人胚胎视网膜来源神经干细胞体外培养尝试

目的从人胚胎视网膜中分离、培养神经干细胞。方法人16～20周胚胎视网膜制备的单细胞悬液,分别在无血清和有血清条件下进行体外培养,采用免疫荧光法检测培养的细胞对nestin和视网膜终末细胞抗原的表达,采用RT—PCR方法和实时荧光定量PCR法检测诱导前后细胞nestin基因在mRNA水平的表达差异。结果可从人胚胎视网膜神经感觉层中培养出神经干细胞。该细胞具有自我复制能力,表达nestin,经不同条件诱导后细胞表达视网膜视杆细胞、无长突细胞、双极细胞、节细胞和米勒细胞等标志。诱导后细胞nestin基因表达量较诱导前细胞明显降低。结论人胚胎视网膜神经感觉层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。（中华眼科杂志,2005,41：847-852）     

人视网膜祖细胞和脑神经干细胞的体外培养和诱导分化研究

目的比较人视网膜祖细胞和脑神经干细胞的体外分化潜能。方法分离8-12周人胎儿神经视网膜和脑皮质、纹状体神经干细胞,进行无血清体外培养;采用光镜和免疫细胞化学或荧光免疫细胞化学染色方法,分别观察在无血清和10％胎牛血清培养条件下,两种来源的神经干细胞分化后的细胞特性。结果两种来源的神经干细胞,均能在体外有或无血清培养条件下增殖并分化。视网膜祖细胞不但表达视网膜祖细胞标志物Pax-6,也可表达神经干细胞标志物．巢蛋白（Nestin）、成熟神经元标志物-微管相关蛋白2（Map2）、星形胶质细胞标志物-胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、节细胞标志物Thy-1和视杆细胞标志物视紫红质（Rhodopsin）;脑神经干细胞也能表达这些特异性细胞标志物。血清诱导分化时,视网膜祖细胞较难贴壁,贴壁细胞球伸出少而短的突起,单个细胞形态不清;而脑神经干细胞球易贴壁并伸出较长突起交织成网,大量细胞从细胞球中沿突起徙出,单个细胞形态清晰。结论人胎儿视网膜祖细胞和脑神经干细胞体外培养均具有向神经元、胶质细胞及视网膜终末细胞分化的能力;两种干细胞在进行血清诱导分化时,细胞的贴壁、迁移能力及分化后的细胞形态均存在差异。（中华腠科杂志,2006,42：901．907）     

胎儿视网膜前体细胞的分离培养

目的建立视网膜前体细胞的培养方法。方法分离8~12周流产胎儿的视网膜神经上皮细胞，采用悬浮和贴壁两种方法分别进行培养和传代，取传代细胞用含5%胎牛血清的、无碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的培养基诱导分化培养14 d，并采用免疫荧光法检测培养细胞诱导分化前后前体细胞和视网膜终末细胞标记物表达的改变。结果悬浮培养的细胞形成神经球并表达神经干细胞的标记物巢蛋白nestin，但无法成功传代扩增；贴壁培养的细胞可连续传代并表达nestin，传代细胞诱导分化后表达视网膜终末细胞的标记物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、β微管蛋白(β-tubulin)和恢复蛋白recoverin。结论从8～12周的人胚胎视网膜神经上皮分离培养的视网膜前体细胞具有体外扩增和多分化潜能。（中华眼底病杂志，2007，23：98-100）     

