Notch1基因沉默对滋养细胞增殖与凋亡的影响

目的:探讨Notch1基因沉默后对滋养细胞增殖与凋亡生物学功能的影响。方法:构建Notch1蛋白基因干扰质粒,体外培养人早孕期胎盘绒毛膜外滋养细胞系HTR-8/SVneo细胞进行转染。应用实时荧光PCR计数检测转染后Notch1 mRNA相对表达水平,CCK-8检测细胞转染后活性情况,Western blotting检测Bcl-2凋亡蛋白家族表达情况。结果:同未转染组相比,空白质粒转染组与基因沉默组mRNA相对表达水平分别为0.97±0.03、0.31±0.10,基因沉默组mRNA表达与其它两组差异有统计学意义(P<0.05)。Notch1基因沉默组同空白质粒转染组相比细胞活性明显下降(P<0.05),同时Notch1基因沉默组抗凋亡蛋白Bcl-2表达较空白质粒转染组明显降低(P<0.05),而促凋亡蛋白Bax表达明显增加(P<0.05)。结论:Notch1基因可通过调节Bcl-2凋亡蛋白家族参与滋养细胞增殖与凋亡过程,是胎盘形成发展过程中的正向调节因子。     

肝癌细胞中抑制Galectin-3基因表达对细胞增殖及侵袭能力的影响及机制研究

目的 探讨Galectin-3基因在肝癌细胞中的表达及抑制其表达对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响及机制。 方法 RT-PCR检测人肝癌细胞MHCC-97H、HepG2、SMCC-7721及人正常肝细胞HL-7702中Galectin-3基因的mRNA表达;Control、NC-siRNA、Galectin-3-siRNA转染HepG2细胞,48 h后Western blot检测各组细胞中Galectin-3、MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1的蛋白表达;CCK8实验和流式细胞仪分别检测细胞的增殖和侵袭能力。 结果 MHCC-97H、HepG2、SMCC-7721细胞中Galectin-3的mRNA表达均显著高于正常肝细胞HL-7702中的Galectin-3的mRNA表达,差异有统计学意义(P<0.01),Galectin-3在HepG2细胞中的表达最高,选择作为后续的研究对象;转染siRNA后能显著抑制Galectin-3基因的表达;Galectin-3-siRNA组细胞存活率、细胞侵袭数及MMP-2、MMP-9、Notch1、Hes1蛋白表达均低于对照组和NC-siRNA组,差异有统计学意义(P<0.01)。 结论 抑制肝癌细胞中Galectin-3基因表达能显著降低癌细胞的增殖及侵袭能力,其机制与Notch1信号通路的调控有关。     

整合素α5表达上调促进卵巢癌SKOV3细胞侵袭转移及机制探讨

目的:检测整合素α5(integrinα5,ITGA5)表达上调对卵巢癌SKOV3细胞侵袭转移影响及机制探讨。方法:用pEGFP-ITGA5过表达质粒对卵巢癌SKOV3细胞进行转染,未转染的SKOV3细胞作为对照。RT-PCR方法检测SKOV3细胞中整合素α5的mRNA水平变化,Western Blot方法检测整合素α5蛋白水平的表达。为观察整合素α5表达上调对SKOV3细胞侵袭转移能力的影响,采用Transwell小室检测细胞侵袭及迁移能力。小鼠体内粘附实验观察整合素α5过表达的SKOV3-GFP细胞体内粘附能力变化。Western Blot方法检测EMT相关蛋白EMT相关基因表达情况。结果:与对照组相比,pEGFP-ITGA5转染SKOV3细胞后整合素α5基因表达水平明显增高。细胞侵袭、迁移实验表明,pEGFP-ITGA5转染组较对照组细胞侵袭、迁移力明显增加,对照组和实验组穿膜细胞数分别为(56.32±4.63)个和(135.58±7.94)个,对照组与实验组相比差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠体内粘附实验证明,整合素α5过表达的SKOV3-GFP细胞体内粘附能力明显增强。Western Blot结果表明整合素α5过表达的SKOV3中,E-cadherin表达明显下调,同时Vimentin、MMP-9表达明显上调。结论:整合素α5表达上调能促进卵巢癌SKOV3细胞的粘附和侵袭转移,其可能是通过促进上皮间质转化发生进而引起细胞侵袭转移能力的增强。     

