不同培养时间对NIT-1细胞胰岛素分泌及相关基因表达的影响

目的：研究体外生理浓度葡萄糖培养胰岛β细胞株NIT-1细胞在不同时间出现的功能变化及其可能机制。方法：观察5.6 mmol/L葡萄糖浓度的DMEM完全培养基培养的NIT-1细胞在 8周培养时间内细胞的形态变化；胰岛素免疫细胞化学染色；应用放射免疫法测定8周葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平；并以RT-PCR半定量测定各基因Insulin、Glut2、GK、PDX-1、NeuroD1、Pax4、Pax6 mRNA表达水平变化。结果：（1）传代培养过程中细胞生长良好呈多边形，不同培养时间的NIT-1细胞形态无显著差异；（2）胰岛素免疫细胞化学染色示GSIS组胞浆染色阳性，呈淡黄褐色；（3）1-8周每周测定的葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）与第1周数据比较，显示胰岛细胞分泌功能改变差异显著（P<0.05）；（4）1-8周每周测定的胰岛素基因、PDX-1基因、GK基因、Glut2基因、NeuroD1基因和Pax6基因mRNA的表达与第1周比较，显示基因mRNA的改变差异显著（P<0.05）； Pax4基因mRNA的改变无显著差异（P>0.05）。结论: 生理浓度葡萄糖培养的NIT-1细胞的葡萄糖刺激的胰岛素分泌功能随体外培养时间的延长呈逐步下降趋势；这可能与维持β细胞功能有关的基因Insulin、PDX-1、 GK、Glut2、NeuroD1 和 Pax6 表达下降有关。     

11β-羟类固醇脱氢酶1型基因沉默对胰岛β细胞系NIT-1葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响

目的观察RNA干扰阻断胰岛β细胞系NIT-1中11β-羟类固醇脱氢酶1型(11β-HSD1)表达对细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌(GSIS)的影响。方法pSuper质粒为载体,构建针对11β-HSD1基因的质粒oligo886、oligo866和乱序对照质粒oligoScr886,转染NIT-1细胞,RT-PCR和蛋白印迹法检测11β-HSD1mRNA和蛋白表达。oligo886重组质粒转染25 mmol/L葡萄糖培养基中的NIT-1细胞,测GSIS。结果转染oligo886和oligo866质粒的NIT-1细胞11β-HSD1mRNA分别下降78.1%±2.9%和51.7%±2.7%,11β-HSD1蛋白的水平分别下降82.2%±2.1%和56.5%±2.0%。oligo866转染25 mmol/L葡萄糖培养基中的NIT-1细胞后,GSIS较对照组明显升高(P<0.01)。结论11β-HSD1基因沉默能改善NIT-1细胞的葡萄糖刺激胰岛素分泌能力,提示胰岛β细胞NIT-1通过11β-HSD1调节糖皮质代谢,参与葡萄糖刺激胰岛素分泌。     

L-carnosine对NIT-1胰岛细胞的影响及机制

目的: 研究肌肽(L-carnosine)对高糖培养的NIT-1细胞胰岛素分泌、增殖和凋亡的影响及机制。方法:(1)正常和高糖培养细胞72 h,放射免疫法测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌,然后分别换不同浓度葡萄糖和L-carnosine培养,测定胰岛素分泌;(2)细胞分为C组(11.1 mmol/L glucose)、H组 (33.3 mmol/L glucose)、H+A组(33.3 mmol/L glucose +1 mmol/L L-carnosine)和H+B(33.3 mmol/L glucose+ 20 mmol/L L-carnosine)组培养72 h,BrdU检测细胞增殖,流式细胞术检测凋亡,RT-PCR测定bcl-2和caspase-3 mRNA的表达,荧光法检测caspase-3活性。结果:(1)高糖组细胞胰岛素分泌减少; 20 mmol/L L-carnosine显著增加正常和高糖组胰岛素分泌(P<0.01),且呈正相关(P<0.01);(2)高糖组细胞增殖和凋亡均增加(均P<0.01),但总体数目减少;1 mmol/L L-carnosine使增殖增加,凋亡减少(P<0.01);(3) 高糖组caspase-3 mRNA表达明显增加,bcl-2 mRNA明显减少(P<0.05);1 mmol/L L-carnosine使前者明显减少(P<0.05),后者明显增加(P<0.01);不同浓度L-carnosine均明显降低caspase-3活性。结论: 高浓度L-carnosine可单独刺激细胞分泌胰岛素,低浓度的L-carnosine可增加NIT-1细胞增殖并减少高浓度葡萄糖所导致的凋亡。Caspase-3和Bcl-2可能参与了L-carnosine保护NIT-1细胞的过程。     