大鼠视网膜干细胞与神经干细胞体外增殖、分化特点比较

目的 通过对大鼠视网膜干细胞和神经干细胞体外增殖、分化特点进行比较,进一步明确视网膜于细胞自我更新及向神经细胞方向分化的能力.方法 实验研究.分离出生10 d大鼠睫状体区组织及新生大鼠脑组织,分别应用酶消化法将两种组织制成单细胞悬液,放入含有20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,观察并比较视网膜干细胞及神经干细胞体外增殖的特点.分别取第2代细胞,应用免疫细胞化学染色法检测干细胞特异性抗原神经巢蛋白（nestin）及细胞分裂增殖标志物5-溴脱氧尿核苷（BrdU）的表达.同时,应用含50 ml/L的胎牛血清及1×N2添加剂的培养基促进其分化,观察两种细胞向神经细胞方向分化的特点：分别应用免疫细胞化学染色法对分化后的细胞nestin、神经无标志物神经元特异性烯醇酶（NSE）、神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白（GFAP）进行检测,并应用卡方检验对两种干细胞分化后的NSE及GFAP阳性细胞数比例进行比较.结果 两种细胞原代培养48 h后均可见小的球状细胞团悬浮生长,折光性强.原代培养约7 d后传代,传代后细胞能重新形成球状细胞团,应用免疫细胞化学染色方法均可检测到细胞内nestin及BrdU的阳性表达,视网膜干细胞体外增殖的能力较神经干细胞弱.两种细胞均可在血清诱导条件下转变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞.诱导第7天进行免疫细胞化学染色,检测出两种干细胞表达nestin阳性细胞数比例分别为（9.5±3.5）%及（9.1±0.7）%.视网膜干细胞分化后NSE及GFAP的阳性细胞数比例分别为（11.2±2.8）%及（18.9＋2.1）%,低于神经干细胞分化后两种标志物阳性细胞数比例[（34.1±63）%及（41.9±3.3）%],NSE、GFAP在两组表达的差异均有统计学意义（x2=103.23,P＜0.05;x2=74.36,P＜0.05）.结论 来源于睫状体区的大鼠视网膜干细胞形态、体外增殖及可分化特性与神经干细胞相似,但其增殖及分化为神经细胞的能力较神经干细胞弱.     

人视网膜前体细胞的体外视网膜组织片下移植

目的研究人视网膜前体细胞移植到体外培养的人视网膜组织片下的细胞分化。方法取无眼部发育异常的4～5个月胚胎眼球，进行视网膜前体细胞分离培养。将传代的细胞移植到体外培养的视网膜神经上皮组织片下，通过光学显微镜和免疫组织化学观察细胞分化和组织整合情况。结果人视网膜前体细胞在体外培养时形成神经球样细胞团，传代后形成子代细胞团，表达神经干细胞标志Nestin。体外培养的视网膜组织片在5d、10d均能基本维持视网膜结构。移植到视网膜组织片下的视网膜前体细胞能够与其建立细胞连接。这些视网膜前体细胞分化后能够表达胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白-2和视紫红质，分别为神经胶质细胞、神经元和光感受器细胞的特异蛋白。结论人视网膜前体细胞具有神经干细胞特征，在体外移植到培养的人视网膜组织片下，能够分化成相应的终末分化细胞。     

转化生长因子-β2对体外培养的小鼠视网膜干细胞的诱导分化作用

目的研究转化生长因子（TGF）-β₂是否能促进体外培养的鼠视网膜干细胞的分化及其作用的强弱。方法小鼠胚胎在解剖显微镜下分离视网膜干细胞并进行培养，传代，nestin和chx-10免疫荧光鉴定；将第六代细胞进行诱导分化，并进行抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、抗opsin、抗b-tubulin、抗蛋白激酶C（PKC）免疫荧光染色，鉴定终末细胞。结果培养细胞经TGF-β₂诱导可向成熟细胞分化, 免疫荧光检测显示分化细胞的数量较胎牛血清诱导的分化细胞数量多。结论TGF-β₂能诱导视网膜干细胞分化为视网膜细胞；其诱导分化作用强于单独的血清诱导。(中华眼底病杂志, 2007, 23: 104-107)     

GAP-43在新生大鼠视网膜及其诱导的骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞分化过程中的表达

