内含HCV RNA病毒样颗粒的HCV荧光定量参考品的建立

目的 使用内含HCV RNA病毒样颗粒建立HCV实时荧光定量参考品,以便对实验操作进行严格的质量控制.方法 使用国家一级校准品对内含HCV RNA病毒样颗粒进行含量标定,并稀释制作定量参考品.结果 内含HCV RNA病毒样颗粒的RNA溶液作为HCV RNA荧光定量检测试剂盒的定量参考品,在检测方法上该参考品既可作为定量参考品,又可当作室内质控品,从样品处理开始就可以监控整个实验操作过程,对实验的可靠性提供了有效的保证.结论 内含HCV RNA病毒样颗粒定量参考品的使用使临床上开展核酸扩增技术(NAT)来检测HCV病毒RNA含量定量准确,结果可靠.     

鼠艾滋病病毒荧光定量PCR标准品RNA的构建

目的合成构建鼠艾滋病病毒(FLV)荧光定量检测标准品,明确核糖核酸(RNA)标准品体外合成的基本原则。方法通过序列对比,找到FLV最为保守的区段作为RNA标准品的合成目标,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,克隆于T载体,测序,设计带有T7启动子的引物,PCR扩增,将所得的PCR产物凝胶回收纯化,用T7RNA聚合酶进行体外合成RNA,最后用PCR和电泳检测验证。结果成功合成了FLV荧光定量PCR标准品。结论FLV荧光定量标准品的成功合成必须遵守以下4条基本原则:①选择保守序列;②设计引物时将潜在的终止密码或起始密码排除在PCR目标产物之外;③将启动子(如T7启动子)挂在适当的引物上,保证所合成的RNA模板与所要定量检测的RNA模板一致,而不是互补;④合成RNA后必须检测,以保证不含其他RNA或者未消化完的DNA。     

含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒的构建和表达

目的：通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,构建并表达含轮状病毒NSP3基因耐RNA酶的病毒样颗粒,并探讨其稳定性。方法：设计含PvuⅠ和KpnⅠ酶切位点的上、下游引物,扩增1 049 bp轮状病毒NSP3基因片段,并将包装位点-5位的U替换为C,提高与MS2衣壳蛋白作用的亲和力。用PvuⅠ和KpnⅠ双酶切扩增的目的基因和pACYC-MS2表达载体,连接获得重组载体pACYC-MS2-NSP3,转化TOP10感受态细胞后用PCR验证阳性克隆并测序。阳性克隆转化BL21(DE3)细胞后表达含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,用超声破碎、纯化获得表达产物,鉴定并讨论其稳定性。结果：成功构建pACYC-MS2-NSP3表达载体并获得了含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,其可耐受DNA酶和RNA酶的降解,并在-20 ℃、4 ℃、室温25 ℃下10 d保持稳定。 结论：通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,可以成功构建耐RNA酶的病毒样颗粒,本研究所构建的病毒样颗粒具有耐RNA酶的特性和良好的稳定性,为轮状病毒实时荧光定量逆转录 PCR的标准品和质控品的研究提供了一个可行的方法。     

含肠道病毒5'端非编码区部分核糖核酸序列病毒样颗粒的构建

目的 构建含有肠道病毒(EV)5'端非编码区(5'-UTR)部分RNA序列的耐核糖核酸酶(RNase)病毒样颗粒.方法 利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2.将肠道病毒5'-UTR基因片段连接到中间载体的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV.将其转化宿主菌,IPTG诱导表达,并进行RT-PCR检测和稳定性实验.结果 表达载体pET32a-MS2-EV经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功.RT-PCR和稳定性实验结果 表明,诱导产生的病毒样颗粒内含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列,并且稳定性良好.结论 成功构建了含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列的病毒样颗粒,可作为肠道病毒检测时的标准品和质控品使用.     