苯丙酸诺龙促进胰岛NIT-1细胞Nampt表达和胰岛素分泌

目的探讨雄性激素苯丙酸诺龙在氧化应激条件下对胰岛细胞的作用,为2型糖尿病治疗提供理论依据。方法将培养的NIT-1细胞按不同葡萄糖浓度(5.6、11.1、16.7和27.6 mmol/L)分为4组,分别用10μg/mL苯丙酸诺龙处理48 h,之后用流式细胞仪检测细胞周期;用Western blot检测Nampt和FOXO1蛋白表达和用放射免疫法测定细胞胰岛素分泌。结果用苯丙酸诺龙处理48 h后,1)低糖条件下细胞G0/G1期阻滞明显改善(P0.01);2)高糖条件下细胞G2/M期阻滞得到缓解(P0.01);3)高糖氧化应激状态下,苯丙酸诺龙促进胰岛细胞Nampt表达(P0.05)和抑制非磷酸化的FOXO1蛋白表达(P0.01),细胞分泌胰岛素增加。结论苯丙酸诺龙能够在高浓度葡萄糖条件下改善胰岛细胞生存状况和促进胰岛素分泌,这些效应可能与促进细胞内Nampt表达和抑制FOXO1密切相关。     

葡萄糖上调胰岛β细胞系NIT-1 11β-羟类固醇脱氢酶1型的表达

目的　探讨葡萄糖对胰岛β细胞系NIT-1上11β-羟类固醇脱氢酶1型（11β-HSD1）的表达及其功能的影响。方法　用细胞免疫化学染色、RT-PCR和Western blot法检测NIT-1细胞11β-HSD1mRNA及蛋白表达。分别用含10、15、20和25mmol/L葡萄糖的Ham's F12培养液培养NIT-1细胞72h,检测11β-HSD1mRNA和蛋白表达水平,用葡萄糖刺激释放（GSIS）试验评价胰岛β细胞功能。结果 (1) 胰岛NIT-1细胞胞质里有棕黄色阳性染色颗粒,并有11β-HSD1mRNA和蛋白表达,(2) 15、20和25mmol/L葡萄糖组11β-HSD1表达增加(P＜0.05,P＜0.01),葡萄糖刺激胰岛素分泌减少(P＜0.05,P＜0.01)。结论 11β-HSD1在胰岛NIT-1细胞上有表达,糖皮质激素可能参与胰岛β细胞胰岛素分泌功能。     

FK506对NIT-1细胞增殖和胰岛素分泌的影响

目的 探讨他克莫司(FK506)对NOD鼠胰岛β细胞系(NIT-1)增殖、凋亡和胰岛素分泌的影响.方法 用MTT法、流式细胞术检测NIT-1细胞增殖;放射免疫法、real-time PCR检测NIT-1细胞胰岛素分泌和胰岛素分化相关基因PDX-1、GLUT2和GK mRNA的表达.结果 FK506(20 μg/L)抑制NIT-1细胞增殖(P＜0.05),诱导细胞凋亡(P＜0.05);FK506(10 μg/L)抑制NIT-1细胞释放胰岛素(P＜0.05),胰岛素分泌相关基因PDX-1(胰岛素促进因子-1)、GLUT2(葡萄糖转运载体2)mRNA表达下调(P＜0.05).结论 FK506(10 μg/L)可抑制NIT-1的增殖,诱导凋亡,可通过下调PDX-1和GLUT2 mRNA表达,抑制NIT-1胰岛素分泌.     