目的 探讨生长相关蛋白43(growth associated protein,GAP-43)在新生大鼠视网膜发育过程中及在以新生大鼠视网膜细胞诱导体外培养的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)向视网膜神经节样细胞定向分化中的作用.方法 体外培养新生3 d大乳鼠视网膜细胞,应用免疫细胞化学方法检测GAP-43的表达;提取新生大鼠视网膜细胞总RNA,应用RT-PCR方法检测GAP-43 mRNA的表达.体外培养大鼠BMSC至第3代,经流式细胞仪检测干细胞表面标志物进行鉴定,应用乳鼠视网膜细胞诱导BMSC分化,观察诱导后细胞的形态学变化,并应用免疫细胞化学方法对诱导后第5天的细胞进行神经元及视网膜神经节细胞标志物NSE、nestin、GAP-43、thyl.1鉴定,并应用RT-PCR的方法检测、分析GAP-43 mRNA的表达情况.结果 体外培养的新生大乳鼠视网膜细胞应用免疫细胞化学方法可检测到GAP43阳性表达;RT-PcR方法检测到新生大鼠的GAP-43 mRNA的表达;第3代BMSC经流式细胞仪检测CD71(+)、C LY29(+)、CD34(-)、CD45(-),经与大乳鼠视网膜细胞共培养的方法可诱导BMSC分化为视网膜神经节样细胞,免疫细胞化学染色表明其表达特异性标志物NSE、nestin、GAP-43、thyl.1,分化后的神经节样细胞内可检测到GAP-43 mRNA阳性表达:结论本研究结果显示CAP-43不仅参与了大鼠视网膜发育过程,且GAP-43在以乳鼠视网膜细胞诱导BMsc定向分化为视网膜神经节样细胞这一过程中具有重要意义.     

应用组织块培养法对大鼠视网膜干细胞进行分离培养及鉴定

目的:应用组织块培养大鼠视网膜干细胞的有效性。方法:机械分离出生10d大鼠睫状体组织,剪成细小组织块,置入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮生长因子及1×B27添加剂的无血清DMEM/F12培养液中培养,同时取大鼠胚胎脑组织,应用常规机械-酶消化法进行神经干细胞的分离培养作为阳性对照。应用免疫荧光染色检测神经干细胞特异性抗原神经巢蛋白(nestin)的表达,应用含100mL/L的胎牛血清的培养基促进其分化以确定其神经干细胞特性。结果:原代培养48h后在组织块边缘开始出现细胞团,折光性强,呈球形或者桑葚状悬浮生长。培养4～5d后,悬浮生长的细胞团数量增多,出现较大的细胞团,原代培养7d后传代,传代后细胞能重新形成细胞团。应用免疫荧光方法可检测到细胞内nestin阳性表达,且视网膜干细胞可在以血清为诱导条件下变为贴壁生长,并分化出具有神经细胞形态的细胞。其形态、增殖及可分化特性与作为阳性对照的神经干细胞相似。结论:组织块培养法对细胞损伤小,操作简便,可成功对大鼠视网膜干细胞进行分离培养。     

视网膜神经节细胞无血清上清培养液诱导大鼠视网膜干细胞的分化

目的　探讨视网膜神经节细胞无血清上清培养液对视网膜干细胞分化的影响。方法　分离大鼠视网膜干细胞和视网膜神经节细胞;采用免疫荧光法鉴定体外培养的大鼠视网膜干细胞与视网膜神经节细胞,视网膜干细胞以Nestin抗体进行鉴定,视网膜神经节细胞以Thy-1抗体进行鉴定;以视网膜神经节细胞无血清上清培养液培养视网膜干细胞,以不加入条件培养液培养的视网膜干细胞为对照组,收集分化细胞,采用qPCR法检测Nestin、Pax6、Thy-1及Brn-3的基因表达。结果　培养的视网膜干细胞Nestin抗体染色阳性,视网膜神经节细胞Thy-1抗体染色阳性。培养视网膜干细胞72 h后,与对照组相比,无血清上清培养液组细胞Nestin和PAX6基因相对表达量降低,差异均有统计学意义（均为P<0.000 1）;Thy-1和Brn-3基因相对表达量升高,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　视网膜神经节细胞无血清上清培养液能够诱导视网膜干细胞分化为视网膜神经节样细胞。     

