DIDS对Bcl-2/Bax在staurosporine诱导心肌细胞凋亡中表达的影响

目的探讨氯离子通道阻断剂DIDS(4,4′-diisothiocy-ano-2,2′-stilbene-disulfonic acid)对staurosporine(STS)诱导心肌细胞凋亡的调节蛋白Bcl-2/Bax表达的影响。方法在STS诱导心肌细胞凋亡模型上,观察DIDS对心肌细胞存活率、caspase-3活性、Bcl-2/Bax蛋白表达水平及Bax细胞内分布的影响。实验分组:对照组、STS组、DIDS组。结果与STS组比较,DIDS能够明显抑制STS诱导的心肌细胞凋亡发生,心肌细胞存活率增加,caspase-3活性水平降低(P<0.01)。对照组、STS组和DIDS组在全细胞水平上Bcl-2、Bax表达差异无显著性(P>0.01),在亚细胞水平上发现STS组有明显的Bax蛋白从胞质向线粒体转位,DIDS可以抑制STS诱导的Bax线粒体转位。结论DIDS抑制心肌细胞凋亡可能与抑制促凋亡分子Bax由胞质向线粒体转位有关。     

氯通道阻断剂对NO诱导离体大鼠海马神经元凋亡的保护作用

目的观察氯通道阻断剂SITS和DIDS对NO诱导的大鼠离体海马神经元凋亡的保护作用。方法离体培养12d的SD大鼠海马神经元,随机分为正常对照组、NO处理组、NO处理后使用氯通道阻断剂组,对各组神经元分别在相应的时间点进行Hoechst荧光染色观察凋亡细胞数和MTT实验定量检测神经元的存活率,Western blot分析凋亡信号分子Caspase-3的变化。结果SITS和DIDS呈剂量依赖性地抑制NO诱导的神经元损伤,并能抑制损伤所引起的Caspase-3的激活,提高神经元的存活率。结论氯通道阻断剂对NO诱导的大鼠海马神经元凋亡有一定的保护作用。     

氯通道参与姜黄素诱导的乳腺癌MCF-7凋亡

目的： 探讨姜黄素（curcumin）诱导的乳腺癌细胞MCF-7凋亡性途径中氯通道是否参与。方法： MTT检测姜黄素对MCF-7细胞的增殖抑制作用,及用氯通道阻断剂5-nitro-2-（3-phenylpropyl-amino）-benzoate （NPPB）预孵2 h后再加入姜黄素的增殖抑制作用;流式细胞术验证姜黄素诱导细胞的凋亡;采用全细胞膜片钳技术记录加入姜黄素后,细胞氯电流的变化。结果： （1）姜黄素对MCF-7细胞的增殖抑制作用呈现剂量依赖性和时间依赖性。NPPB组与单加入姜黄素组相比,细胞生存率存在明显差异,提示阻滞氯通道可导致姜黄素抑制MCF-7细胞增殖的作用减弱。（2）流式结果表示,加入姜黄素（25 μmol·L^-1）24 h后凋亡率33.16%;而姜黄素（25 μmol·L^-1）+NPPB （100 μmol·L^-1）组凋亡率仅为9.16%,相比对照组（6.26%）、NPPB组（7.31%）,氯通道阻断剂明显抑制姜黄素诱导的MCF-7乳腺癌细胞的凋亡,且对早期凋亡的抑制作用明显。（3）全细胞膜片钳技术结果,细胞外灌流姜黄素（25 μmol·L^-1）可激活乳腺癌细胞MCF-7氯通道的开放,产生氯电流,翻转电位（－3.18±1.30） mV,外向电流密度（3.16±1.42） pA·pF^-1,内向电流密度为（－2.76±1.38） pA·pF^-1,该电流可被氯通道阻断剂NPPB、DIDS完全抑制,细胞外灌流高渗溶液亦可完全抑制该电流。结论： 姜黄素可能通过激活容积敏感性氯通道而诱导细胞的凋亡,氯通道的激活可能在姜黄素诱导肿瘤凋亡通路中起着重要的作用。     

