hfgl2凝血酶原酶短干扰RNA表达质粒的构建及其效应

目的 探索人fg12凝血酶原酶(hfg12)短干扰RNA(siRNA)在体外对hfg12凝血酶原酶基因表达的干预效应.方法 构建产生hfg12短发夹状RNA(shRNA)的载体p-hfg12shRNA,将其与hfg12-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因表达质粒pEGFP-hfg12共转染到中国仓鼠卵母细胞(CHO细胞),转染48 h后,倒置荧光显微镜下观察EGFP在CHO细胞中的表达,并通过流式细胞仪检测荧光细胞阳性率.将P-hfg12shRNA和hfg12表达质粒pcDNA3.1-hfg12共转染到CHO细胞,通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学检测hfg12基因转录和蛋白表达水平的变化.分为4组:共转染p-hfg12shRNA和pcDNA3.1-hfg12为干预组,共转染无关序列shRNA表达质粒和pcDNA3.1-hfg12为非相关干预组,仅转染pcDNA3.1-hfgl2为未干预组,不转染任何质粒为空白组.结果 在CHO细胞中,含p-hfg12shRNA的干预组较未干预组和非相关干预组的绿色荧光强度明显减弱,荧光细胞数明显减少;荧光表达阳性细胞率:干预组α为6.5%±0.2%,未干预组0t为40.1%±1.8%,两组比较,x<,2>=8.056,P<0.01,差异有统计学意义.抑制效率达85.5%.hfg12shRNA显著抑制了hfg12 mRNA和蛋白质的表达,干预组hfg12 mRNA水平为0.11±0.01,未干预组为0.84±0.06,两组比较,F=10.7,P<0.01,差异有统计学意义.结论 p-hfg12shRNA可在体外高效特异地抑制hfg12基因转录和蛋白的表达,为进一步的体内干扰实验奠定了基础.     

三元复合因子Net对人胰腺癌细胞株BxPC3增殖的影响

目的研究三元复合因子Net转染人胰腺癌细胞株BxPC后的表达状态及对原癌基因c—fos表达的影响。方法采用脂质体2000将重组人pEGFP—Net质粒和空质粒pEGFP转染人胰腺癌BxPC3细胞株,建立稳定高表达Net的细胞系。应用MTT、流式细胞仪等方法检测胰腺癌细胞的增殖,应用实时定量PCR和Western blotting检测Net及c—fos mRNA和蛋白的表达。结果BxPC3细胞低表达Net,转染pEGFP-Net后稳定高表达Net,并抑制c-fos的表达。转染pEGFP—Net的细胞生长缓慢,转染后第3、5、7天的抑制率分别为38．8％、55．3％、56．9％,显著高于空质粒转染组的5．1％、12．4％、8．6％（P〈0．05）;G0／G1期细胞占（61．8±5．7）％,显著高于空质粒转染组的（45．1±3．4）％。结论三元复合因子Net能抑制人胰腺癌BxPC3细胞的增殖,其机制可能与抑制c—fos表达有关。     

人分泌型Klotho蛋白在CHO细胞中的稳定表达

目的 在CHO细胞中稳定表达人分泌型Klotho（hsKL）蛋白，制备具有天然结构的重组hsKL（rhsKL）蛋白。方法 用PCR法自克隆载体pBS—hsk1中克隆hsKL DNA，构建真核表达载体pcDNA3．1／Zeo（＋）-hskl。经核酸测序确证后，阳离子聚合物转染CHO细胞。用PCR法筛选具有Zeocin抗性的阳性细胞克隆，SDS—PAGE（银染色）法确定CHO细胞分泌蛋白的分子量，Western印记法鉴定CHO细胞的培养上清液中的rhsKL蛋白，确定稳定转染细胞株CHO—hsKL。结果 经PCR法克隆的序列与Gene Bank登录的bskl mRNA序列一致。将hsKL DNA定向插入pcDNA3．1／Zeo（＋），构建pcDNA3．1／Zeo（＋）．hsk1真核表达载体并通过阳离子聚合物转染CHO细胞获得Zeocin抗性的转染阳性克隆。SDS—PAGE和Western blot分析显示，转染的CHO培养上清中含有分子量约为66kDa的rhsKL蛋白。结论 首次实现天然结构的hsKL蛋白的重组表达——获得稳定表达细胞株CHO—hsKL。     