大鼠胚胎视网膜中神经干细胞的体外培养与鉴定

目的 培养和鉴定大鼠胚胎视网膜中的神经干细胞.方法 取孕龄16～19 dSD大鼠胚胎鼠的视网膜组织,在干细胞选择性培养基中培养,用免疫组织化学法来检测Nestin和Chx-10的表达.结果 SD大鼠胚胎鼠视网膜中的神经干细胞在体外悬浮生长,形成致密的球形细胞团,传代后能够生成新的细胞团,原代和传代细胞Nestin和Chx-10蛋白均表达阳性.结论 SD大鼠胚胎视网膜内存在神经干细胞,并且可以进行体外培养和扩增.     

Differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells into neural-like cells by co-culture with retinal pigmented epithelial cells

AIM: To detect the differentiation effects of retinal cells or extracts on bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSC). · METHODS: Human fetal BMSC were previously labelled by carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), and co-cultured with retinal pigment epithelial (RPE) cells which were pre-treated with ultraviolet irradiation at a ratio of 1:1 to induce the differentiation of BMSC for up to 14 days. In some assays, a retinal extract of bovine retinal extract (BRE) was added to detect the potential effects of retinal component on the differentiation of BMSC. In addition, Neuron-specific enolase (NSE), Nestin and Glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunostaining were performed to determine the characteristics of BMSC. · RESULTS: The results indicated that by co-cultured with RPE cells, fetal BMSC were differentiated into neural-like cells expressing special neuronal markers Nestin, GFAP and NSE. And the expression of these markers was obviously increased by BRE. · CONCLUSION: Retina derived cells and extracts can induce the differentiation of BMSC into neural-like cells.     

视网膜色素上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞

目的:检测视网膜色素上皮细胞对骨髓间充质干细胞分化的调节作用。方法:体外培养人骨髓间充质干细胞(BMSC)和视网膜色素上皮(RPE)细胞。RPE细胞采用紫外线照射处理,而后与CFSE标记的BMSC共培养14d。并在共培养体系中加入牛眼视网膜提取物(BRE)以研究视网膜成分对此分化过程的影响。采用NSE,Nestin和GFAP抗体标记检测BMSC分化前后的表达特征。结果:BMSC在与RPE细胞共培养后,能够分化成为神经样细胞,并表达神经性细胞的特异性标记NSE,Nestin和GFAP。BRE能够显著促进共培养体系中BMSC向神经样细胞的分化。结论:RPE和BRE能够诱导BMSC分化为神经样细胞。     

四种中间丝蛋白在大鼠视网膜发育过程中表达的时间顺序和结构特征

目的研究视网膜内神经干细胞的标志物及其表达的时间和空间分布特征。方法利用免疫组化染色,检测四种中间丝蛋白(Nestin、Vimentin、GFAP及NF)在新生至12月龄大鼠视网膜内表达的时间顺序、空间分布和强度变化。结果大鼠视网膜结构的分化要到出生后2周才能完成。在2周内Nestin的表达可见于视网膜的神经细胞、胶质细胞、血管内皮细胞内。2周后表达水平明显降低。4周时完全转阴。但在睫状体的少数突起内,Nestin持续高水平表达,成年时,阳性细胞以色素上皮细胞为主。此外,在成年大鼠的视神经内也可见散在的Nestin阳性细胞。Vimentin在神经胶质细胞和睫状体的无色素上皮细胞中一直呈强阳性。除了文献报道的水平细胞外,我们还发现Vimentin在4周内的MUller细胞和无长突细胞内表达。GFAP和NF仅在发育成熟的神经胶质细胞和神经节细胞的轴突内表达。结论Nestin可作为视网膜神经干细胞的标志,成年时视网膜的神经干细胞分布在少数睫状突及视神经内。（中华眼科杂,2004,40：765—769)     

