人TIMP-2基因真核表达质粒的构建及其表达研究

目的构建人T IM P-2基因真核表达质粒,使其在真核细胞中稳定表达。方法利用RT-PCR方法获得人T IM P-2基因cDNA,以pcDNA 3为载体构建真核表达质粒pcDNA 3/T IM P-2,采用脂质体介导基因转染技术将重组质粒DNA导入CHO细胞中,加入G 418对转染细胞进行筛选获得稳定转染细胞,采用W estern b lot对重组质粒的表达进行检测。结果酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA 3/T IM P-2构建正确,在转化细胞中检测到人T IM P-2的表达。结论成功构建人T IM P-2真核表达质粒并获得稳定表达人T IM P-2的CHO细胞株。     

高效表达肝癌相关抗原HAb18G的CHO细胞株的建立

目的 获得高效表达肝癌相关抗原HAb18G的CHO细胞株。方法 构建含有肝癌相关抗原HAb18G基因的真核表达载体并经限制性酶切及部分序列分析证明插入是否正确。用阳离子脂质体介导转染CHO细胞经G418筛选,稳定表达,间接免疫荧光染色证实蛋白表达情况。用有限稀释法将筛选的细胞进行单克隆化,通过流式细胞仪筛选高效表达株。结果 成功构建了真核表达载体pcDNA-3/HAb18G并经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确。间接免疫荧光染色证实：HAb18G高效表达于转染细胞的胞膜上。流式细胞仪筛选获得了1株高效表达的CHO细胞。结论 实验结果为HAb18G蛋白分子的生物学功能研究奠定了基础。     

HBV3′末端缺失preS/S基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆HBV 3′末端缺失preS/S基因,构建真核表达载体,转染真核细胞,为进一步进行功能研究奠定基础.方法采用PCR方法从乙型肝炎病毒全基因组中克隆preS/S基因,构建真核表达载体pcDNA3-preS/S,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定,通过脂质体转染Hela细胞系进行表达研究.结果1)克隆了3′末端缺失的preS/S基因;2)构建preS/S真核表达载体;3)转染细胞及G418筛选后得到preS/S基因稳定表达的细胞株.结论3′末端缺失的preS/S基因能够在胞内表达,此研究为基因的功能研究奠定了一定的基础.     

血管生成抑制因子arresten 的真核表达体系的建立

  目的 构建血管生成抑制因子arresten的真核表达细胞克隆体系。方法 用脂质体转染法，通过真核表达载体pSecTag2-arresten将arresten基因导入CHO细胞，经抗生素Zeocin筛选获得阳性细胞克隆，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测arresten mRNA表达，免疫蛋白印迹技术（Westem-blot）测arresten蛋白的表达。结果 经过筛选获得阳性克隆的CHO细胞，RT-PCR、Westem-blot结果提示arresten基因成功导入CHO细胞并进行表达。结论 获得了稳定表达人arresten因子的CHO细胞克隆，为深入研究arresten在抑制肿瘤血管生成中的作用机制奠定了良好的基础。     

Twist基因真核表达载体的构建和表达检测

[目的]构建Twist基因读码框架至真核表达载体pCDNA3．1，为进一步研究Twist蛋白的功能做材料准备。[方法]采用RT-PCR方法，以正常人子宫体组织cDNA为模板，扩增Twist基因全长读码框架，并构建到真核表达载体pCDNA3．1中。[结果]经过克隆测序结果证实，成功将Twist基因读码框架插入真核表达载体pCDNA3．1的相应位置：将pCDNA-Twist载体转染细胞系后，发现Twist蛋白在细胞中得到高水平的表达。[结论]Twist真核表达载体的成功构建，为深入研究Twist蛋白对肿瘤转移的作用提供了理想的材料。     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

ECM1-pEGFP—N2真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞系MCF-7中的表达

目的构建细胞外基质蛋白1基因（ECM1）的真核表达载体ECM1-pEGFP-N2，检测其在人乳腺癌细胞系MCF-7中表达。方法采用PCR方法，以ECMleDNA为模板，扩增出ECM1基因，用Bg1 Ⅱ和KpnⅠ双酶切ECM1基因和pEGFP-N2载体，连接酶切目的片段，转化大肠杆菌DH5，筛选阳性克隆酶切、测序鉴定；利用脂质体介导的转染技术转染MCF-7细胞，荧光显微镜检测报告基因表达产物EGFP，免疫组化检测ECM1蛋白表达。结果利用PCR克隆出约1．6kb的ECM1基因；PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果证实成功构建ECM1-pEGFP-N2真核表达载体；转染MCF-7细胞后，可在细胞内观察到报告基因产生的绿色荧光，用免疫组化方法可检测到ECM1蛋白。结论成功构建了ECM1-pEGFP-N2真核表达载体，并在MCF-7细胞中表达，为进一步研究ECM1的功能奠定了基础。     