重组转化生长因子β3基因对大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察转化生长因子D3基因（TGFβ3）对大鼠肝星状细胞株（HSC—T6）Ⅰ型胶原合成的影响。方法TGFβ3表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFβ31和TGFβ1表达质粒[pcDNA3．1（＋）-TGFD11的构建。通过脂质体介导方法，将pcDNA3．1（＋）-TGFβ1、pcDNA3．1（＋）-TGFβ3分别及共同转染体外培养的HSC—T6细胞，荧光定量PCR法及Westernblot法分别检测转染后TGFβ1、TGFD3、Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达。将pcDNA3．1（＋）-TGFD1转染HSC—T6细胞，经G418筛选建立高表达TGFD1的HSC～T6细胞克隆，pcDNA3．1（＋）-TGFD3转染克隆细胞，荧光定量PCR法检测转染后TGFβ3、TGFβ1及Ⅰ型胶原mRNA的表达，Westernblot法检测TGFβ1、Ⅰ型胶原蛋白的表达情况。结果构建的pcDNA3．1（＋）TGFD3、pcDNA3．1（＋）-TGFD1质粒可转染HSC—T6细胞，转染率28．2％。pcDNA3．1（＋）TGF侈3转染细胞后，Ⅰ型胶原mRNA及蛋白的表达较空白组及对照组增加，以72h增高最为明显（P〈0．05）；共转染组Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质的表达较pcDNA3．1（＋）-TGFβ1转染组明显降低（P〈0．05）。TGF侈3转染克隆细胞后，TGFD1mRNA表达较克隆组无明显改变（P〉0．05），而蛋白质表达明显下降（P〈0．05），Ⅰ型胶原mRNA及蛋白质表达均较克隆组明显降低（P〈0．05）。结论TGFD3基因转染正常培养的HSC—T6细胞，增加Ⅰ型胶原的表达；转染高表达TGFβ1的克隆组HSC—T6细胞，Ⅰ型胶原表达明显降低，提示TGFβ3对肝纤维化的发生有抑制作用。     

慢病毒载体PLKO．1-shHIF-2α的构建及鉴定

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）标记的干涉缺氧诱导因子（HIF）-2α表达的慢病毒载体,并对所得产物进行鉴定。方法体外合成的单链HIF-2α干涉片段经过退火后形成的双链片段和以质粒 PCDH为模板扩增出的EF1-EGFP 均与PLKO．1-puro连接,形成重组的慢病毒载体质粒PLKO．1-shHIF-2α,后者与pMD2G,pSAX2共转染293 FT细胞中进行包装,产生重组慢病毒颗粒。用其感染786-0细胞,检测细胞中GFP表达情况。结果成功扩增出干涉HIF-2α片段和EF1-EGFP片段,酶切鉴定及测序均证实PLKO．1-shHIF-2α质粒构建成功。转染293FT细胞产生的重组慢病毒颗粒感染786-0细胞后高表达绿色荧光。结论成功构建了高效的带GFP报告基因并稳定干涉HIF-2α表达的慢病毒载体。     