视网膜色素上皮细胞诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞

目的：检测视网膜色素上皮细胞对骨髓间充质干细胞分化的调节作用。方法：体外培养人骨髓间充质干细胞（BMSC）和视网膜色素上皮（RPE）细胞。RPE细胞采用紫外线照射处理,而后与CFSE标记的BMSC共培养14d。并在共培养体系中加入牛眼视网膜提取物（BRE）以研究视网膜成分对此分化过程的影响。采用NSE,Nestin和GFAP抗体标记检测BMSC分化前后的表达特征。结果：BMSC在与RPE细胞共培养后,能够分化成为神经样细胞,并表达神经性细胞的特异性标记NSE．Nestin和GFAP。BRE能够显著促进共培养体系中BMSC向神经样细胞的分化。结论：RPE和BRE能够诱导BMSC分化为神经样细胞。     

Cell culture conditions affect RPE phagocytic function

Background Changes in the phenotype of retinal pigment epithelium (RPE) cells in vitro are associated with medium conditions and changes in function. Main goals in RPE tissue engineering are cell propagation in serum-free defined culture conditions, resulting in cells exhibiting differentiated morphology and functioning in vitro. Methods To compare the effects of various media and supplements on cell function, an optimized high-throughput phagocytosis assay was developed. Adult human SV40-RPE cells were cultured. Test media included: MEM(E), DMEM, F99, SFM and hSFM, with or without supplements. SNAFL-2 labelled OS were added to RPE in vitro for 4 h and phagocytic binding and uptake were measured. Results RPE phagocytosis was of different magnitude depending on the serum-free basic cell culture media in the following order: hSFM, SFM > DMEM, MEM > F99. Choroid-conditioned medium (ChCM) decreased phagocytosis dose dependently. Whereas 1% retinal extract (RE) supplementation increased, higher concentrations decreased phagocytosis. Addition of 10% FCS increased phagocytosis. 15% ChCM quenched the stimulation induced by 10% FCS, an effect which could be reversed by the addition of 1% RE. Conclusions Cell culture media and RPE environmental factors exert substantial and differential alteration of RPE phagocytic ability. Phagocytosis in a serum-free defined medium is superior to unsupplemented basic media, but still differs from serum-supplemented media (F99_RPE) designed for cell propagation. We conclude that media SFM or hSFM promoted phagocytosis most, and application of FCS or 1% RE supports phagocytosis. Unknown factors from neighbouring tissues (retina and choroid) affect phagocytosis differently, suggesting a role in retinal pathogenesis. The results will support identification of specific environmental factors and facilitate design of cell culture media. Support: Werner-Otto Foundation, Pro Retina Germany e.V. (M.O.K.).     

大鼠尾芽胚视杯干细胞的分布与特征

目的探索视杯干细胞在大鼠尾芽胚(第12.5天胚龄)的分布与特征。方法采用免疫组织化学技术，检测视杯干细胞在大鼠尾芽胚(第12.5天胚龄)视杯组织中的分布；分离视杯细胞，体外无血清培养，应用免疫细胞化学技术分析其增生能力以及血清诱导分化前后CHX10和多种成熟视网膜细胞特异性标记蛋白的表达，以了解这一发育时期视杯组织的分化特点。结果大鼠尾芽胚(第12.5天胚龄)的视杯干细胞主要分布在视杯的内外层和边缘层，不表达成熟视网膜细胞特异性标记蛋白。从尾芽胚视杯中分离出的细胞具有单细胞克隆能力，CHX10表达阳性，血清诱导后表达多种成熟视网膜细胞特异性标记蛋白：Thy1.1、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、蛋白激酶C(PKC)α和rhodopsin。结论大鼠尾芽胚(第12.5天胚龄)视杯主要由未分化的细胞组成，视杯干细胞的分布集中在视杯内层和边缘层。体外培养的视杯干细胞增生能力强，经诱导分化后表达多种成熟视网膜细胞特异性标记蛋白。(中华眼底病杂志,2005,21:159-162)