TSLC1真核表达载体的构建及在HepG2肝癌细胞中的表达

目的构建TSLC1真核表达载体,并转染到肝癌细胞HepG2中使之表达,为研究TSLC1的抗肝癌作用奠定基础。方法利用RT-PCR技术扩增TSLC1基因全长,并与真核表达载体pRe-ceiver-M29进行连接;应用双酶切、PCR以及测序鉴定此连接载体;脂质体Lipofectamine 2000介导重组载体转染到HepG2细胞中,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR和免疫组化法检测其表达。结果RT-PCR获得了约1 329 bp大小的TSLC1基因片段;经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实TSLC1基因片段正确插入真核表达载体pReceiver-M29中;与对照组比较,RT-PCR方法可见显示转染组细胞TSLC1mRNA表达明显增多,免疫组化法可见显示转染组细胞TSLC1蛋白表达明显增高。结论成功构建了真核表达载体pReceiver-M29-TSLC1,建立了稳定转染TSLC1的HepG2细胞株。     

pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒的构建及在MCF-7乳腺癌细胞中的转染

目的构建pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒, 并进行鉴定。为进一步研究Smad3在抑制乳腺癌生长机制中起到的作用提供实验基础。方法 利用RT-PCR方法从MCF-7乳腺癌细胞中获得cDNA, 应用PCR方法扩增、提取 Smad3的基因片段, 酶切后与pEGFP-C3真核表达载体连接, 构建pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒, 进行测序、酶切鉴定, 表明质粒构建成功。将构建的质粒瞬时转染至MCF-7乳腺癌细胞中, 通过荧光倒置显微镜观察、RT-PCR技术及Westen blot技术鉴定转染是否成功。结果 本实验成功构建了pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒。结论 pEGFP-C3/Smad3真核表达质粒瞬时转染到MCF-7细胞中, 可使Smad3在基因与蛋白水平的表达显著上调。     

分泌型核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及在HepG2细胞中的表达

目的构建分泌型核心蛋白聚糖(decorin)真核表达载体,并在肝癌细胞HepG2中表达,为研究核心蛋白聚糖的抗肿瘤作用奠定基础。方法利用特异性引物,应用PCR技术扩增核心蛋白聚糖全长基因cDNA片段,与pcDNA3.1载体进行连接,并转化到大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体,应用双酶切、PCR以及测序鉴定此重组载体;脂质体介导重组载体转染HepG2,经G418筛选建立稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR、免疫组化法和westernblot检测其表达。结果获得了约1080bp大小的特异性DNA片段;PCR产物与真核表达载体进行连接,经过双酶切、PCR以及测序鉴定证实分泌型核心蛋白聚糖cDNA片段正确插入真核表达载体pcDNA3.1中。RT-PCR方法可见转染组mRNA表达明显增多,免疫组化和westernblot方法可见转染组细胞decorin蛋白表达明显增高。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-decorin,建立了稳定转染decorin的HepG2细胞株。     

分泌型人白细胞介素18重组质粒的构建及其真核表达

目的：构建带IL—12 P40信号肽序列的分泌型IL—18质粒，使其在真核细胞中稳定表达。方法：根据IL—12 P40的信号肽cDNA序列及人成熟IL—18序列设计4条特异性引物，用RT—PCR法自人树突状细胞中分别扩增IL—12 P40信号肽序列(片段A)及成熟IL—18基因(片段B)，用重叠延伸PCR法拼接和扩增融合基因(片段C)，连接制备pGEM—T克隆载体，亚克隆至pcDNA3．1^ 。转染NCI—H460人肺癌细胞株，经RT—PCR和Western blot检测IL—18的表达。结果：表达质粒的酶切图谱符合预期的结果，测序结果与预期的cDNA序列完全一致，转染细胞株表达了IL—18。结论：成功地构建了含IL—12 P40信号肽序列的IL—18表达质粒，并在人肺癌细胞株中得到了表达。     