IEX-1基因转染对人卵巢癌细胞增殖活性及顺铂敏感性的影响

目的:探讨即刻早期反应基因-1(immediate early response gene X-1,IEX-1)转染人卵巢癌细胞SKOV3后,对顺铂药物敏感性的影响。方法:提取并鉴定重组质粒pEGFP-N1-IEX-1,采用脂质体介导将重组质粒转染到人卵巢癌细胞SKOV3,RT-PCR检测转染前后IEX-1mRNA和蛋白的表达情况,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染后卵巢癌细胞SKOV3增殖情况以及对顺铂敏感性的变化。结果:成功转染IEX-1基因后可检测到IEX-1mRNA的高表达;转染组细胞的增殖速度增快(P<0.05),但对顺铂的敏感性明显增强(P<0.05)。结论:IEX-1可增强卵巢癌细胞的体外增殖能力,并增强卵巢癌细胞体外对顺铂化疗的敏感性,为肿瘤的有效干预和治疗提供新的靶点。     

过表达GCNF对HeLa细胞生物学行为的影响

目的:将成功构建的人pcDNA3.1-GCNF真核表达载体瞬时转染宫颈癌HeLa细胞,观察GCNF基因对HeLa细胞生物学功能的影响。方法:将重组质粒pcDNA3.1-GCNF转染HeLa细胞,通过MTT比色法、基质胶黏附实验和Transwell侵袭试验对转染后HeLa细胞增殖、黏附和侵袭力进行分析。结果:成功获得瞬时转染的pcDNA3.1-GCNF HeLa细胞,转染目的基因组(0.239±0.014)与转染空质粒组(0.198±0.020)及未转染组(0.204±0.012)相比,细胞增殖最快(P<0.05)。转染目的基因后细胞粘附、侵袭力未见明显改变。结论:GCNF基因促进了体外培养的宫颈癌HeLa细胞增殖,但对HeLa细胞粘附、侵袭力没有明显的影响。     

ELABELA通过调控AKT信号通路影响滋养细胞侵袭的研究

目的 探讨ELABELA(ELA)对妊娠滋养细胞(Bewo细胞)侵袭行为的影响及其可能的作用机制。方法 用siRNA-ELA转染处于对数生长期的Bewo细胞,分为siRNA-ELA转染组,阴性对照组(细胞转染无意义序列)及空白组,细胞转染后于倒置显微镜下观察转染效率,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测转染后各组细胞中ELA mRNA表达并明确沉默效率。划痕实验测定各组细胞迁移能力,Transwell实验测定各组细胞的迁移、侵袭能力。蛋白质免疫印迹法检测各组细胞p-AKT、MMP9蛋白表达水平。结果 si-ELA组的ELA表达量明显低于si-NC组及空白组(P<0.001),且si-NC组与空白组差异无统计学意义(P>0.05);siRNA-ELA组细胞的迁移及侵袭能力均明显低于空白组(P<0.01;P<0.01);siRNA-ELA组p-AKT蛋白及MMP9蛋白表达水平明显低于空白组(p-AKT P<0.01;MMP9 P<0.001)。结论 敲低ELA可抑制滋养细胞的侵袭及迁移能力,其机制可能与AKT信号通路有关。     

稳定表达GRIM-19的Hela细胞株的建立及其对STAT3的抑制作用

目的:建立Grim-19基因稳定表达的人子宫颈癌Hela细胞株,探讨Grim-19及其对下游基因STAT3表达的影响。方法:将构建好的质粒采用脂质体法转染人子宫颈癌Hela细胞株,经G418筛选,得到稳定表达Grim-19的Hela细胞株,并分别通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹法(Western-blot)检测Grim-19及其下游基因STAT3的表达。结果:成功建立了高表达GRIM-19的Hela/Grim-19细胞株,并在mRNA与蛋白水平上均发现Grim-19在转染细胞中的高表达和其下游基因STAT3表达的明显下调。结论:上调子宫颈癌Hela细胞Grim-19的表达对STAT3的表达有抑制作用。     