钙调神经磷酸酶信号通路参与PGF2α诱导的心肌细胞肥大

目的： 研究前列腺素F₂α（PGF₂α）诱导心肌细胞肥大的作用及其细胞内信号转导通路。方法：利用乳鼠心肌细胞培养，以细胞直径、蛋白质含量和心房利钠因子（ANF）mRNA表达为心肌肥大反应指标，观察PGF₂α致心肌肥大效应。采用Fura-2/AM为荧光指示剂测定心肌细胞内钙浓度（［Ca²⁺］_i）；RT-PCR法半定量测定mRNA表达；Western blotting方法检测蛋白表达。结果：随着PGF₂α 浓度升高（10^-10-10^-5 mol/L），心肌细胞直径、蛋白含量和［Ca²⁺］_i均明显高于溶剂对照组（P﹤0.01）；PGF₂α 10^-7 mol/L使ANF mRNA表达明显高于对照组（P﹤0.01）；钙调神经磷酸酶（CaN）mRNA及CaN信号通路（含CaN及其下游因子NFAT₃和GATA₄）蛋白的表达亦明显高于对照组（P﹤0.05）。加入CsA（CaN阻断剂）后，PGF₂α诱导的心肌细胞肥大和［Ca²⁺］_i升高的作用明显降低（P﹤0.01），CaN mRNA和CaN信号通路蛋白的表达亦明显减少（P﹤0.05）。结论： PGF₂α诱导的心肌细胞肥大至少部分与其升高［Ca²⁺］_i从而激活CaN信号转导通路有关。     

小檗碱对高糖高脂诱导的NIT-1胰岛β细胞凋亡的影响

目的：探讨小檗碱对高糖高脂诱导的NIT-1胰岛β细胞凋亡的影响。方法：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法比较不同浓度的小檗碱对体外培养及高糖高脂诱导的NIT-1胰岛β细胞凋亡的作用，同时应用流式细胞术及原位末端核苷酸标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。结果：不同浓度的小檗碱对NIT-1胰岛β细胞作用呈剂量依赖性：低浓度小檗碱（≤5 μmol/L） 对细胞无明显毒性，随浓度升高毒性作用明显。在培养基中加入高糖高脂及低浓度的小檗碱共同培养24 h, 小檗碱组细胞凋亡率低于高糖高脂组（P<0.01）。结论：小檗碱能抑制高糖高脂诱导的NIT-1胰岛β细胞凋亡。     

TNF-α通过死亡受体途径促进IFN-γ诱导NIT-1细胞凋亡

目的：探讨TNF-α和IFN-γ对小鼠胰岛β细胞株NIT-1细胞凋亡的影响及其可能的分子机制。方法：用MTT法检测TNF-α和IFN-γ单独或联合作用对NIT-1细胞活力的影响,倒置显微镜观察NIT-1细胞形态变化,Hoechst 33258荧光染色后激光共聚焦显微镜观察细胞核形态的变化,Western blot技术检测凋亡相关蛋白Caspase-8,-3和PARP的活化。结果：TNF-α联合IFN-γ处理明显抑制了NIT-1细胞的活力,诱导了细胞的凋亡,促进了凋亡蛋白Caspase-8,-3和PARP的活性。结论：TNF-α通过细胞凋亡的死亡受体途径信号传递促进了IFN-γ诱导的NIT-1细胞凋亡。     