旋毛虫DNA疫苗在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的　观察编码旋毛虫相对分子质量(Mr)31000抗原的DNA疫苗(重组真核表达质粒pcDNA3 TspE1)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的体外表达 ,并分析其表达产物的抗原性。　方法　通过用阳离子脂质体Lipofectamine2000将重组质粒pcDNA3 TspE1转染CHO细胞,G418筛选阳性克隆,用逆转录聚合酶链反应(RT PCR)、间接荧光抗体试验(IFAT)、十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)和蛋白质印迹法(Westernblotting)对表达产物进行鉴定。　结果　RT PCR结果显示,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞在876bp处有一条带,而用空质粒pcDNA3转染的CHO细胞未出现条带,表明pcDNA3 TspE1转染细胞中有TspE1基因转录。IFAT结果显示,pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞与重组融合蛋白免疫小鼠血清反应呈现亮绿色荧光 ,而pcDNA3转染的CHO细胞及未转染细胞呈现橘黄色。Westernblotting显示在pcDNA3 TspE1转染的CHO细胞培养液中存在有一Mr约31000的蛋白带 ,且该条带能被重组融合蛋白免疫小鼠血清、旋毛虫肌幼虫可溶性抗原免疫兔血清、感染旋毛虫的小鼠及旋毛虫病患者血清识别。　结论　重组质粒pcDNA3 TspE1可转染CHO细胞,旋毛虫TspE1基因可在转染的CHO细胞中表达,表达蛋白能分泌到细胞培养上清中且具有旋毛虫     

三种板蓝根制剂对流感病毒核蛋白表达的影响

目的探讨不同板蓝根制剂对甲型流感病毒核蛋白（NP）的作用,寻找抗流感病毒中药的有效成分。方法采用传统水煮浸法提取的板蓝根水煎液和有机溶剂浸泡法提取的板蓝根凝集素及购买的板蓝根注射液,用细胞病变效应（CPE）法测得三种制剂试验浓度分别为1.95、2.60、0.78 mg/ml。将培养的Hela细胞分为八组,质粒组转染pcDNA3.1（＋）/NP,空质粒组转染pcDNA3.1（＋）;注射液、水煎液、凝集素实验组则将板蓝根注射液、水煎液、凝集素的试验浓度分别作用于转染重组质粒pcDNA3.1（＋）/NP的Hela细胞,三种制剂对应的对照组不进行转染,仅将对应制剂作用于Hela细胞。用胶体金免疫层析法和间接免疫荧光法检测各组NP表达。结果质粒组、注射液及水煎液实验组胶体金试验阳性,免疫荧光法证实作用转染的Hela细胞仍发出较强绿色荧光,且表达的NP定位于细胞质中;而凝集素组及空质粒组中表达NP的细胞未出现较强的绿色荧光且胶体金试验阴性。结论板蓝根凝集素可抑制NP基因表达,此为研发抗流感病毒的药物提供了新思路。     

转铁蛋白增强脂质体介导基因对肝癌细胞的转染和表达

目的：检测转铁蛋白能否增强脂质体介导外源基因对肝癌细胞的转染和表达。方法：应用本实验室构建的含小鼠白细胞介素（mIL)-12的真核表达质粒pcDNA3/mIL-12和绿色荧光蛋白（GFP）真核表达质粒pcDNA3/EGFP,观察转铁蛋白增强阳离子脂质体LipofectAMINE介导上述两种质粒DNA对小鼠和不同人肝癌细胞株的转染及表达效率。结果：LipofectAMINE加转铁蛋白介导pcDNA3/EGFP对小鼠肝癌细胞株Hep1-6的转染效率由2％－5％提高至20％,对4种不同人肝癌细胞株的转染效率由15％提高到65％－75％;但对小鼠肝癌细胞株MM45T.Li的转染效率并不增加。转铁蛋白可使LipofectAMINE介导pcDNA3/mIL-12在Hep1-6中的表达量增强18倍。结论：转铁蛋白能够与LipofectAMINE和质粒DNA形成复合物,显著增强脂质体介导外源基因对肝癌细胞的转染和表达,但对不同种肝癌细胞株的增强效率不同。     