反义PTTG真核表达载体对人卵巢癌细胞SK-OV-3恶性表型的抑制作用

背景与目的:垂体肿瘤转化基因(pituitarytumortransforminggene,PTTG)是一个新的原癌基因,具有多种促肿瘤生长与转移的作用。目前研究多集中于PTTG在各种肿瘤组织中的表达及其相关的调控机制,而针对其反义阻断可能性的报道较少。本研究中,我们通过构建携带能够表达全长反义PTTGmRNA的真核表达载体,观察其对人卵巢癌细胞株SK-OV-3的反义阻断效应。方法:利用含酶切位点的PCR引物克隆全长PTTG,反向插入真核表达载体pcDNA3.1;用脂质体将重组载体转染SK-OV-3细胞,G418筛选阳性克隆后,Westernblot检测PTTG蛋白和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)表达的改变,MTT法检测细胞增殖情况,并利用软琼脂糖集落形成实验观察细胞生物学性状的变化。结果:筛选出稳定表达重组pcDNA3.1-PTTGas的SK-OV-3细胞;转染细胞组较未转染细胞组的PTTG、bFGF表达分别减少了61.5%和52.3%;转染细胞增殖明显增强;转染细胞在软琼脂中的集落形成数(2.4±0.8)明显低于未转染组和转染空白质粒对照组(23.3±5.7和21.5±7.9)(P<0.01)。结论:反义PTTG真核表达载体作为一种新的工具,为针对PTTG的肿瘤基因治疗提供了可能性。     

STGC3新基因的克隆及功能初步分析

背景与目的：研究显示,染色体3p21是鼻咽癌高频率杂合性丢失位点,本研究在对3p21区域与鼻咽癌相关的表达序列标签(expressed sequencetag,EST)筛选的基础之上,进行鼻咽癌相关新基因的克隆和功能研究。方法：采用cDNA克隆质粒测序及RAcE方法,获取新基因全长cDNA。利用因特网上核酸、蛋白质数据库及蛋白质分析软件进行生物信息学分析。通过构建pEGIFP-C2／STGC3绿色荧光表达载体,与脂质体共转染COS7、CNE2细胞,进行基因表达蛋白质定位分析。用Northern blot法检测STGC3在人其他正常组织及肿瘤细胞系表达状况。结果：在3p21区域获得一个全长为1271bp的cDNA新序列,生物信息学分析与已知基因无明显同源性,属于一个新基因,编码146个氨基酸,定位于染色体3p21,被命名为STGC3(GenBank登录号：AY078383)。蛋白质定位分析显示,STGC3融合蛋白存在于细胞浆及细胞核内;MTE^TM Array2多组织膜Northem blot显示该基因在人正常组织及肿瘤细胞均有表达,并在淋巴瘤等多种肿瘤细胞株中阳性杂交信号弱。结论：STGC3属于一个新基因,其表达的蛋白质存在于细胞浆及细胞核内。在鼻咽癌及多种肿瘤细胞株表达下调。     

bcr-abl基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 构建慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的真核表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7中高效表达.方法 提取慢性粒细胞白血病K562细胞的RNA,经RT-PCR技术扩增得到bcr-abl基因后,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,并进行PCR和酶切鉴定.鉴定为阳性的克隆,再进一步进行测序分析.将构建成功的真核表达载体转入COS-7细胞中进行瞬时表达.结果 反转录PCR扩增后的产物,经琼脂糖凝胶电泳可以在约874 bp处看见一特异性的条带,序列分析证明扩增产物与GeneBank中的bcr-abl基因序列相同.将pEGFP-bcr-abl真核表达载体转入COS-7细胞后,经RT-PCR、Western blotting检测证明表达产物正确.结论 成功构建了含有bcr-abl融合基因的真核表达质粒,从而为进一步研究其结构和功能,寻找CML诊疗的新方法奠定了基础.     

bcr-abl基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

 目的　构建慢性粒细胞白血病bcr-abl融合基因的真核表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7中高效表达。方法　提取慢性粒细胞白血病K562细胞的RNA,经RT-PCR技术扩增得到bcr-abl基因后,将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,并进行PCR和酶切鉴定。鉴定为阳性的克隆,再进一步进行测序分析。将构建成功的真核表达载体转入COS-7细胞中进行瞬时表达。结果　反转录PCR扩增后的产物,经琼脂糖凝胶电泳可以在约874 bp处看见一特异性的条带,序列分析证明扩增产物与Gene Bank中的bcr-abl基因序列相同。将pEGFP- bcr-abl真核表达载体转入COS-7细胞后,经RT-PCR、Western blotting检测证明表达产物正确。结论　成功构建了含有bcr-abl融合基因的真核表达质粒,从而为进一步研究其结构和功能,寻找CML诊疗的新方法奠定了基础。     