前列腺素E2抑制转化生长因子-β1诱导的人胚肺成纤维细胞转分化及胶原合成

目的：研究前列腺素E₂（PGE₂）对转化生长因子-β₁（TGF-β₁） 诱导人胚肺成纤维细胞（HLF）转分化及促胶原(COL)合成作用的干预。方法： HLF 细胞生长至融合后分为 ①对照组、②TGF-β₁组、③TGF-β₁+PGE₂组、④TGF-β₁+吲哚美辛组，给予干预24 h后用细胞免疫荧光及Western blotting法观察发生转分化为肌成纤维细胞的标志蛋白 α-平滑肌动蛋白（α-SMA）的表达，用RT-PCR法检测结缔组织生长因子（CTGF）mRNA和Ⅰ型胶原（COLⅠ）mRNA的水平，用免疫细胞化学法检测CTGF蛋白表达，比色法检测培养上清中羟脯氨酸含量。结果: TGF-β₁ 可将HLF转分化为 α-SMA 阳性表达的肌成纤维细胞，PGE₂则能抑制这种转分化作用；PGE₂ 可显著减低TGF-β₁ 致肌成纤维细胞、CTGFmRNA与蛋白水平（P<0.05）和COLⅠmRNA 水平升高（P<0.05）； 吲哚美辛升高TGF-β₁ 致HLF肌成纤维细胞CTGF与COLⅠ的表达； 放线菌酮预处理肌成纤维细胞3 h后再加入TGF-β₁＋PGE₂，其COLⅠmRNA 水平明显低于TGF-β₁ 处理组水平（P<0.05）。结论: PGE₂可抑制TGF-β₁ 对成纤维细胞的转分化及促胶原合成作用, 且可通过依赖CTGF和非依赖2种方式下调COLⅠ的转录。     

葡萄糖对新生大鼠胰β细胞影响的图像分析研究

实验选用Ｗｉｓｔａｒ新生大鼠，于出生后第２天起腹腔注射葡萄糖共６天。出生后第１０天剖腹取胰腺，常规石蜡包埋，免疫组织化学ＰＡＰ法显示β细胞、使用图像分析仪测量胰岛大小、β细胞免疫阳性切面面积及其相对灰度。结果显示：实验组β细胞免疫阳性反应面积明显增大。提示葡萄糖可促进新生大鼠胰β细胞胰岛素含量的增多。     

G蛋白偶联受体40在游离脂肪酸影响小鼠胰岛NIT-1细胞脂性凋亡中的作用

目的： 探讨G蛋白偶联受体40（GPR40）是否介导游离脂肪酸(FFAs)对小鼠胰岛NIT-1细胞脂性凋亡的影响及其可能机制。方法: 观察棕榈酸、油酸(500 μmol/L, 48 h) 对NIT-1细胞凋亡的影响,用Hoechst 33342染色、TUNEL及流式细胞仪检测凋亡。并利用siRNA技术抑制GPR40在NIT-1细胞表达,观察棕榈酸、油酸对GPR40表达抑制细胞脂性凋亡的影响,行Western blotting观察Bcl-2、Bax和p-c-Jun表达。结果: 棕榈酸长期作用可诱导NIT-1细胞凋亡;而油酸可抑制棕榈酸对NIT-1细胞的诱导凋亡作用。 抑制GPR40表达后,空转组、control siRNA、GPR40 siRNA转染细胞分别予棕榈酸孵育48 h,3组间细胞凋亡率差异无显著;3组细胞分别予棕榈酸、油酸共孵育48 h,GPR40 siRNA转染细胞凋亡率明显高于空转组细胞,差异显著（P<0.05）,Western blotting显示这一过程伴随c-Jun磷酸化水平下降、Bcl-2、Bax表达无明显变化。结论: GPR40未参与饱和脂肪酸诱导的β细胞凋亡,而介导了不饱和脂肪酸对脂性凋亡的抑制作用,c-Jun可能参与这一过程。提示GPR40 参与调节β细胞适应性,为探讨肥胖和T2DM的关系提供了新的线索。     