XAF1基因重组腺病毒载体的构建及其在人肝癌细胞体内外的表达

目的利用携带35型腺病毒纤毛的嵌合型5型腺病毒载体系统Ad5/F35构建XAF1基因重组腺病毒,体内外感染人肝癌细胞SMMC7721并使XAF1基因有效表达。方法将真核表达质粒pcDNA3.1-XAF1和穿梭质粒pDC316用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、筛选、测序获得重组穿梭质粒pDC316-XAF1。将测序正确的pDC316-XAF1和骨架质粒pBHG-fiber5/F35用Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,进行细胞内同源重组,得到重组腺病毒Ad5/F35-XAF1。予终点稀释法测定重组腺病毒的感染滴度。用同样的方法得到携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报告病毒Ad5/F35-EGFP。建立人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠移植瘤模型,将Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-EGFP重组腺病毒分别感染人肝癌细胞株SMMC7721和瘤内注射;荧光显微镜观察EGFP在细胞和移植瘤冰冻切片中的表达;RT-PCR和Westrenblot法检测XAF1的mRNA和蛋白在细胞和移植瘤组织的表达。结果重组腺病毒Ad5/F35-EGFP感染肝癌细胞和瘤内注射后,予荧光显微镜均可见细胞和冰冻切片中呈现绿色荧光;Ad5/F35-XAF1感染肝癌细胞和瘤内注射后,XAF1mRNA和蛋白表达均显著高于对照组和报告病毒组。结论成功构建重组腺病毒Ad5/F35-XAF1和Ad5/F35-EGFP。该腺病毒载体可携带目的基因在人肝癌细胞株SMMC7721体内和体外进行有效表达。     

靶向表皮生长因子受体shRNA质粒表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法设计两个小分子干扰RNA（siRNA）序列，体外合成DNA模板引物，与Pgenesil-1质粒构建成编码shRNA的表达载体，进行酶切鉴定和测序，再转染人大肠癌LoVo细胞，进行荧光摄像和G418抗性筛选。结果构建的质粒表达载体完全符合设计要求，转染成功的细胞在荧光显微镜下显示为绿色，G418可以筛选出阳性克隆。结论成功构建了编码EGFR—shRNA的质粒表达载体，并可以进行稳定筛选。     

小鼠纤维介素蛋白2微小RNA表达质粒的构建及其对体内外相应基因的干预效应

目的:探讨小鼠纤维介素蛋白2(fgl2)的miRNA(微小RNA)表达质粒在体外对相应基因表达的干预效应及在体内对重型肝炎小鼠的治疗作用.方法:分别构建产生小鼠fgl2-miRNA的表达载体(P-mfgl2-miRNA),将其转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中.实验分组:将P-mfgl2-miRNA与小鼠fgl2的表达质粒(pcDNA3.1-mfgl2)共转染到CHO细胞作为干预组,无关序列miRNA表达质粒(irrelevant P-miRNA)与pcDNA3.1-mfgl2共转染为非相关对照组,仅转染pcDNA3.1-mfgl2为阳性对照组,未转染任何质粒为空白对照组.通过实时荧光定量PCR及Western blot观察fgl2在基因转录水平及蛋白水平表达量的改变.建立重型肝炎小鼠模型,通过尾静脉高压注射P-mfgl2-miRNA者为治疗组,注射irrelevant P-miRNA者为非相关组,注射相同剂量生理盐水者为阴性对照组,观察P-mfgl2-miRNA对重型肝炎小鼠的治疗作用.结果:成功构建了针对小鼠fgl2的miRNA.在CHO细胞中,干预组fgl2在RNA水平及蛋白水平的表达均较非相关对照组显著降低.P-mfgl2-miRNA可提高重型肝炎小鼠生存率至8.3％.结论:Fgl2可作为重型肝炎基因治疗的靶点,利用miRNA沉默fgl2基因将有利于重型肝炎的治疗,为后续的进一步研究奠定了基础.     

