脑肿瘤干细胞研究进展

脑恶性肿瘤是人类死亡率最高的肿瘤之一。致死率最高的原发性脑肿瘤是胶质母细胞瘤,其中位生存期不到12个月。目前研究认为,脑肿瘤中存在一小部分肿瘤干细胞（tumor stem cells,TSCs）,它们对治疗有抵抗性,且具有再次形成肿瘤的能力,因而其可能是复发的根源,为此研究者提出了TSCs的概念。TSCs理论认为,肿瘤组织是不均质的,由形态和功能不同的细胞构成,其中一小部分细胞具有自我更新和形成肿瘤的能力,类似于正常体细胞中的干细胞,     

鼠胚胎神经干细胞的体外培养及诱导分化

背景：随着神经干细胞培养技术条件的成熟,为颅脑损伤后神经系统功能重建、神经再生和神经系统疾病治疗提供了新的思路和途径。但移植所用的细胞来源及移植后的神经干细胞能否分化为神经细胞是急需解决的重要问题。 目的：拟将体外分离培养的鼠胚胎神经干细胞稳定增殖传代,并诱导分化出神经系统的3种基本细胞。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-06/2008-06在新疆维吾尔自治区人民医院完成。 材料：14~16 d孕龄Wistar大鼠胚胎,由新疆自治区实验动物研究所和新疆医科大学实验动物中心提供。 方法：取胎鼠额叶大脑皮质,组织块消化法体外分离培养神经干细胞,在表皮生长因子、碱性成纤维生长因子和B27联合作用下使其稳定增殖。原代培养7 d后,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基诱导14 d。 主要观察指标：倒置显微镜下观察神经干细胞的生长形态,并行巢蛋白免疫荧光染色鉴定。应用免疫组化染色检测诱导后神经干细胞的分化情况。 结果：原代培养一两天细胞散在分布,胞体较小,呈圆形,折光性较好,3 d后逐渐形成由数个细胞组成的细胞球;传代后贴壁细胞多数分化为长梭形或扁平形的胶质细胞,10 d时可见大量由数十至数百个细胞组成的较大细胞球,其生长速度基本与原代培养相同,但成球速度明显加快;免疫荧光染色呈巢蛋白阳性反应。以含体积分数为10%胎牛血清的培养液诱导后,免疫化学染色示神经干细胞球呈神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、髓鞘碱性蛋白阳性表达。 结论：实验成功从鼠胚胎脑皮质分离培养出神经干细胞,并诱导分化为神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。 关键词：神经干细胞;体外培养;诱导分化     

五味子多糖影响脑肿瘤干细胞的增殖

目的探讨五味子多糖对脑肿瘤干细胞增殖的作用。方法培养人脑肿瘤细胞,采用CD133免疫磁珠分选法获得脑肿瘤干细胞,MTT法检测五味子多糖对脑肿瘤干细胞生长增殖率的影响,ELISA法检测脑肿瘤干细胞分泌HIF、VEGF、Neun和GFAP蛋白变化。结果五味子多糖可以浓度依赖性地抑制脑肿瘤干细胞的增殖率,与对照组比较,800 mg/L组差异有统计学意义(P0.01)。ELISA结果显示,五味子多糖作用后脑肿瘤干细胞分泌HIF和VEGF蛋白降低,分泌Neun和GFAP蛋白增高,与对照组比较,800 mg/L组差异有统计学意义(P0.01)。结论五味子多糖通过诱导脑肿瘤干细胞分化和调控VEGF表达而抑制脑肿瘤干细胞的增殖。     

脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞的体外分化能力*☆

背景：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞具有很多相似的生物学特性。 目的：比较脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞与受损PC12细胞分别共培养后定向分化能力的差异。 方法：分别分离培养脂肪组织来源和骨髓组织来源的基质干细胞,取第5代细胞进行实验,2种细胞分别与正常或受损PC12细胞培养上清液共培养,或仅单独培养。 结果与结论：脂肪基质干细胞和骨髓基质干细胞均表达较高水平的CD44和CD29,而后者表达的CD45、CD56在前者几乎未检测到。单独培养的2种细胞均表达较高水平的Nanog、Oct4、Sox2,不表达神经元特异性烯醇酶。其中经受损PC12细胞干预的2种细胞Nanog、Oct4、Sox2表达水平显著降低,而脂肪基质干细胞中神经元特异性烯醇酶阳性细胞数更多,提示受损PC12细胞对于脂肪基质干细胞可能具有更强的诱导分化作用。     

氯胺酮对骨髓间充质干细胞向神经细胞体外分化的 影响

目的 探讨氯胺酮对骨髓间充质干细胞（BMSCs）向神经细胞体外分化的影响。方法 处 死SFP级SD 大鼠，分离与纯化大鼠BMSCs，然后加入不同浓度的氯胺酮对其进行诱导：0 μmol/L（对 照组）、1 μmol/（l 实验1组）和10 μmol/L（实验2组）。MTT法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞凋亡， Western blot 检测微管相关蛋白2（MAP2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达水平。结果 细胞处理后24 h 与48 h，实验2 组与实验1 组的细胞存活率与MAP2、GFAP相对表达水平显著高于对照组（P ＜ 0.05）， 实验2 组显著高于实验1 组（P＜ 0.05）。实验2 组与实验1 组的细胞凋亡率显著低于对照组（P ＜ 0.05）， 实验2 组也显著低于实验1 组（P ＜ 0.05）。结论 氯胺酮能增加BMSCs 的MAP2、GFAP 蛋白表达，促进 BMSCs 增殖与抑制细胞凋亡，从而促进其向神经细胞体外分化。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向神经元分化

目的　探讨大鼠中胚层来源的骨髓间充质干细胞(MSCs),在诱导因子的诱导下体外向神经元方向分化的能力。方法　贴壁法分离的MSCs,用NIM诱导,相差显微镜观察细胞形态变化,神经元特异抗体NeuN,MAP2,NSE免疫组化染色鉴定转化情况。结果　在诱导后30～40min即开始形态变化,形成神经元样的细胞,免疫组化染色神经元样细胞表达NeuN(50.83%±3.43%),NSE(59.83%±9.24%)和MAP2(45.17%±8.42%)。结论　MSCs在体外诱导下可以分化为神经元样的细胞,表明它是有别于一般成体干细胞的多能干细胞。     

Wnt3a影响神经干细胞分化的体外研究

目的探讨Wnt3a对胚胎大鼠海马神经干细胞（NSCs）体外分化的影响。方法采用机械分离、无血清传代培养法从胎鼠海马中获得NSCs,使用免疫荧光法对其干细胞特性及其受体Fzd3蛋白表达进行鉴定,观察Wnt3a对NSCs体外分化的影响。结果海马NSCs表达特异性标志物巢蛋白及胞膜蛋白Fzd3;体外诱导分化,Wnt3a处理组神经元及星形胶质细胞分化的比例分别为11．25％±0．62％和56．26％±4．82％,而对照组则为8．54％±0．48％和168．42％±5．54％;组间分化差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论体外环境下Wnt3a能够促进NSCs向神经元分化,并抑制其向星形胶质细胞分化。     

脂肪干细胞诱导神经干细胞分化的体外实验研究

目的研究脂肪干细胞（ADSCs）体外诱导神经干细胞（NSCs）分化的作用。方法从新生BALB／c小鼠中分别分离获得ADSCs及NSCs,进行体外培养和传代。构建ADSCs与NSCs共培养体系,以单纯NSCs组为对照,进行ADSCs诱导分化研究。共培养4、8、12d后行神经元特异性神经丝200免疫组化鉴定,统计NSCs分化为神经元的百分率。结果共培养后8—12d,可见大量成熟神经元,大多为多极神经元,少部分为双极神经元或假单极神经元,带有较长的轴突。共培养组NSCs分化为神经元的百分率大约为21％,而单纯NSCs培养组约为4％。共培养组神经元的转化率与单纯NSCs培养组神经元的转化率之间有显著性差异（P〈0．05）。结论ADSCs在体外能够促进NSCs向神经元转化。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外向成骨细胞分化培养的生物学特性