CIC-3氯通道对H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的研究CIC-3氯通道蛋白过表达对H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法蛋白免疫印迹法检测CIC-3蛋白表达；形态学方法、DNA琼脂糖电泳、MTT法和流式细胞仪观察和分析H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变、DNA断裂、细胞存活率、凋亡率及CIC-3蛋白过表达对其影响。结果CIC-3蛋白过表达减轻H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变、DNA断裂及细胞凋亡率，增加细胞存活。结论提示CIC-3氯通道蛋白过表达保护H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡。     

ClC-3氯通道对H_2O_2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的研究C lC-3氯通道蛋白过表达对H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法蛋白免疫印迹法检测C lC-3蛋白表达;形态学方法、DNA琼脂糖电泳、MTT法和流式细胞仪观察和分析H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变、DNA断裂、细胞存活率、凋亡率及C lC-3蛋白过表达对其影响。结果C lC-3蛋白过表达减轻H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变、DNA断裂及细胞凋亡率,增加细胞存活。结论提示C lC-3氯通道蛋白过表达保护H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡。     

Cl~-通道阻断剂对5-HT和CPA引起的兔脑椎基底动脉平滑肌细胞Ca~(2+)内流的影响

目的　在培养的兔脑椎基底动脉平滑肌细胞上观察5 HT和CPA诱导的Ca2 + 内流的特性 ,电压依赖性Ca2 + 通道 (VDC)抑制药尼莫地平 ,非电压依赖性Ca2 + 通道抑制药SK&F963 65及Cl-通道阻断剂DIDS、NPPB对两种激动剂引起 [Ca2 + ]i 反应的影响 ,以探讨脑血管平滑肌细胞中 5 HT引起Ca2 + 内流的特性、Cl-通道与Ca2 + 内流的关系。方法　采用生物荧光双波长影像分析系统瞬即测定单细胞胞质[Ca2 + ]i 技术。结果　① 5 HT和CPA均能诱导平滑肌细胞[Ca2 + ]i 呈双相升高 ,并且 5 HT诱导的Ca2 + 释放是环匹阿尼酸 (CPA)敏感Ca2 + 池的一部分 ;②尼莫地平对 5 HT和CPA触发的Ca2 + 内流无明显影响 ,而SK&F963 65可阻止二者触发的Ca2 + 内流 ;③Cl-通道阻断剂DIDS、NPPB呈浓度依赖性抑制Ca2 + 内流 ,在SK&F963 65最大限度抑制Ca2 + 内流后 ,DIDS、NPPB可进一步抑制Ca2 + 内流 ;而Ca2 +内流被DIDS、NPPB分别最大抑制后 ,SK&F963 65也可进一步抑制Ca2 + 内流。结论　 5 HT引起的Ca2 + 内流是经SK&F963 65敏感的非VDC ,其中包含Ca2 + 释放引起的Ca2 + 内流 (CRAC)成分与非CRAC成分 ,并且这两部分Ca2 +内流均与DIDS、NPPB敏感的Cl-通道开放有关     

左旋龙脑对人脐静脉内皮细胞氯通道和细胞容积的影响

目的研究左旋龙脑对人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)氯通道和细胞容积的作用。方法膜片钳技术记录全细胞氯电流;siRNA干扰技术下调ClC-3表达;动态图像分析测量细胞容积。结果 20 nmol·L~(-1)左旋龙脑能明显激活HUVECs氯电流,电流密度达(79.59±4.90)pA/pF,左旋龙脑激活的电流能被氯通道阻断剂NPPB、DIDS抑制,外向电流抑制率分别为(95.57±2.57)%、(97.28±6.36)%;下调ClC-3氯通道表达后,左旋龙脑激活的氯电流明显减小至(27.03±3.89)pA/pF;左旋龙脑能明显诱导细胞容积缩小(14.38±1.58)%,氯通道阻断剂NPPB阻断左旋龙脑诱导的细胞容积改变。结论左旋龙脑能激活HUVECs的ClC-3氯通道,使Cl-外流诱发细胞容积减小。     

