用于细胞生物学、分子生物学以及临床医学等研究中。     

pQE-EGFP原核表达载体的构建及其表达和鉴定

目的:利用分子克隆技术构建原核表达载体pQE-EGFP,在大肠埃希菌中高效表达与鉴定。方法:以质粒pEGFP-N2为模板,采用PCR方法特异性扩增增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因序列,将其克隆于原核表达载体pQE-31,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,用异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导表达;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting鉴定表达蛋白质。结果:PCR扩增得到了EGFP全长结构基因。所构建的pQE-EGFP重组质粒经酶切及测序鉴定结果与设计序列一致;转化大肠埃希菌JM109,经IPTG诱导后,目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE、Western blotting初步测定目的蛋白的相对分子质量约为28 500,与理论预期值一致。结论:pQE-EGFP重组质粒的成功构建、表达和鉴定为TAT-EGFP融合蛋白穿透细胞能力的研究奠定了基础。     

重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的 研究重组腺相关病毒 (rAAV)介导增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的有效性和安全性。方法 微型角膜刀制作兔角膜基质瓣;转染组用含rAAV－EGFP转染液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min,对照组用等量BSS液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min,不同时间点(1、3、7、14、21d)通过荧光体视镜观察角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况,收集角膜,其中一半用激光共聚焦显微镜观察、照相,另一半固定后行HE染色。结果 转染组于转染第3天,体视荧光显微镜下观察到兔眼角膜瓣内面及基质床中开始有GFP阳性表达;7d达到高峰, 21d时仍有微弱表达。第7天 在激光共聚焦显微镜下可观察到兔角膜基质中有明显的荧光表达。对照组角膜始终未见荧光表达。转染组和对照组角膜HE染色均未见炎症细胞浸润及新生血管等异常。结论 rAAV- EGFP经兔角膜基质瓣转染角膜基质细胞的方法可将基因安全、相对高效地转入角膜基质细胞。为转基因治疗角膜病提供了新的转染途径。     

绿色荧光蛋白为报导基因快速筛选重组羊痘病毒表达载体

目的利用绿色荧光蛋白（GFP）为报导基因,构建通用、高度减毒的外源基因表达载体IA82△121-V。方法抽提病毒
DNA,扩增ORFV132左右同源臂,构建穿梭质粒pSPV-132LF-EGFP-132RF;转染OFTu细胞,与羊痘病毒IA82△121同源重组,
通过荧光信号筛选重组体IA82△121-V,PCR及测序鉴定,并经病毒滴定、体外血管内皮细胞增殖实验以检测ORFV132缺失后
的功能变化。结果成功快速筛选出重组羊痘病毒IA82△121-V,初步判断ORFV132的缺失不影响病毒体外的生长复制功能,
但是减轻了其毒力。结论利用GFP为报导基因能简单、快速、稳定地筛选出重组羊痘病毒,高度减毒的重组羊痘病毒IA82△
121-V有望成为新一代外源基因表达载体。
     

绿色荧光蛋白转基因小鼠的生理生化常数

目的 测定绿色荧光蛋白转基因小鼠不同年龄段的生理生化、组织病理学等方面的指标,为该品种转基因小鼠应用于毒理学等领域研究提供理论依据.方法 定期测定不同周龄段(4～6周龄,6～8周龄,9～12周龄,13～14周龄)141只绿色荧光蛋白转基因(GFP)小鼠和100只对照组C57BL/6J小鼠的体重和摄食量,对上述两种动物定期取血,测定血生化及血液学指标.对动物进行大体解剖,计算主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺,性腺)的脏器系数并进行组织病理学检测.结果 ①体重和摄食量:4周龄的GFP小鼠,其体重明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01);4～5周龄的GFP小鼠,其摄食量明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01).②血常规测定:6～8周龄,9～12周龄的GFP小鼠,其红细胞计数(RBC)明显低于对照组,差异具有显著性(P<0.01);9～12周龄,13～14周龄的GFP小鼠,其白细胞计数(WBC)明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01).③血生化测定:6～8周龄,9～12周龄,13～14周龄的GFP小鼠,其尿酸(UA)值明显高于对照组,差异具有显著性(P<0.01);6～8周龄,9～12周龄的GFP小鼠,其总蛋白(TP),白蛋白(ALB)明显低于对照组,差异具有显著性(P相似文献   