背景：骨髓间充质干细胞因取材方便、对机体损伤小,是目前最为合适的骨组织工程种子细胞,但其体外培养的具体方法及生物特性仍无定论。 目的：建立一种简单有效的骨髓间充质干细胞的体外培养及成骨诱导方法,并探讨其体外培养的生物学特点。 方法：采用贴壁法分离提纯Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,传至第3代细胞后,分别在普通培养基(对照组)和成骨诱导培养基(实验组)中培养10 d,绘制细胞生长曲线。于培养第4,7,10,13,16天检测两组细胞碱性磷酸酶活性,并对细胞爬片行Von kossa染色。 结果与结论：采用贴壁法获得了均一性较好的骨髓间充质干细胞,对照组细胞生长速度明显快于实验组细胞。对照组细胞碱性磷酸酶活性明显低于实验组(P < 0.05)。实验组细胞Von kossa染色为阳性,对照组为阴性。说明贴壁筛选法是一种简单有效的骨髓间充质干细胞的分离纯化方法,骨髓间充质干细胞在体外可诱导分化为成骨细胞。     

体外诱导大鼠骨髓干细胞向肝干细胞分化的特征**★

目的：骨髓干细胞分化为肝干细胞的发现具有重要的临床应用价值,可用其作为生物人工肝或肝细胞移植的供体细胞,以解决供体缺乏，同时自体细胞还可免除异基因或异种细胞所致的许多问题。为此，实验模拟肝脏发育的微环境，观察体外诱导分化大鼠骨髓干细胞为肝干细胞的可行性及特征。 方法：实验于2006-10/2007-08在解放军第一二三医院南京军区肝病中心实验室完成。①实验动物: SPF级SD大鼠，2月龄，体质量（200±20） g,雌雄不拘，购于上海斯莱克实验动物公司。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：采用密度梯度分离法分离培养大鼠骨髓干细胞，并设诱导组和非诱导组，应用25 μg/L肝细胞生长因子、10 μg/L成纤维生长因子-4、10 μg/L干细胞生长因子共同诱导。③实验评估：于诱导第0，7，14，21，28天，观察细胞形态变化，采用放射免疫法检测培养上清液中甲胎蛋白浓度，免疫组织化学染色检测甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白的表达，应用流式细胞仪检测甲胎蛋白、细胞角蛋白19表达阳性细胞比例。 结果：①诱导培养的骨髓干细胞呈卵圆形或圆形的肝干细胞样改变。②放射免疫法检测到诱导组细胞甲胎蛋白浓度逐渐升高，第14天达高峰，随后呈下降趋势，与非诱导组相比，除第0，7天无差异，其余各时间点差异均显著（P < 0.05）。③免疫细胞化学法检测到诱导组细胞特异性表达甲胎蛋白、细胞角蛋白19及白蛋白，非诱导组不表达3种蛋白。④流式细胞分析诱导组甲胎蛋白阳性细胞比例为66.20%、细胞角蛋白19阳性细胞的比例为44.96%。 结论：在实验建立的诱导培养体系中，骨髓干细胞在体外能分化为肝干细胞样细胞，诱导细胞有分泌甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白的特征性功能。     