钩吻总碱对肝癌细胞氯通道的激活作用

目的探讨钩吻总碱对肝癌(HepG_2)细胞氯通道的激活作用及对细胞容积的影响。方法活细胞图像法观察记录钩吻总碱作用后HepG_2细胞容积的变化;全细胞膜片钳技术记录钩吻总碱对HepG_2细胞膜电流的作用,通过细胞外灌流高渗液,氯通道阻断剂tamoxifen和5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸(NPPB)研究电流的生理学及药理学特性。结果细胞外灌流钩吻总碱50min,细胞体积减小(12.48±2.2)%(P<0.01),该现象可被氯通道阻断剂tamoxifen抑制。膜片钳结果显示,细胞外灌流钩吻总碱(2μmol·L~(-1))可激活HepG_2细胞膜氯电流,该电流有明显外向优势,无电压及时间依赖性失活,其翻转电位为(-3.21±0.67)mV,接近氯离子平衡电位(-0.9mV),可被氯通道阻断剂tamoxifen和NPPB抑制,细胞外灌流47%高渗溶液亦可明显抑制该电流。结论钩吻总碱可引起肝癌HepG_2细胞体积缩小,诱导凋亡性容积缩小(AVD)发生,该作用可被氯通道阻断剂明显抑制,提示氯通道可能为钩吻总碱抗癌作用的靶点之一。     

氯通道在阿霉素诱导鼻咽癌细胞凋亡中的作用

目的研究氯离子通道在阿霉素诱导的低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞凋亡及凋亡性容积减小中的作用。方法采用全细胞膜片钳技术记录氯电流,流式细胞术检测细胞凋亡,活细胞图像分析法检测细胞容积变化。结果 (1)阿霉素诱导CNE-2Z细胞凋亡;(2)阿霉素诱导CNE-2Z细胞发生凋亡性容积减小,细胞外灌流阿霉素2 h,细胞容积减小约10%;(3)阿霉素可激活氯通道,产生一个有较明显外向优势的氯电流;(4)氯通道阻断剂5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoate(NPPB)明显抑制阿霉素诱导的凋亡性容积减小、细胞凋亡和氯电流。结论阿霉素可通过激活氯通道而诱导细胞凋亡,氯通道在阿霉素诱导的鼻咽癌细胞凋亡中发挥重要作用。     

氯通道阻断剂对KCl、5-HT引起的兔脑椎基底动脉血管环收缩效应的影响

目的　探讨不同种类氯通道阻断剂在不同激动剂引起的脑血管平滑肌收缩反应中的作用。方法　记录离体兔脑椎基底动脉环收缩反应。结果　①氯通道阻断剂DIDS、Furosemide及NPPB均浓度依赖性抑制高K+ 及 5 HT引起血管环收缩反应 ,DIDS、Furosemide及NPPB对 5 HT引起收缩的抑制作用明显强于对KCl的作用 ;②在 5 HT引起血管收缩反应中 ,给予SK&F96 36 5引起血管最大舒张的基础上 ,DIDS、Furosemide及NPPB均可引起血管进一步舒张。结论　氯通道可能参与了由高K+ 去极化和 5 HT引起的兔脑椎基底动脉环收缩反应     

The Cl(-) channel blocker niflumic acid releases Ca(2+) from an intracellular store in rat pulmonary artery smooth muscle cells