肝癌细胞中RhoA小干扰RNA载体的构建与鉴定

 目的 构建靶向RhoA基因的RNA干扰（RNAi）载体。方法 根据人RhoA基因序列设计两条短双链，人工合成后，连接到真核表达载体Pgenesil-1中，构成Pgenesil-1-siRhoA1、Pgene-sil-1-siRhoA2两个重组质粒，转入人肝癌细胞（HEPG2）中，Western blot方法检测RhoA-siRNA对RhoA表达的抑制效果，确定一个重组质粒进行下一步研究。结果 两质粒都有沉默RhoA基因的作用，Pgen-esil-1-siRhoA1重组质粒作用更强烈一些，使用Pgenesil-1-siRhoA1质粒进行下一步研究。结论 Pgen-esil-1-siRhoA重组质粒的成功构建，为研究RhoA与肝细胞癌侵袭转移的关系提供实验模型。     

HER2基因转染MCF-7细胞及生物学特性观察

目的:建立共表达HER2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2)基因和ER(Estrogen Receptor)基因的细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法:构建真核表达载体pcDNA3.1-HER2,利用脂质体介导将其转染ER阳性的乳腺癌MCF-7细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学等方法检测HER2基因在MCF-7细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法和肿瘤细胞侵袭实验,观察转染细胞的生物学活性.结果:在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有HER2基因的高表达,转染后细胞的增殖能力和侵袭能力明显增强.结论:构建含HER2基因的重组载体,导入乳腺癌MCF-7细胞后,获得生物学活性稳定的HER2基因和ER基因高表达的细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

TβR-Ⅱ-RANTES融合基因重组腺病毒的抗肿瘤作用

目的构建表达融合基因TGF-βⅡ型受体(TβR-Ⅱ)胞外区及活化T细胞表达和分泌的调节因子(RANTES)重组腺病毒载体,并观察其抗肿瘤作用。方法RT-PCR扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTES基因,重叠PCR扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。采用adMax adenovjrus vector creation试剂盒构建表达融合基因重组腺病毒。体外感染小鼠肺腺痛LA795细胞系,绘制细胞生长曲线。采用Western blot法检测感染后细胞融合基因的表达;酶联免疫吸附试验(FLISA)法检测其培养上清的蛋白含量;Annexin V-FITC法检测感染后细胞的凋亡;并观察感染后细胞培养上清对小鼠脾细胞的趋化作用。将感染后的细胞(1×105个)接种于T739小鼠,观察成瘤时间和生存时间;1×1010pfu的重组腺病毒局部注射荷瘤小鼠,观察肿瘤的大小变化,并统计肿瘤的重量和计算抑瘤率。结果经测序证实,RT-PCR正确扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTFS基因,重叠PCR正确扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES。重组质粒pDC316-融合基因经酶切鉴定正确,与pJM17双质粒共转染获得表达融合基因重组腺病毒,病毒滴度为8×1010pfu/ml。Western blot结果表明,感染后的LA795细胞有融合蛋白的特异性条带出现;培养上清中,游离TGF-β1的水平显菩减低,而RANTES的水平显著升高。感染融合基因重组腺病毒的细胞生长速度明显减低,凋亡率为16.9%;培养上清可趋化小鼠脾细胞,与对照组之间差异均有统计学意义。感染融合基因重组腺病毒组与对照组相比,体内成瘤时间和生存时间明显延长;局部注射融合基因重组腺病毒可显著抑制肿瘤的生长,抑瘤率为37.6%。结论成功构建表达融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES重组腺病毒可有效结合TGF-β1,显著逆转TGF-β介导的免疫抑制状态,高水平表达RANTES强化肿瘤局部的免疫功能,具有显著的抗肿瘤作用。     

PNP 表达质粒的构建及鉴定

 目的 构建并鉴定一种新型的PNP自杀基因表达载体。方法 将PNP基因插入到pcDNA3．0中，构建PNP基因表达载体pcDNA3．0／PNP；通过酶切、PCR及测序鉴定重组体。采用脂质体介导法将pcDNA3．0／PNP转染三种肿瘤细胞株，RT—PCR检测PNP基因在各细胞株中的表达。结果 目的片段均成功插入相应的载体中，CMV启动子调控下的PNP基因在不同的肿瘤细胞株中实现了表达。结论 CMV启动子调控的PNP基因表达载体是肿瘤基因治疗中一种新型、高效的治疗栽体。