全反式维甲酸对脑肿瘤干细胞增殖和分化的影响

目的 研究全反式维甲酸(ATRA)对脑肿瘤干细胞(BTSCs)增殖和分化的影响.方法 采用有限稀释法从人脑胶质母细胞瘤新鲜标本中分离、克隆筛选BTSCs;在无血清条件下培养BTSCs.根据培养基中的成分不同分为对照组、ATRA组、ATRA/生长因子组、生长因子组,用MTT法检测BTSCs的增殖效应;在含血清条件下诱导分化BTSCs.根据血清培养基中的成分不同分为ATRA组、对照组.于诱导分化第10天用免疫荧光技术检测BTSCs子代分化细胞CD133和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达率;将BTSCs子代分化细胞更换培养条件,观察其在无血清培养基中增殖逆转再次形成脑肿瘤干细胞球(BTS)的比例和形成时间.结果 在无血清条件下,ATRA组BTSCs的增殖速度较对照组明显加快,但低于生长因子组和ATRA/生长因子组,形成的BTS亦小于后两者:在含血清条件下,ATRA组BTSCs子代分化细胞CD133、GFAP的表达率分别为2.29%±0.27%和75.60%±4.03%,对照组为7.05%±0.49%和12.51%±0.77%,前者的分化程度明显高于后者,差异有统计学意义(P<0.05),但前者仍然存在CD133的表达;BTSCs子代分化细胞在回复无血清条件下能够再次增殖形成BTS,ATRA组再形成BTS的比例为4.84%±0.32%,形成时间为(10.07+1.03)d.对照组分别为17.71%±0.78%和(4.08±0.35)d,前者再形成BTS的比例较后者更低、时间更长,差异有统计学意义(P<0.05).结论 ATRA能促进BTSCs增殖并诱导BTSCs子代细胞走向分化,但分化不彻底,细胞不能达到终末分化,可再次形成BTS.     

人脑胶质瘤干细胞初步研究

目的从人脑胶质瘤体外细胞系和胶质瘤组织中分离、鉴定肿瘤干细胞,为进一步研究其生物学特性奠定基础。方法将人胶质瘤SHG44细胞和手术标本制成的单细胞,分别用含血清培养基(DMEM 10% FBS)和无血清培养基(DMEM/F12,添加bFGF、LIF和EGF)培养。用CD133免疫磁珠筛选,流式细胞仪和免疫荧光共聚焦显微镜检测干细胞、祖细胞和分化细胞特异性标志物。结果SHG44细胞培养1周,用CD133磁珠分离得到的CD133~ 细胞的比例:血清组为0.021%,无血清组为1.2%。流式细胞仪检测:(1)Hoechst 33342~-细胞比例:血清组为1.5%,无血清组为16.4%;(2)nestin~ 细胞比例:血清组为7.2%,无血清组为51.05%;(3)免疫磁珠分离的CD133~ 细胞再用流式细胞仪测得的CD133~ 细胞为83.02%,CD133~-细胞群中有3.32%的CD133~ 细胞。标本源肿瘤细胞在无血清条件下培养两天后CD133磁珠分离CD133~ 细胞比例为4%。CD133~ 细胞在分化不同阶段共表达或分别表达祖细胞标志物nestin、神经元和胶质细胞特异性标志蛋白MAP2和GFAP。结论在胶质瘤细胞系和胶质瘤组织中均存在CD133~ 的脑肿瘤干细胞,具有自我更新和多向分化潜能、在无血清培养下细胞球体中CD133~ 细胞仍占少数,而nestin~ 细胞占多数,可作为进一步研究脑肿瘤干细胞生物学特性的实验材料在相关领域中的应用。     

不同病理级别脑胶质瘤的肿瘤干细胞体外分离培养和增殖分化

目的探讨不同病理级别的人脑胶质瘤的肿瘤干细胞在体外分离培养和增殖分化的情况。方法通过对不同病理级别手术切除的胶质瘤新鲜标本在体外无血清培养基中分离培养和体外增殖分化进行观察研究和分组比较它们的增殖能力。结果在无血清培养基中,Ⅰ级胶质瘤的肿瘤干细胞不能形成克隆球;Ⅱ级胶质瘤的肿瘤干细胞可形成中等克隆球;只有Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤的肿瘤干细胞才能形成大型克隆球。在血清培养基中,Ⅰ级胶质瘤干细胞增殖缓慢、分化较晚;Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤的肿瘤干细胞增殖迅速、快速进入分化期;Ⅱ级胶质瘤肿瘤干细胞增殖分化介于两者之间。分组比较,发现在不同培养基中和不同病理级别胶质瘤干细胞各组之间在增殖和分化能力上均存在统计学差异(P<0.01)。结论胶质瘤的肿瘤干细胞在生物特性上存在多样性。Ⅲ-Ⅳ级胶质瘤的肿瘤干细胞易于分离培养,增殖分化能力较强;Ⅰ级胶质瘤的肿瘤干细胞增殖分化缓慢,有助于动态观察脑肿瘤干细胞自我更新和增殖分化的过程,是一个较好的观察研究对象。     