The effect of the Cl- channel blockers niflumic acid (NFA), 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)-benzoic acid (NPPB), 4,4'-diisothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonic acid (DIDS), and anthracene-9-carboxylic acid (A-9-C), on Ca2+ signalling in rat pulmonary artery smooth muscle cells was examined. Intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) was monitored with either fura-2 or fluo-4, and caffeine was used to activate the ryanodine receptor, thereby releasing Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR). NFA and NPPB significantly increased basal [Ca2+]i and attenuated the caffeine-induced increase in [Ca2+]i. These Cl- channel blockers also increased the half-time (t1/2) to peak for the caffeine-induced [Ca2+]i transient, and slowed the removal of Ca2+ from the cytosol following application of caffeine. Since DIDS and A-9-C were found to adversely affect fura-2 fluorescence, fluo-4 was used to monitor intracellular Ca2+ in studies involving these Cl- channel blockers. Both DIDS and A-9-C increased basal fluo-4 fluorescence, indicating an increase in intracellular Ca2+, and while DIDS had no significant effect on the t1/2 to peak for the caffeine-induced Ca2+ transient, it was significantly increased by A-9-C. In the absence of extracellular Ca2+, NFA significantly increased basal [Ca2+]i, suggesting that the release of Ca2+ from an intracellular store was responsible for the observed effect. Depleting the SR with the combination of caffeine and cyclopiazonic acid prevented the increase in basal [Ca2+]i induced by NFA. Additionally, incubating the cells with ryanodine also prevented the increase in basal [Ca2+]i induced by NFA. These data show that Cl- channel blockers have marked effects on Ca2+ signalling in pulmonary artery smooth muscle cells. Furthermore, examination of the NFA-induced increase in [Ca2+]i indicates that it is likely due to Ca2+ release from an intracellular store, most probably the SR.     

氯通道阻断剂对T淋巴细胞增殖的影响

目的探讨氯通道开放在Ｔ淋巴细胞增殖过程中的作用。方法新鲜分离成人外周血Ｔ淋巴细胞,以ＣｏｎＡ诱导其增殖,用［３Ｈ］ ＴｄＲ参入法测定并比较氯通道阻断剂ＤＩＤＳ、ＮＰＰＢ、９ ＡＣ、ＮＦＡ、Ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ对Ｔ淋巴细胞增殖的作用;测定钙通道阻滞剂ＳＫ＆Ｆ９６３６５、硝苯吡啶以及免疫抑制剂环孢霉素Ａ（ＣｓＡ）对Ｔ淋巴细胞增殖的作用;比较ＤＩＤＳ、ＮＰＰＢ与ＳＫ＆Ｆ９６３６５或ＣｓＡ的相互作用。结果９ ＡＣ,ＮＦＡ,Ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ对Ｔ细胞增殖无明显抑制作用;ＤＩＤＳ、ＮＰＰＢ呈浓度依赖性地抑制Ｔ细胞增殖,ＩＣ５０分别为１６８２３±３３６和（１２４３５±４２４）μｍｏｌ·Ｌ－１,并显著增强ＳＫ＆Ｆ９６３６５及ＣｓＡ抑制Ｔ细胞增殖的作用,且ＮＰＰＢ增强抑制作用强于ＤＩＤＳ。结论阻断氯通道可抑制ＣｏｎＡ诱导的Ｔ淋巴细胞增殖活化,氯通道开放影响细胞钙运动。     

Cl~-通道在内皮素-1引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用

目的　研究Cl-通道在内皮素 1(endothelin 1,ET 1)引起的血管平滑肌细胞增殖中的作用 ,并探讨其可能的作用机制。方法　通过细胞计数和3H TdR参入实验 ,并结合fura 2 /AM荧光测定胞浆游离Ca2 + 浓度 ([Ca2 + ]i)等技术 ,观察了Cl-通道阻断剂对ET 1引起的 [Ca2 + ]i 变化及血管平滑肌细胞增殖的影响。结果　Cl-通道阻断剂DIDS可呈浓度依赖性地抑制 10nmol·L-1ET 1引起的血管平滑肌细胞增殖 ,其它Cl-通道阻断剂如IAA 94、NPPB、SITS、DPC和速尿均无此作用 ,DIDS也能抑制 10nmol·L-1ET 1引起的内流相 [Ca2 + ]i 升高 ,而对ET 1引起的Ca2 + 释放无影响 ;预先将细胞与 1μmol·L-1nifedipine作用后 ,3μmol·L-1DIDS对 10nmol·L-1ET 1引起的内流相 [Ca2 + ]i 升高及血管平滑肌细胞增殖不再有效 ,将细胞与 10 μmol·L-1SK&F96 36 5预孵后 ,DIDS却能进一步抑制ET 1的上述作用 ;3μmol·L-1DIDS对 30mmol·L-1KCl引起的胞浆[Ca2 + ]i升高无影响。结论　DIDS可通过阻断Cl-通道来抑制ET 1因促发Cl-通道开放经电压依赖性钙通道的Ca2 +内流及细胞增殖 ,DIDS敏感的Cl-通道可能在ET 1促发的Ca2 + 内流及血管平滑肌细胞增殖的调控上都起着重要的作用     

