含肠道病毒5'端非编码区部分核糖核酸序列病毒样颗粒的构建

目的 构建含有肠道病毒(EV)5'端非编码区(5'-UTR)部分RNA序列的耐核糖核酸酶(RNase)病毒样颗粒.方法 利用PCR技术扩增大肠杆菌MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,将其克隆到pET32a中构建中间载体pET32a-MS2.将肠道病毒5'-UTR基因片段连接到中间载体的下游,构建原核表达载体pET32a-MS2-EV.将其转化宿主菌,IPTG诱导表达,并进行RT-PCR检测和稳定性实验.结果 表达载体pET32a-MS2-EV经PCR、双酶切鉴定和测序分析后证实构建成功.RT-PCR和稳定性实验结果 表明,诱导产生的病毒样颗粒内含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列,并且稳定性良好.结论 成功构建了含肠道病毒5'-UTR部分RNA序列的病毒样颗粒,可作为肠道病毒检测时的标准品和质控品使用.     

含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒的构建和表达

目的：通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,构建并表达含轮状病毒NSP3基因耐RNA酶的病毒样颗粒,并探讨其稳定性。方法：设计含PvuⅠ和KpnⅠ酶切位点的上、下游引物,扩增1 049 bp轮状病毒NSP3基因片段,并将包装位点-5位的U替换为C,提高与MS2衣壳蛋白作用的亲和力。用PvuⅠ和KpnⅠ双酶切扩增的目的基因和pACYC-MS2表达载体,连接获得重组载体pACYC-MS2-NSP3,转化TOP10感受态细胞后用PCR验证阳性克隆并测序。阳性克隆转化BL21(DE3)细胞后表达含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,用超声破碎、纯化获得表达产物,鉴定并讨论其稳定性。结果：成功构建pACYC-MS2-NSP3表达载体并获得了含轮状病毒NSP3基因病毒样颗粒,其可耐受DNA酶和RNA酶的降解,并在-20 ℃、4 ℃、室温25 ℃下10 d保持稳定。 结论：通过改变MS2噬菌体衣壳蛋白RNA包装位点的亲和力,可以成功构建耐RNA酶的病毒样颗粒,本研究所构建的病毒样颗粒具有耐RNA酶的特性和良好的稳定性,为轮状病毒实时荧光定量逆转录 PCR的标准品和质控品的研究提供了一个可行的方法。     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立

目的分析SARS冠状病毒广东株多聚酶基因片段的异质性,建立RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法,为SARS的快速诊断提供依据。方法合成针对SARS冠状病毒多聚酶基因区段的特异性引物,从广东省SARS病人及疑似病人标本中提取RNA,经反转录和巢氏PCR扩增出相应大小的DNA片段。对这些片段克隆后进行DNA序列分析,并将序列与SARS冠状病毒和其他已知冠状病毒进行同源性分析。结果从多例SARS病人痰、咽拭子或血液标本中得到RT-PCR阳性片段,随机选取其中8例经克隆和DNA序列分析证实均为SARS冠状病毒序列(同源性100%),而所有阴性参照标本RT-PCR均为阴性。克隆片段BNI109与已知冠状病毒在核苷酸和氨基酸水平进行分析显示,该片段与牛冠病毒(bovinecoronavirus,BCV)和鼠肝炎病毒(murinehepatitisvirus,MHV)同源性最高,在氨基酸水平上同源性高达75%。结论SARS冠状病毒多聚酶基因片段BNI109的保守性极强,适合建立RT-PCR法检测SARS冠状病毒。     

SARS冠状病毒多聚酶基因临床检测方法的建立

目的 分析SARS冠状病毒广东株多聚酶基因片段的异质性。建立RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法，为SARS的快速诊断提供依据。方法 合成针对SARS冠状病毒多聚酶基因区段的特异性引物，从广东省SARS病人及疑似病人标本中提取RNA，经反转录和巢氏PCR扩增出相应大小的DNA片段。对这些片段克隆后进行DNA序列分析，并将序列与SARS冠状病毒和其他已知冠状病毒进行同源性分析。结果 从多例SARS病人痰、咽拭子或血液标本中得到RT-PCR阳性片段，随机选取其中8例经克隆和DNA序列分析证实均为SARS冠状病毒序列(同源性100％)，而所有阴性参照标本RT-PCR均为阴性。克隆片段BNll09与已知冠状病毒在核苷酸和氨基酸水平进行分析显示，该片段与牛冠病毒(bovinecoronavirus，BCV)和鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus，MHV)同源性最高，在氨基酸水平上同源性高达75％。结论 SARS冠状病毒多聚酶基因片段BNll09的保守性极强，适合建立RT-PCR法检测SARS冠状病毒。     