小发夹RNA体外抑制乙型肝炎病毒X蛋白表达的实验研究

目的构建靶向乙型肝炎病毒X基因（HBX）的shRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,观察其体外抑制HBX在HepG2细胞中表达的作用,为应用RNA干扰技术进一步研究HBX基因的功能奠定基础。方法设计并构建靶向HBx的shRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,脂质体转染法将HBX表达载体pcDNA3．1-HBx与pSilencer3．1-shHBX共转染人肝癌HepG2细胞,培养72h后以RT-PCR检测HBX基因表达情况,以Western blot检测HBX蛋白的表达量。结果经酶切和测序鉴定,构建的重组质粒pSilencer3．1-shHBX与设计一致。该质粒使HBX基因mRNA表达量降低47．1％,使HBx蛋白表达量降低58．9％,而阴性对照质粒无此作用。结论成功构建靶向HBXshRNA表达载体pSilencer3．1-shHBX,该质粒可体外抑制HBX在HepG2细胞中的表达。     

Construction of a Eukaryotic Plasmid Encoding Bacillus anthracis Protective Antigen,a Candidate for DNA Vaccine

Background: DNA immunization with plasmid DNA encoding bacterial, viral, parasitic and tumor antigens has been reported to trigger protective immunity. Objective: To evaluate the use of a DNA immunization strategy for protection against anthrax, a plasmid was constructed. Methods: The partialsequence of protective antigen of Bacillus anthracis, amino acids 175-764, as a potent immunogenic target was selected. The DNA encoding this segment was utilized in the construction of pcDNA3.1+PA plasmid. After intramuscular injection of rats with pcDNA3.1+PA plasmid, the expression of PA was assessed by RT-PCR and immunohistochemistry at RNA and protein levels, respectively. We also evaluated the presence of anti-PA antibodies in sera of immunized mice with pcDNA3.1+PA construct using immunoblotting. Results: The integrity of pcDNA3.1+PA construct was confirmed with restriction analysis and sequencing. The expression of PA was detected at RNA and protein levels. The presence of anti-PA antibodies in immunized mice with pcDNA3.1+PA construct was also confirmed. Conclusion: Our results indicate that pcDNA3.1+PA eukaryotic expressing vector could express PA antigen, induce antibody response and may be used as a candidate for DNA vaccine against anthrax.     

小鼠β防御素1与甲型流感病毒M2e融合基因表达及其免疫特性研究

目的构建mBD1与M2e融合基因的真核表达载体,并检测其在MDCK细胞中的表达情况,初步探讨其免疫特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD1与M2e基因片段,再通过重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)将mBD1与M2e通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD1-M2e。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+)获得重组质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-M2e,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光、RT-PCR产物序列分析检测融合蛋白表达情况,最后采用MTT法检测mBD1-M2e融合蛋白刺激淋巴细胞增殖能力。结果经鉴定后证实构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD1-M2e正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,该细胞培养上清液能刺激淋巴细胞增殖。结论本研究成功构建mBD1-M2e融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,这一结果为进一步研究新型高效通用的流感病毒核酸疫苗奠定了坚实的基础。     