人精子蛋白17增强型绿色荧光蛋白共表达卵巢癌细胞模型的建立

目的:建立人精子蛋白17(hSp17)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的卵巢癌细胞模型. 方法:用PCR方法获取hSp17基因片段,Hind Ⅲ/Kpn I双酶切、T4 DNA连接酶连接的方法将hSp17基因片段克隆至含报告基因EGFP的真核表达载体pEGFP-N1中,脂质体介导转染卵巢癌细胞HO8910,荧光倒置显微镜观察及Westernblot检测转染细胞中hSp17/EGFP融合蛋白的表达,G418筛选稳定表达的细胞株. 结果:酶切和测序结果均证实pEGFP-N1/hSp17重组质粒的构建完全正确.荧光观察与Western blot均证实了hSp17/EGFP蛋白的共表达,且成功筛选出稳定表达的细胞株. 结论:成功构建hSp17/EGFP共表达的卵巢癌细胞模型,为研究hSp17异常表达对肿瘤细胞生物学行为的影响,以及hSp17为靶标的肿瘤诊断和生物治疗奠定基础.     

Labeling embryonic stem cells with enhanced green fluorescent protein on the hypoxanthineguanine phosphoribosyl transferase locus

Objective To label embryonic stem(ES)cells with enhanced green fluorescent protein(EGFP)on the hypoxanthineguanine phosphoribosyl transferase(HPRT) gene locus for the first time to provide a convenient and efficient way for cell tracking and manipulation in the studies of transplantation and stem cell therapy.Methods Homologous fragments were obtained by polymerase chain reaction(PCR),from which the gene targeting vector pHPRT-EGFP was constructed.The linearized vector was introduced into ES cells by electoporation.The g4186tG cell clones were obtained after selection with G418 and 6TG media.The integration patterns of these esistant cell clones were identified with Southern blotting. Results EGFP expressing ES cells on the locus of HPRT were successfully generated.They have normal properties,such as karyotype,viability and differentiation ability.The green fluorescence of EGFP expressing cells was maintained in propagation of the ES cells for more than 30 passages and in differentiated cells.Cultured in suspension,the “green”ES cells aggregated and formed embryoid bodies, retaining the green fluorescence at varying developmental stages.The“green”embryoid bodies could expand and differentiate into various types of cells,exhibiting ubiquitous greem fluorescence.Conclusions This generation of “green”targeted ES cells is described in an efficient protocol for obtaining the homologous fragments by PCR.Introducing the marker gene in the genome of ES cells,we should be able to manipulate them in vitro and use them as vehicles in cell-replacement therapy as well as for other biomedical and research purposes.     

过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的腺病毒构建

目的设计特异性标记过氧化物酶体的绿色荧光蛋白,构建腺病毒载体,并感染培养的大鼠心肌细胞H9C2,检测该腺病毒载体的表达效率,通过共聚焦显微镜观察细胞过氧化物酶体的分布,同时给予细胞缺氧处理,对比细胞内过氧化物酶体的变化。方法（1）设计带有过氧化物酶体信号肽序列的绿色荧光蛋白序列。（2）PCR扩增该序列片断,并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack中;pAdTrack经限制性内切酶Pme Ⅰ酶切线性化后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组。重组绿色荧光蛋白质粒经限制性内切酶PacⅠ酶切线性化后,转染293A细胞,进行病毒包装,得到Ad-GFP-Peroxi重组腺病毒颗粒。（3）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒和不带有信号肽序列的Ad-GFP腺病毒感染培养的H9C2,24h后共聚焦显微镜下观察。（4）用Ad-GFP-Peroxi腺病毒感染H9C2细胞后,分为正常培养和1%氧浓度培养两组,24h后观察。结果重组Ad-GFP-Peroxi腺病毒载体构建成功;与Ad-GFP腺病毒相比,Ad-GFP-Peroxi腺病毒能够特异性显示大鼠心肌细胞内过氧化物酶体的分布;且缺氧刺激后H9C2细胞内过氧化物酶体分布出现聚集现象。结论利用同源重组的方法成功构建的过氧化物酶体特异性绿色荧光蛋白的过表达腺病毒,对大鼠心肌细胞H9C2有较高的感染效率,共聚焦显微镜下可以明确显示心肌细胞内过氧化物酶体的分布情况,且缺氧刺激导致过氧化物酶体分布聚集。     

绿色荧光蛋白作为供体细胞标记物的可行性

目的研究绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的荧光稳定性及对转染细胞的影响,探讨其作为供体细胞标记物的可行性.方法将增强型GFP基因转入PC12细胞,经G418筛选并连续传代,在荧光显微镜下观察荧光蛋白阳性表达率;比较未转染细胞和转染细胞的形态、细胞活性、细胞周期等.结果第5代、第40代及未用G418筛选3个月后的转染细胞,荧光蛋白阳性表达率为100%;未转染细胞和转染细胞的形态无明显区别,细胞活性、细胞周期等差异无统计学意义(P＞0.05).结论GFP荧光稳定,对转染细胞无明显影响,是良好的供体细胞标记物.