腺病毒介导PTEN基因抑制肝癌体外生长和侵袭力的研究

目的探讨腺病毒介导PTEN基因对肝癌细胞株H22体外生长和侵袭力的影响。方法以Ad-PTEN、Ad-PTEN^G-129R质粒及空载质粒分别转染体外培养肝癌细胞株H22，并以来转染组为对照，用RT-PCR检测目的基因，用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测细胞活力，通过Boyden小室法检测肝癌细胞株H22体外侵袭力的变化。结果RT-PCR显示Ad-PTEN-H22组、Ad-PTEN^G-129R-H22组的H22细胞相应基因mRNA表达呈阳性条带，表明有PTEN和PTEN^G-129R的表达；在细胞活力检测上，Ad-PTEN-H22组550nm波长光吸收值为0.5627±0.0633，表明该组活细胞数明显低于其他各组（P〈0．05）；Ad-PTEN-H22组的侵袭细胞数为（15.64±3．27）％，低于其他组（P〈0.05）。结论重组腺病毒载体介导的PTEN基因转染可抑制肝癌细胞株H22体外生长并且其体外侵袭力受到明显抑制。     

全长型人Smac基因真核表达载体构建及表达

目的 构建全长型(full length,FL)人Smac基因(hSmac)真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中表达.方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人宫颈癌细胞株Hela中扩增到Smac CDs基因片段,构建重组真核表达载体peDNA3.1 -FL hSmae.PCR、酶切鉴定重组质粒正确后,通过脂质体介导将其和作为阴性对照的空载体pcDNA3.1 分别转染人肝癌细胞株(SMMC-7721).同时转染含EGFP的质粒pcDNA3.1 -EGFP.利用荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率.采用RT-PCR、western blot法检测外源基因Smac的表达.结果 PCR扩增片段与预期片段大小相符,插入片段测序结果与GenBank公布的一致,表明人Smac基因克隆成功.且鉴定证实真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac构建成功.流式细胞术检测到转染效率高达48%,荧光显微镜下也可见非常明亮的绿色荧光.无论是在mRNA水平还是蛋白水平上,转染后的细胞中外源基因Smac表达均明显增加.结论 成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1 -FL hSmac,并在肝癌细胞中明显表达,为研究Smac基因在细胞凋亡过程中的调控作用.以及探讨以Smac基因为基础的肿瘤基因治疗策略提代基础依据.     

转移抑制基因nm23-H1及在母胎界面的表达

母胎界面的滋养细胞具有类似恶性肿瘤细胞的侵袭能力,但滋养细胞的侵袭受到严格控制.转移抑制基因nm23-H1广泛表达于多种肿瘤细胞,可有效抑制肿瘤细胞的侵袭与转移.nm23-H1亦在母胎界面表达,并可能对滋养细胞的增殖、侵袭、分化以及凋亡等生物学功能发挥重要的调节作用.进一步研究nm23-H1在母胎界面的生物学作用将有助于更加全面认识胚泡植人及滋养细胞侵袭调控,并且具有潜在的临床应用价值.     

印迹基因H19在早孕绒毛组织中印迹状态的研究

目的检测早孕绒毛组织中印迹基因H19印迹的状态,探讨其印迹状态与滋养细胞浸润能力之间的联系。方法PCR-RFLP方法检测93例正常早孕绒毛组织中H19的印迹状态。结果在93例正常早孕绒毛组织中,有42例为杂合子,杂合子基因型中有11例为双等位基因的表达,其中所有双等位基因表达均在孕5～9周,而孕10～12周未发现有双等位基因的表达。结论在早孕期间,H19基因在绒毛组织中存在双等位基因的表达,主要集中在孕10周前,提示H19基因在滋养细胞中可能存在有动态变化,并与滋养细胞的浸润能力的变化有一定的联系。     

siRNA表达载体对大鼠心肌H9c2细胞牛磺酸合成限速酶-CSD基因表达的抑制作用

目的研究siRNA对大鼠心肌半胱亚磺酸脱羧酶(CSD)的抑制作用。方法根据已克隆的大鼠心肌CSD基因序列(EU786150)设计并构建了4个siRNAs及1个阴性对照siRNA表达质粒,利用脂质体LipofectamineTM2000将构建好的重组质粒siRNA1#、siRNA2#、siRNA3#、siRNA4#及阴性对照质粒分别转染H9c2细胞,应用荧光显微镜观察转染效率、四唑盐(MTT)法检测H9c2细胞增殖情况、实时荧光定量PCR和Western-blot检测CSD mRNA和蛋白表达。结果荧光显微镜观察细胞转染效率达70%左右;与阴性对照组、未转染组比较,siRNA1#重组质粒显著抑制了H9c2细胞中CSD mRNA和蛋白的表达(P<0.05),而siRNA4#质粒对CSD表达无明显抑制效应(P>0.05);MTT检测结果表明转染重组质粒siRNA1#、siRNA2#进入H9c2细胞48 h、72 h后细胞增殖明显受抑制,与阴性对照组、未转染组相比差异均达到显著水平(P<0.05)。结论 siRNA1#重组质粒能有效抑制CSD基因的表达,且显著抑制H9c2细胞增殖,为研究CSD基因及揭示牛磺酸在心肌细胞代谢中的作用奠定基础。[营养学报,2012,34(4):317-321]     