脑肿瘤干细胞的生物学特性

脑肿瘤居成人恶性肿瘤发病率前十位，同时也是儿童因实体肿瘤而死亡的主要肿瘤类型，其发病率和死亡率不断升高．严重地威胁着人类健康和生命。据2004年美国癌症协会报道．美国每年有18000个原发脑肿瘤确诊病例，仅1／3病例存活超过5年。虽然外科手术和其他治疗措施进展很快，但仍很难治愈．经手术、放疗和化疗治疗后，病人几乎无一例外地出现肿瘤复发。在过去的20多年中，脑胶质瘤的治疗一直无明显进展[2]。最近研究发现，脑肿瘤中存在着具有干细胞自我更新特性的细胞亚群即脑肿瘤干细胞（brain tumor stem cell，     

神经干细胞壁龛与脑肿瘤干细胞壁龛的相关性研究

脑肿瘤干细胞(braintumor stem cells,BTSCs)发现以来,BTSCs的来源成为研究热点,越来越多的研究表明BTSCs起源于神经干细胞(neural stem sells,NSCs)的基因突变 [1],而最新提出的干细胞壁龛(niche)学说认为壁龛作为十细胞生存的微环境,通过与干细胞之间的直接和(或)间接作用影响干细胞的增殖和分化.     

Similarity on neural stem cells and brain tumor stem cells in transgenic brain tumor mouse models

Although it is believed that glioma is derived from brain tumor stem cells, the source and molecular signal pathways of these cells are still unclear. In this study, we used stable doxycycline-inducible transgenic mouse brain tumor models (c-myc⁺/SV40Tag⁺/Tet-on⁺) to explore the malignant trans-formation potential of neural stem cells by observing the differences of neural stem cells and brain tumor stem cells in the tumor models. Results showed that chromosome instability occurred in brain tumor stem cells. The numbers of cytolysosomes and autophagosomes in brain tumor stem cells and induced neural stem cells were lower and the proliferative activity was obviously stronger than that in normal neural stem cells. Normal neural stem cells could differentiate into glial fibrillary acidic protein-positive and microtubule associated protein-2-positive cells, which were also negative for nestin. However, glial fibrillary acidic protein/nestin, microtubule associated protein-2/nestin, and glial fibrillary acidic protein/microtubule associated protein-2 double-positive cells were found in induced neural stem cells and brain tumor stem cells. Results indicate that induced neural stem cells are similar to brain tumor stem cells, and are possibly the source of brain tumor stem cells.     

原发和复发脑肿瘤干细胞的生物学特征观察

目的 比较原发和复发脑肿瘤干细胞的牛物学特征.方法 源于同一患者的原发和复发脑肿瘤干细胞在干细胞培养液中长期传代培养、冻存和复苏,观察其生物学特性.结果 在于细胞培养液中培养出了悬浮的干细胞球,加血清培养时能贴壁分化为多形性瘤细胞.两者都具有分化抑制特性,染色体为异倍体.肿瘤球裸小鼠原位移植,原发为局部侵袭性生长,复发为广泛浸润、播散性生长.结论 对同一患者原发和复发脑肿瘤干细胞生物学特征比较,可为进一步研究肿瘤发生、发展、侵袭和播散等拓展思路.     