通用引物检测登革热病毒NS1基因及其酶切分型

目的：利用通用引物经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测登革病毒RNA，并经限制性内切酶酶切鉴定病毒型别。方法：用C6／36细胞培养登革病毒，碘化钠法提取病毒RNA，利用通用引物进行RT-PCR，对PCR产物用Mav I限制性内切酶酶切鉴定。结果：应用通用引物RT-PCR方法可检测到含量为0．212ng／L的病毒RNA，扩增的产物及酶切片段与预期的靶序列长度和限制酶谱分析相一致。结论：用登革病毒NS1区通用引物通过RT-PCR并经酶切分型，是诊断登革病毒感染的一种简易快速的方法。     

柯萨奇B组病毒逆转录聚合酶链反应检测方法的建立

根据柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）基因组５’非编码区核苷酸序列，选用了一对组特异性引物，用于逆转录聚合酶链反应检测ＣＢＶ－ＲＮＡ。结果显示该法可检出ＣＢＶ１～６型ＲＮＡ，灵敏度为１０ＰＦＵ，不能检出其他病毒ＲＮＡ。采用的碘化钠－异硫氰酸胍－氯仿法提取ＣＢＶ－ＲＮＡ与传统的蛋白酶Ｋ－酚－氯仿法及异硫氰酸胍－酚－氯仿法比较，具有快速、简便、稳定、可靠的特点。应用该法检测ＣＢＶ－５感染鼠外周血ＲＮＡ，第３ｄ即为阳性，提示本法可用于ＣＢＶ感染的早期诊断     

实时荧光RT-PCR对SARS患者血清中病毒含量的定量检测

目的:阐述SARS患者病程与血清中SARS病毒含量间的关系.方法:采用高灵敏度荧光实时定量RT-PCR方法,对156份SARS患者进行检测,同时,以9.4×109copies/L(Robert Koch Institute)灭活的SARS冠状病毒为定量标准品,病毒样颗粒为阳性对照,分析SARS-CoV阳性血清样本中的病毒含量.结果:检测试剂的灵敏度达1×105copise/L,与相关病原体没有交叉.81份血清样本中病毒含量分布在1×105～1×107copies/L之间,患者血清样本中病毒含量较低,经统计学分析,病毒含量与病程长短无明显数量关系.结论:SARS患者血清中病毒含量低,与病程没有明显的相关性.     

丁型肝炎病毒RNA巢式逆转录PCR检测

为了提高丁型肝炎病毒的实验室诊断水平，建立一个高敏感性和特异性的丁型肝炎病毒的检测方法。根据ＧＥＮＢＳＡＮＫ中ＨＤＶ的核酸序列设计出巢式引物，采用逆转录巢式ＰＣＲ方法对４０例肝炎患者进行检测。结果：２０例丁型肝炎病毒抗原阳性的ＨＦＶ ＲＮＡ均为阳性，１０例丁型肝炎病毒抗体阳性中ＨＤＶ ＲＮＡ阳性６例，１０例单纯ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇ和ＨＢｄ阳性均未检出ＨＤＶＲＮＡ。     

SARS病原体的检测及其在动物模型鉴定及疫苗评价中的应用

目的:通过RT-PCR及病毒分离等方法，鉴定SARS感染性动物模型是否成立，并对疫苗效果进行评估。方法:选用3周岁的健康SPF级恒河猴8只，分为SARS实验感染动物模型组及疫苗组(Sino 3 SARS灭活疫苗20030904批肌内注射，免疫2次)。经鼻吸入Sino 1 SARS毒株，病毒攻击后7d动物进行安乐死。自病毒攻击后的第一天起每日连续采集动物咽拭子标本，病毒攻击后的第二天、第五天、第七天采集血浆标本。将标本进行病毒分离及RT-PCR检测．结果：模型组动物病毒攻击后第一天至第七天咽拭子RT-PCR检测均为阳性。注射疫苗组动物仅在病毒攻击后第一天咽拭子RT-PCR检测呈阳性。模型组动物血浆RB-PCR检测呈现阳性，疫苗组动物血浆RT-PCR检测均为阴性。病毒分离结果显示仅在模型动物咽拭子标本中分离到病毒，未在疫苗组动物的咽拭子标本分离到病毒．血浆标本中均未分离到病毒．结论：RT-PCR及病毒分离可以及时有效地检测出病毒在体内的复制情况，可作为模型鉴定、疫苗评估及药物筛选的重要手段。     

从抗击SARS看医院的建设与管理

持续数月的抗击SARS战斗艰苦卓绝,SARS一方面在威胁着人类,另一方面又警示着整个社会。回顾和体味这期间的抗击SARS搏击战,对医院的建设与管理来说,一是要尽快规范传染病医院建设,使之符合疫病防治要求;二是要深化改革,建立统一、高效的医院管理体制;三是必须健全合理完善的医院补偿机制,促进医院良性发展。     

漫谈"非典"与瘟疫

在人类的历史上,瘟疫同其它自然灾害一样,戕贼着人民的生命.     