IGFBP2、IGFBP6在TGF-β1活化的肝星状细胞中表达

目的： 观察胰岛素样生长因子结合蛋白2、6（IGFBP2、IGFBP6）在转化生长因子β₁（TGF-β₁）诱导活化后的肝星状细胞中的表达变化。方法：大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）体外培养，分别设立空白对照组（加入等量PBS）、不同浓度的TGF-β₁ 处理组，处理因素作用24 h，采用免疫细胞化学染色、Western blotting检测IGFBP2、IGFBP6在HSC-T6中的表达。结果：免疫细胞化学染色及Western blotting结果发现，TGF-β₁各处理组IGFBP2、IGFBP6的表达均较空白对照组显著增强。结论：IGFBP2、IGFBP6在TGF-β₁诱导活化后的HSC-T6中表达明显增强，IGFBP2、IGFBP 6可能参与了肝纤维化的形成。     

Tubacin对β细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响

目的：观察去乙酰化酶HDAC6特异性抑制剂Tubacin对MIN6细胞胰岛素分泌的影响,并探讨其可能机制。方法：用RT－PCR检测去乙酰化酶家族成员在MIN6细胞的表达,用免疫荧光技术观察HDAC6在小鼠胰岛和MIN6细胞内的定位;分别在5．6mmol／L和25mmol／L葡萄糖的DMEM中加和不加10μmol／LTubacin,用其处理MIN6细胞24h,收集上清,ELISA检测胰岛素浓度。同时用MTT法检测Tubacin对MIN6细胞活力的影响,RT－PCR检测上述处理条件下Insulin基因的表达情况。以Westernblot和免疫荧光技术检测Tubacin对MIN6细胞骨架蛋白α－tubulin乙酰化水平的影响。结果：MIN6细胞中各乙酰化酶家族成员mRNA的表达水平相差较大,其中HDAC6表达相对较高。HDAC6主要表达于小鼠胰岛B细胞及MIN6细胞胞浆中。在5．6imnol／L和25mmol／L葡萄糖条件下,Tubaein处理24h可以显著抑制胰岛素分泌,但不影响MIN6细胞活力。同时,在5．6mmol／L葡萄糖存在条件下Tubacin不影响胰岛素基因表达,在25mmol／L葡萄糖存在条件下Tubacin可轻度上调胰岛素基因表达。Westernblot和免疫荧光结果发现,Tubacin抑制胰岛素分泌的同时伴有α—tubulin乙酰化水平增加。结论：HDAC6抑制剂Tubacin可能通过增加MIN6细胞d．tubulin乙酰化水平,改变细胞骨架的活动度而抑制胰岛素分泌。     

IL-1β促进Schwann细胞增殖及分泌NGF的研究

为观察白介素-1β(IL-1β)对Schwann细胞增殖及分泌神经生长因子(NGF)的影响,本研究取3d龄的大鼠坐骨神经纯化培养Schwann细胞,然后分4组进行处理。处理方法为:A组加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,B组仅在纯化后第1d向培养基中加入2.0ng/mlIL-1β,C组每天向培养基中加入2.0ng/mlIL-1β,D组隔天向培养基中加入2.0ng/mlIL-1β,分别培养5d。倒置显微镜下观察Schwann细胞的形态,用抗S-100蛋白免疫组化鉴定Schwann细胞,经流式细胞仪(FCM)检测细胞的分裂增殖情况,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测NGFmRNA表达的变化,酶联免疫吸附分析法(ELISA)检测细胞培养基中NGF蛋白的表达量。结果显示:D组Schwann细胞增殖率、NGFmRNA合成量和NGF蛋白表达量均显著高于其他三组(P<0.05)。此结果说明IL-1β能够促进Schwann细胞的分裂增殖,并且促进胞内NGFmRNA的合成及胞外NGF的分泌,其作用持续时间大约为2d。     