SOX9慢病毒表达载体的构建及其在LNcap细胞中的稳定表达

目的 构建SOX9基因慢病毒表达载体, 建立稳定表达SOX9的LNCa P细胞株.方法 PCR扩增SOX9基因, 将其克隆到慢病毒表达载体p LVX-IRES-Puro中, 双酶切和测序鉴定重组质粒.用HEK293细胞包装重组病毒颗粒并感染LNcap细胞, 经puromycin筛选获得稳定转染细胞株.q RT-PCR和Western Blot分别检测SOX9 m RNA水平及蛋白表达.结果 经双酶切和测序鉴定证实目的片段已插入到慢病毒表达载体上.重组质粒转入LNCa P细胞后经puromycin抗性筛获得稳定表达的细胞株, q RT-PCR检测到SOX9基因在转录水平的表达, Western blot分析显示SOX9蛋白高表达.结论 慢病毒表达载体p LVX-IRES-FLAG-SOX9构建成功, 实现了SOX9在LNcap细胞中的外源性表达.     

SARS冠状病毒PUMC_2株N蛋白cDNA的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化SARS冠状病毒N蛋白。方法用RT-PCR技术克隆SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白全长cDNA,cDNA经序列分析鉴定后,克隆到pET32a表达载体,转化E.coliBL21进行原核表达并纯化出SARS冠状病毒N蛋白。结果实现了SARS冠状病毒N蛋白的表达及纯化。结论用基因重组方法表达的SARS冠状病毒N蛋白可为其进一步功能研究提供条件。     

血管紧张素转化酶相关性羧肽酶在人及啮齿动物胰腺的表达

目的近几年发现的血管紧张素转化酶相关性羧肽酶(ACE2),是血管紧张素转化酶(ACE)的相关酶,新近被证实是SARS相关冠状病毒的一个功能性受体。我们的先前实验发现SARS患者的血糖水平比对照组显著升高,提示SARS冠状病毒可能侵袭胰腺并导致胰腺损伤。本文研究ACE2在人、大鼠和小鼠内外分泌腺的表达,为探讨糖尿病及SARS病毒感染后血糖升高的机制提供依据。方法通过免疫组化的方法检测ACE2在人、大鼠和小鼠胰腺的表达。分别提取人和大鼠胰腺组织的RNA,通过RT-PCR的方法检测ACE2在人、大鼠的表达。结果免疫组化:ACE2在人、大鼠、小鼠的胰腺内外分泌腺均有表达,ACE2在内分泌腺的表达均强于外分泌腺。RT-PCR:在人和大鼠的胰腺RNA经逆转录后均扩增出ACE2基因片段,提示ACE2在人和大鼠胰腺中均有表达。结论ACE2在胰腺内分泌腺表达,提示SARS病毒能通过胰岛细胞膜上的ACE2受体侵入胰岛细胞,引起胰岛细胞损伤。     

针对HBVx基因的siRNA重组腺病毒的制备及其对HBVx基因表达的抑制作用

目的:构建针对乙型肝炎病毒x基因(HBx基因)的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体,并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-HBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western Blot方法证实,在HepG2细胞中,HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低.结论:腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达.     

SARS冠状病毒RNA聚合酶编码区分析

SARS冠状病毒(SARS coronavirus ,SARS CoV)和同家族的其他冠状病毒一样,是一类单链的正义RNA病毒 ( single-stranded, (+)sense RNA virus).与其他种类的病毒(如负义RNA 病毒)相比,这类病毒有两个最重要的特征:(1)在其成熟的病毒颗粒中并没有RNA聚合酶(viral RNA polymerase)存在,即病毒复制、转录所需的病毒特有的RNA聚合酶,是在侵入宿主细胞之后才合成的. 而且,只是在病毒的扩增阶段,保留在宿主细胞内行使功能,并不参与病毒颗粒的组装.