SARS疫苗研究进展

严重急性呼吸综合征(sARS)是由SARS相关冠状病毒(sARS-GoV)引起的一种新的传染病.虽然SARS的流行已经被有效控制,但很可能因实验室样本外泄或动物宿主中南类SARS-CoV演化而来的病毒的分离株导致再次爆发,阻止SARS再次流行最有效的方法就是研制安全有效的疫苗,所以,SARS疫苗的研究仍然是目前SARS相关研究的重点.不同类型SARS疫苗的研究已经迅速展开,并且有些疫苗研究已取得了突破性的进展,进入了临床试验阶段.但在SARS疫苗的研究过程中也遇到了很多问题,如抗体依赖性感染增强(ADE)、SARS-CoV病毒变异快、没有理想的动物模型等.本文对SARS疫苗的研究、疫苗研究中存在的问题等进行了综述.     

浅论SARS的病因及防治

分析了SARS(严重急性呼吸道综合征)的病因及防治措施，认为SARS病应属风温范围，风温时毒与人体卫外机能减弱、病邪的暴戾特性，同时应社会环境因素失衡等共同促成其发病与流行。从中西医结合防治思路出发，提出应尽早联用中医药截断疗法，同时应重视中药预防及食疗中药在防治中的作用。     

SARS病毒N蛋白真核表达质粒构建及诱导的体液免疫

目的构建SARS病毒核衣壳蛋白（N）的真核表达质粒，并研究其在小鼠体内诱导的体液免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS病毒N蛋白基因片段，定向克隆入真核表达栽体pVAC，构建pVAC-N重组质粒；大量制备该重组质粒，经基因枪腹部皮内注射免疫BALB／c小鼠三次，间接ELISA法测定免疫鼠IgG抗体效价。结果成功构建了重组表达质粒pVAC-N，免疫小鼠后可诱导产生出特异性的IgG抗体。结论构建的真核表达质粒pVAC-N能诱导小鼠产生特异性抗体，为SARS疫苗的进一步研究打下基础。     

现在自然界和人群中已不存在非典病毒

非典(SARS)流行至今已近10年,虽被进行了全面广泛深入的研究,但其起源和贮存宿主仍不明确。我们发现SARS的流行自然史和迄今世界上的传染病均不相符,其原因是非典病毒(SARS CoV)经"非寻常进化"方式,很可能是"非自然"方式进入人群。对几乎所有的SARS CoV基因变异、进化、跨种传播等既往研究,我们进行重新审视并综合分析,发现以往研究多从微观和一个侧面思考问题,而本文则从全新之视角,结合流行病学和生物进化理论,首次阐明:SARS CoV经历了逆向进化;自然界根本不存在SARS CoV的直接祖先和贮存宿主,故其流行后即从人群和动物界消失。因此建议卫生部正式向WHO等有关国际机构申请组织专家委员会,实证自然界和人群中已无SARS CoV,并予宣布。     

199例SARS患者临床特征与治疗

目的探讨SARS的临床特点及临床有效治疗方法。方法采用前瞻性方法对入院199例SARS病例临床资料进行总结。结果 199例SARS患者中,多数患者有发热(85.93％)、咳嗽(77.88％)、胸闷或呼吸困难(62.3％)、头痛(15.6％)、周身酸痛(28.6％)、腹泻(12.6％)。17.1％WBC计数降低,24.1％WBC计数降低增高,40.7％淋巴细胞计数减少,84.4％肝功指标异常,24.6％血糖异常,25.7％血脂异常,11.6％肾功BUN异常。结论 SARS临床表现和病理改变多样化,CD4T细胞测定有助于早期诊断,临床以综合治疗为主,早期氧疗及小剂量激素治疗有较好的治疗效果。