DM2患者血糖水平与胰岛素抵抗和β细胞功能关系的初步研究

目的:探讨不同血糖水平的2型糖尿病患者真胰岛素(TI)、胰岛素原(PI)、免疫反应性胰岛素(IRI)、免疫反应性C肽(IRC)间的相关性,初步分析胰岛素抵抗(Homa-IR)和β-细胞功能(Homa-β)与血糖水平的关系。方法:检测73例2型糖尿病患者的空腹和餐后TI、PI、IRI和IRC,将所有研究对象分为A组(空腹血糖,FBG≥8. 80mmol/L)和B组(FBG<8. 80mmol/L),用稳态模型(Homa-model)计算胰岛素抵抗(Homa-IR)和β细胞功能(Homa-β),分析A、B组TI、PI、IRI和IRC水平的相关性和Homa-IR、Homa-β在A、B组中的作用。结果:A、B两组以TI、IRI计算的Homa-β有显著性差异,以TI计算的Homa-IR无差异,而以IRI计算的Homa-IR有差异;A组C肽与免疫反应性胰岛素、真胰岛素和胰岛素原间的相关性不及B组;B组的TI、TI120显著高于A组,而IRI、IRI120、PI、PI120、CP、CP120无显著性差异。结论:β细胞功能的衰竭在糖尿病患者血糖水平的变化中可能是主要因素,胰岛素抵抗在高、低血糖的变动中可能维持在平衡状态。检测真胰岛素和胰岛素原在正确评价糖尿病患者胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能有重要意义。糖尿病的防治可能应关注患者胰岛β细胞功能的变化。     

糖尿病大鼠心肌TGF-β1表达及细胞凋亡的实验研究

目的:研究糖尿病大鼠心肌转化生长因子β1(TGF-β₁)表达水平和细胞凋亡的变化，探讨糖尿病性心肌病的病理生理机制。方法：链脲菌素法复制不同病程的糖尿病模型。免疫组化方法测定TGF-β₁的表达。DNA断端末端标记法测定心肌细胞凋亡指数。结果：糖尿病大鼠心肌细胞TGF-β₁表达明显高于正常对照组（P<0.01）。TUNEL法测定心肌细胞的凋亡阳性细胞数量在糖尿病早期明显高于正常，晚期有所减少。结论：TGF-β₁在糖尿病的心肌中表达增加，且随病程发展而上升，可能是糖尿病心肌纤维化的重要促发因子。糖尿病心肌中细胞凋亡现象随病程延长而逐渐减弱，机制有待探讨。     

IL-1β对大鼠腹膜间皮细胞葡萄糖转运蛋白1表达的影响

目的:研究白介素1β(Interleukin-1beta,IL-1β)对原代培养大鼠腹膜间皮细胞(PMCs)葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)表达的影响,为防治腹透失超滤提供理论依据及方法。方法:胰蛋白酶消化法进行雄性Wistar大鼠PMCs的原代培养及传代,不同浓度IL-1β(0、1、10、50 ng/ml)作用不同时间(0、1、12、24、48小时),逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测GLUT1的mRNA表达,Western blot检测GLUT1蛋白的表达,生化分析仪检测培养液内葡萄糖浓度的变化,以培养液内葡萄糖的减少量作为细胞对葡萄糖的净利用。结果:IL-1β以浓度及时间依赖方式促进GLUT1 mRNA及蛋白的表达(P<0.05),同时伴有葡萄糖向细胞内转运的增加,50 ng/ml IL-1刺激48小时后GLUT1 mRNA表达与对照组相比增加了近4倍(P<0.01)。结论:IL-1β可以使PMCs细胞GLUT-1表达和葡萄糖摄取增加,这为防治腹透相关腹膜纤维化及腹透失超滤提供了线索。     

ANXA1拮抗IL-1β导致的胰岛β细胞功能损伤的机制

目的探究ANXA1拮抗IL-1β引起的胰岛β细胞功能缺陷的作用及机制.方法将ANXA1基因插入pCMV-HA载体中,构建ANXA1过表达质粒,将其转染入小鼠胰岛β细胞系βtc-6细胞后,用IL-1β处理上述细胞,借助于MTT、葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验(GSIS)等方法研究ANXA1对胰岛β细胞的保护作用.结果IL-1β导致胰岛β细胞ANXA1表达降低,同时出现胰岛β细胞存活率下降以及胰岛素合成和分泌量减少;而过表达ANXA1可拮抗上述现象的发生.结论ANXA1保护胰岛β细胞免受IL-1β造成的细胞凋亡增加与功能下降.