DIDS对SIN-1诱导大鼠海马神经元凋亡及PARP-1/AIF表达的影响

目的观察氯通道阻断剂4,4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸(DIDS)对NO诱导的大鼠离体海马神经元凋亡的保护作用。方法离体培养12 d的SD大鼠海马神经元,随机分为正常对照组、3-吗啡斯德酮亚胺(3-morpholinosyndnomine,SIN-1)处理组、SIN-1+DIDS组。对各组神经元分别在相应的时间点用MTT法测定细胞生存率、Hoechst 33258测定凋亡百分数、免疫化学荧光分析检测凋亡信号蛋白PARP-1/AIF的变化、Western blot分析凋亡蛋白Caspase-3的变化。结果 DIDS呈剂量依赖性地抑制SIN-1诱导的神经元损伤,减少凋亡发生数目,并能抑制损伤所引起的Caspase-3的激活、削弱PARP-1/AIF的表达。结论氯通道可能参与了NO诱导的海马神经元损伤,氯通道阻断剂DIDS的保护作用可能与削弱PARP-1/AIF的表达有关。     

电压依赖性氯通道在3-吗啉斯德酮亚胺诱导的大鼠海马神经元凋亡中的作用

目的探讨氯通道与缺血性脑损伤的关系。方法离体培养12d的SD大鼠海马神经元,分为4组:正常对照组、3-吗啉斯德酮亚胺(SIN-1)处理组(SIN-11.0mmol.L-1作用18h)、SIN-1+4-4-二异硫氰茋-2,2′-二磺酸组(DIDS,0.1mmol.L-1作用18h)及SIN-1+4-乙酰氨基-4′-异氰酸茋-2,2′-二磺酸组(SITS,0.5mmo.lL-1作用18h)。DNA荧光染色观察神经元形态及检测凋亡数目的变化;免疫荧光染色观察神经元两种电压门控氯通道(ClC-2/ClC-3)的表达;全细胞膜片钳技术记录神经元氯通道电流。结果Hoechst33258染色显示,正常对照组、SIN-1处理组、SIN-1+SITS组和SIN-1+DIDS组神经元凋亡百分数分别是:(18.61±0.59)%,(50.43±0.56)%,(23.37±0.52)%和(23.37±0.84)%;两种氯通道ClC-2/ClC-3在正常神经元上存在;SIN-1处理后的神经元氯通道电流较正常增加55%～56%;氯通道阻断剂SITS和DIDS分别能抑制氯通道电流的30%～40%和50%～60%。结论电压依赖性氯通道可能参与了SIN-1诱导的神经元凋亡,氯通道可能参与缺血性脑损伤过程。     

氯通道阻断剂和白头翁皂苷的协同溶血作用

目的研究氯通道阻断剂对白头翁皂苷溶血的影响。方法用细胞图像软件记录并分析白头翁皂苷的溶血过程,检测红细胞溶血率,并观察氯通道阻断剂对白头翁皂苷溶血的影响。结果白头翁皂苷药物引起人红细胞溶血,溶血作用呈浓度依赖性,在0.5～2 mmol.L-1范围内,随药物浓度增高,溶血率越高,且红细胞发生溶血所需时间越短。氯通道阻断剂NPPB、tamoxifen可以促进白头翁皂苷的溶血作用,与单用白头翁皂苷组比较,在相同作用时间条件下,联合应用白头翁皂苷与氯通道阻断剂(NPPB、tamoxifen)时,溶血率明显提高,且发生红细胞全部溶血所需的时间明显缩短。结论白头翁皂苷溶血作用呈浓度依赖性,氯通道阻断剂与白头翁皂苷有协同溶血作用。