Smac对子宫内膜癌细胞增殖及侵袭能力的影响

目的 研究Smac高表达对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法 选择Ⅱ型子宫内膜癌HEC-1-A细胞(低分化腺癌细胞、雌激素受体阴性),应用脂质体法将Smac的过表达质粒pcDNA3.1-Smac转染HEC-1-A细胞,实验分为Smac过表达组、空载体组和空白对照组。应用qRT-PCR和Western blot法检测转染后Smac mRNA及蛋白表达情况。CCK-8法检测过表达Smac对细胞增殖能力的影响。Transwell小室侵袭及迁移实验观察细胞侵袭及迁移能力的变化。结果 Smac过表达组Smac mRNA及蛋白表达比空载体组和空白对照组明显增加(F=172.065,P=0.001;F=697.953,P=0.001)。过表达Smac后,HEC-1-A细胞增殖能力明显减弱(P<0.05)。侵袭及迁移实验结果显示,与空载体组比较,Smac过表达组穿膜细胞数均明显减少(t=9.082,P=0.016;t=6.241,P=0.013)。结论 过表达Smac可明显抑制HEC-1-A细胞的增殖,并显著减弱细胞的侵袭及迁移能力,Smac可为Ⅱ型子宫内膜癌的靶向治疗提供新的研究方向。     

LncRNA NEAT1抑制女性滋养层细胞增殖的研究

目的 探究lncRNA NEAT1调控女性滋养层细胞增殖的作用和机制，为理解由于滋养层细胞增殖障碍而导致的妊娠疾病提供科学依据。方法 以女性绒毛膜滋养层细胞Swan 71为研究对象，采用小干扰RNA和过表达质粒分别转染细胞24h或6h，采用逆转录-实时荧光定量PCR验证干扰和过表达效率，采用逆转录-实时荧光定量PCR和Western blot分别检测lncRNA NEAT1对P21和CDK2的mRNA和蛋白表达水平的影响，通过EdU方法检测lncRNA NEAT1对滋养层细胞增殖的影响，采用两独立样本t检验法进行两组间数据的比较。结果 将lncRNA NEAT1敲低至28.5%（t=7.526，P=0.0172）后，P21的mRNA和蛋白表达水平分别下调至54.1%（t=5.178，P=0.014）和53.8%（t=6.262，P=0.0033）、CDK2的mRNA和蛋白水平分别上调至4.24倍（t=12.86，P=0.006）和2.79倍（t=8.236，P=0.0037），滋养层细胞增殖能力增强；过表达lncRNA NEAT1至169倍（t=10.81，P=0.0085）后，P21的mRNA和蛋白水平分别上调至2.89倍（t=9.435，P=0.025）和1.89倍（t=7.077，P=0.0058），CDK2的mRNA和蛋白水平分别下调至35.6%（t=9.109，P=0.0028）和31.1%（t=12.64，P=0.0062），滋养层细胞增殖能力减弱。结论 LncRNA NEAT1可促进P21并抑制CDK2的表达，进而抑制女性滋养层细胞的增殖能力，揭示了lncRNA NEAT1可能作为由于抑制滋养层细胞增殖功能而导致的妊娠疾病的重要调控分子。     

RNA干扰抑制结肠癌细胞内Bcl-2/C-Raf的表达

[目的]构建Bcl-2/C-Raf的双靶点的RNAi质粒表达载体与单靶点表达载体比较,研究RNAi对各组癌细胞增殖的抑制作用。[方法]分别构建了针对Bcl-2、C-Raf和Bcl-2/C-Raf靶基因的质粒表达载体,通过Lipofec-tamineTM2000介导转染人结肠癌细胞系HCT-8后,检测相应转染组靶基因的mRNA和蛋白质表达量,测定各组细胞活性。[结果]分别转染3种质粒表达载体后,3组结肠癌细胞中相应靶基因的mRNA和蛋白质表达量均降低;转染双靶点干扰质粒的试验组;其细胞活性低于单靶点组;对于针对Bcl-2,C-Raf和Bcl-2/C-Raf基因的3组干扰实验,RNAi对结肠癌细胞增殖的抑制率分别为43.87%、40.64%和63.85%。[结论]Bcl-2/C-Raf双靶点的表达载体对结肠癌细胞增殖的抑制作用要明显优于单靶点表达载体。双靶点质粒表达载体在结肠癌的基因治疗中具有很大优势。     