肿瘤干细胞致敏的树突状细胞对脑胶质瘤细胞免疫的影响

目的 研究肿瘤干细胞(BTSCs)致敏的树突状细胞(DCs)疫苗对颅内荷瘤小鼠的治疗作用.方法 无血清培养基中加入表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子,将C6胶质瘤细胞诱导成胶质瘤干细胞,以此致敏大鼠骨髓来源的树突状细胞制备疫苗;立体定向建立大鼠颅内C6胶质瘤模型,分为A、B、C、D四组.每组分别经尾静脉注射1×107BTSCs致敏的DCs(DCs-BTSCs)、1×107 C6胶质瘤细胞致敏的DCs(DCs-C6)、1×107DCs及PBS,Kaplan-Meier法对大鼠生存情况进行分析,大鼠脑组织标本行HE染色及免疫组化分析.结果 胶质瘤干细胞CD133+及nestin染色阳性;DCs具有典型的树突状结构,特异性标志OX62+表达阳性;生存时间A组较其他组明显延长,Log-rank检验差异有统计学意义(P＜0.05);A组HE染色炎性细胞浸润最多,免疫组化可见较多的CD8+T淋巴细胞.结论 肿瘤干细胞致敏的树突状细胞疫苗能明显提高机体对胶质瘤的免疫力,其作用优于胶质瘤细胞致敏的树突状细胞疫苗,为树突状细胞疫苗的临床应用提供了新的依据.

Abstract：

Objective To investigate the effect of dendritic cells pulsed with brain tumor stem cells which are used to treat on intracranial glioma.MethodWe obtained murine brain tumor stem cells by growing C6 cells in epidermal growth factor/basic fibroblast growth factor without serum.Dendritic cells isolated from rat bone marrow were pulsed with BTSCs.Rat brain glioma models were established by stereotactic technique.107 DCs pulsed with BTSCs and C6 were injected through tail vein in group A and group B respectively.The same number of DCs and the same volume PBS were applied to group C and group D.The survival time of rats was analyzed by Log- rank survival analysis.Tumor samples were examinedwithHE staining and immunohistochemistry.Methods BTSCs expressedCD133 + and nestin.DCs appeared typical long dentrite in morphology and expressed OX62+ markers.The survival analysis showed group A was statistically significant in constrast to the other goups (P<0.05).The tumors in group A have the most inflammation and CD8 + T lymphocytes.Concluion DCs loading with BTSCs lysates can provide a higher level of immunity protect against gliomas than those loading with C6 cells,which provide a new method in the immuntherapy of brain glioma.     

脑微血管内皮细胞和脑肿瘤干细胞共培养的体外实验研究

目的 研究体外培养条件下,脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMECs)对脑肿瘤干细胞(braintumor stem cells,BTSCs)增殖、自我更新及分化功能的影响.方法 应用Transwell小室建立BMECs与BTSCs共培养模型,并建立对照组,共培养14 d后,测量肿瘤球(brain tumor sphere,BTS)直径大小,检测BTSCs增殖曲线,测定单细胞克隆形成率.在含血清的培养基中培养10 d后,行CD133、Nestin、GFAP、DAPI免疫荧光染色,计数两组的CD133、Nestin、GFAP染色的细胞数及同一视野的DAPI染色细胞核数,观察两组之间的差异.结果 共培养组BTS直径是对照组的5.05倍,增殖快,共培养组有61.4%能形成下一代BTSCs,而对照组为39.0%.在含血清的培养基中培养10 d后,共培养组的GFAP阳性率较对照组低,而CD133、Nestin阳性率较对照组高.结论 BMECs能够促进BTSCs增殖、自我更新能力,保持BTSCs未分化状态.     

神经干细胞壁龛与脑肿瘤干细胞壁龛的相关性研究

脑肿瘤干细胞(braintumor stem cells,BTSCs)发现以来,BTSCs的来源成为研究热点,越来越多的研究表明BTSCs起源于神经干细胞(neural stem sells,NSCs)的基因突变 [1],而最新提出的干细胞壁龛(niche)学说认为壁龛作为十细胞生存的微环境,通过与干细胞之间的直接和(或)间接作用影响干细胞的增殖和分化.