小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因的克隆与表达检测

目的 检测真核表达克隆pcDNA3.1烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)的水平和有效性.方法 采用PCR的方法钓取小鼠源NMNAT1基因的cds全长片段,构建到T载体中,并转接到pcDNA3.1中;同时设计引物进行全基因测序;采用常规的脂质体转染方法转染入Hela细胞系中表达小鼠源NMNAT1基因,通过qPCR和Western blot的方法检测克隆pcDNA3.1-NMNAT1的表达水平和表达有效性,并同时建立小鼠源NMNAT1基因的qPCR和Western blot检测方法.结果 成功钓取了小鼠源NMNAT1基因,测序结果显示与数据库序列完全匹配,pcDNA3.1-NMNAT1通过脂质体转染入Hela细胞系,48 h以后收取细胞,经过反转录以后进行qPCR检测和Western blot检测,结果显示表达克隆pCDNA3.1-NMNAT1能同时在mRNA水平和蛋白水平高表达小鼠NMNAT1基因.结论 成功从小鼠脑cDNA文库中克隆了NMNAT1基因的全长cDNA,与Pubmed序列完全一致,并构建到真核表达载体上正确表达NMNAT1蛋白质.     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA2真核表达质粒的构建与体外表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA2的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA2引物，运用PCR方法扩增其基因片段，经克隆至pMDl8-T载体后，亚克隆至真核表达质粒pcDNA3．1（-）而构建重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2。脂质体法将构建的重组质粒转染HFF细胞，RT—PCR法检测转染细胞中GRA2的表达情况。结果PCR扩增GRA2基因序列正确，构建的重组表达质粒pcDNA3．1-GRA2经PCR、EcoRⅠ／HindⅢ双酶切和测序鉴定正确；转染GRA2基因的细胞，RT—PCR可见目的条带。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3．1-GRA2，为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。     

pcDNA3.1(+)/t-PA真核表达质粒的构建及其在血管内皮细胞中的表达

目的　利用基因工程技术克隆人组织纤溶酶原激活物 (t- PA)基因并构建一种能在血管内皮细胞 (VEC)中高效、安全表达 t- PA的 pc DNA3.1(+) / t- PA真核表达重组质粒。方法　采用高效 Trizol试剂快速从胎儿肺组织中提取总 RNA,RT- PCR获得 t- PA c DNA,并将真核表达质粒 pc DNA3.1(+)和 t- PA基因片段分别双酶切 ,将回收的 pc DNA3.1(+)大片段 (5 .0 kb)与 t- PA基因片段 (1.9kb)重组。对 pc DNA 3.1(+) / t- PA质粒进行酶切鉴定和测序。脂质体介导 pc DNA3.1(+) / t- PA转染血管内皮细胞 ,并用 RT- PCR法和 EL ISA法分别从 m RNA水平和蛋白质水平检测 t- PA的表达情况。结果　成功地从胎儿肺组织中克隆了 t- PA基因 ,并构建了以 pc DNA 3.1(+)为载体的真核表达质粒载体。pc DNA3.1(+) / t- PA转染血管内皮细胞后 ,t- PA表达增加 ,(n=6 ,P<0 .0 1)。结论　含t- PA基因真核表达质粒构建成功     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆、真核表达及鉴定

目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶（Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH）编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。     

甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区真核表达质粒的构建和表达分析

目的 构建流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）真核表达质粒，并研究其在真核细胞中的表达。方法 根据Genbank（NCBI ISDN13425）中查得的M2e编码序列，设计并合成两条DNA单链;在两条链两端添加碱基构成酶切位点的粘性末端，退火后使之互补结合成为M2e编码序列；然后将其插入到经双酶切的真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，构建重组真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2ef经酶切和DNA测序鉴定后，转染HEK293细胞。用免疫荧光技术检测pcD—NA3．1（＋）-M2e在HEK293细胞的表达。并通过MTT检测刺激淋巴细胞增殖及M2e蛋白的分泌情况。结果 合成的寡核苷酸链经退火形成双链，插入酶切的真核表达载体后构建成pcDNA3．1（＋）-M2e。免疫荧光技术证实该质粒表达的M2e蛋白定位于细胞膜上，转染细胞的培养上清经MTT实验证实能刺激淋巴细胞增殖，表明表达的M2e蛋白也可分泌至细胞外。结论成功构建了流感病毒M2e的真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-M2e，表达的M2e蛋白不仅存在于绳胞膜上，也可分泌到细胞外。流感病毒M2e基因真核表达质粒的构建及成功表达为流感病毒基因工程疫苗、通用疫苗和核酸疫苗的研究奠定了基础。