人乳铁蛋白提高H460细胞放射敏感性的初步研究

目的 观察hLF对于人非小细胞肺癌H460细胞辐射敏感性的影响。方法 用pBC1-hLF载体转染H460细胞,同时以hLF标准品处理为参照,细胞活力实验、克隆形成试验和流式检测细胞凋亡来观察hLF基因高表达对H460细胞生长特性和辐射敏感性的影响。结果 hLF基因高表达可以显著抑制H460的生长(P<0.01),提高其对射线的敏感性,hLF处理组与pBC1-hLF转染组辐射增敏率分别为1.29和1.59。hLF可促进H460细胞自发和受照后的凋亡,降低克隆形成能力(P<0.01)。结论 hLF基因高表达可以体外显著抑制人非小细胞肺癌H460细胞的生长,提高其辐射敏感性。     

降低胃癌细胞硫氧还蛋白5基因表达影响增殖及浸润的研究

目的探讨降低硫氧还蛋白5(EndoPDI)基因表达对于胃癌细胞增殖状态、细胞周期、凋亡等生物学特性及浸润转移能力的影响。方法 EndoPDI基因特异的核糖核酸干扰(RNAi)载体通过脂质体介导法转染人胃癌细胞系细胞(MKN45),筛选获得稳定转染的细胞系,经过免疫细胞化学、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法及蛋白免疫印记(Western-blot)法证实。使用生长曲线法、平板克隆形成实验、细胞迁徙实验等方法分析稳定转染株相关生物学特性的变化,每种检测实验均设立RNAi载体转染细胞组、点突变对照组和空白MKN45细胞组。结果稳定转染的EndoPDI RNAi细胞系经过免疫细胞化学法、RT-PCR法及Western blot法证实,表达抑制率可达70%左右。与对照组细胞相比,EndoPDI RNAi组细胞株生长减慢,各时间点细胞计数显著低于对照组(P0.05);流式细胞仪检测细胞周期显示,S期比例显著低于对照组,G0-G1期比例显著高于对照组(P0.05)。平板克隆形成实验结果显示,EndoPDI RNA i组克隆形成率显著低于对照组(P0.05);细胞迁徙实验结果提示,EndoPDI RNA i组穿膜率显著低于对照组(P0.05)。结论 EndoPDI基因可能具有促进细胞生长增殖作用,降低EndoPDI表达可减少处于分裂周期细胞比例、提高凋亡比例,降低EndoPDI基因表达可能对胃癌细胞的恶性生物学行为有抑制作用。     

Ei sh单纯疱疹病毒1型ICP34.5在Vero细胞的 表达及对Bax/Bcl-2的影响

摘要:目的　构建单纯疱疹病毒1 型（HSV-1）真核表达载体pmR-mcherry-ICP34.5,验证ICP34.5对宿主细胞Bax、Bcl-2 mRNA相对表达量及对Bax/Bcl-2的影响。方法　以提取HSV-1病毒DNA为模版,PCR扩增HSV-1 ICP34.5序列,双酶切连接至pmR-mcherry真核表达载体上,并对重组真核表达载体进行验证,然后重组载体瞬时转染Vero细胞,mRNA水平表达用逆转录PCR方法检测,融合蛋白的表达的检测用荧光显微镜,MTT检测对Vero的细胞活性,喜树碱诱导凋亡后,实时定量PCR检测Bax、Bcl-2 mRNA在细胞中的相对表达量。结果　转染后RT-PCR 验证有目的基因的转录,荧光显微镜观察到融合蛋白在转染的Vero细胞中表达。重组质粒可以抵消空质粒对细胞的损伤作用,转染重组质粒的Vero细胞和正常细胞的中Bax mRNA表达量和Bcl-2 mRNA表达量相差不大,但Bax/Bcl-2得比值明显低于转染pmR-mcherry空质粒的Vero细胞和正常加药的Vero细胞。结论　pmR-mcherry-ICP34.5 真核表达载体能在Vero细胞中高效表达,并能减弱空质粒转染对细胞活性作用,ICP34.5能使Vero细胞中Bax/Bcl-2稳定性增强,使细胞抗凋亡。