沉默乏氧诱导因子-1α基因对乏氧人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性的影响

目的探讨RNA干扰乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）基因对CoCl2诱导的乏氧人肝癌细胞SMMC-7721放射敏感性的影响及其机制。方法利用分子生物学技术构建靶向HIF-1α基因的RNA干扰质粒pGenesil-HIF,脂质体介导转染SMMC-7721细胞后进行乏氧培养,分别采用RT-PCR和Western blot法检测HIF-1α基因的mRNA和蛋白表达,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,克隆存活实验检测细胞放射敏感性的变化。结果酶切鉴定和测序证实重组质粒pGenesil-HIF构建正确,转染质粒后乏氧培养24 h,SMMC-7721细胞HIF-1α基因的mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组和阴性干扰组（P〈0.05或P〈0.01）;乏氧培养24 h、48 h和72 h后,HIF-1α干扰组细胞增殖活性明显低于对照组（P〈0.05或P〈0.01）,细胞阻滞于G0/G1期（P〈0.01）;乏氧培养48 h和72 h后HIF-1α干扰组细胞凋亡百分率明显高于对照组（P〈0.01）;乏氧培养72 h后HIF-1α干扰组SMMC-7721细胞放射增敏比为1.45。结论 RNA干扰HIF-1α基因可增强乏氧人肝癌细胞SMMC-7721的放射敏感性,其机制可能与RNA干扰HIF-1α基因抑制乏氧细胞增殖和诱导凋亡有关。     

化学乏氧人肝癌细胞SMMC-7721中HIF-1α和miR-210的表达

目的探讨不同浓度CoCl2对人肝癌细胞SMMC-7721乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）和miR-210表达的影响以及RNA干扰HIF-1α基因对miR-210表达的影响。方法采用Western blot法检测不同浓度CoCl2培养24 h后SMMC-7721细胞HIF-1α蛋白表达变化,实时定量PCR检测miR-210相对表达量。脂质体介导靶向HIF-1α基因的RNA干扰质粒pGenesil-HIF转染SMMC-7721细胞后,乏氧培养24、48和72 h,分别采用Western blot法和实时定量PCR检测细胞HIF-1α蛋白表达变化和miR-210相对表达量。结果 50和100μmol/L CoCl2培养24 h后细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量与0μmol/L组相比,差异均无统计学意义（均P〉0.05）;150和200μmol/L CoCl2培养24 h后细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量均显著高于0μmol/L组（P〈0.05或P〈0.01）。转染质粒pGenesil-HIF后乏氧培养24、48和72 h,细胞HIF-1α蛋白表达和miR-210相对表达量显著低于阴性干扰组（均P〈0.01）。结论化学乏氧人肝癌细胞SMMC-7721中HIF-1α和miR-210表达明显上调,RNA干扰HIF-1α基因可明显下调乏氧细胞miR-210表达。     

乏氧对EC9706细胞多药耐药相关蛋白表达的影响

目的:研究乏氧对人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株的多药耐药相关蛋白(MRP)表达的影响,探讨乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)在乏氧引起肿瘤细胞多药耐药中的作用.方法:采用化学性低氧诱导剂氯化钴(CoCl2)体外培养人食管鳞状细胞癌EC9706细胞株,用RNAi沉默HIF-1α基因表达,应用半定量RT-PCR检测HIF-1α基因沉默效果.应用RT-PCR、免疫细胞化学技术检测RNA干扰前后乏氧条件下MRP1蛋白及RNA水平表达的变化.结果:乏氧后EC9706细胞中MRP1 mRNA和蛋白的表达均增加(P<0.05).针对HIF-1α基因的siRNA干扰技术,能有效沉默HIF-1α基因的表达.同样乏氧条件,转染HIF-1α siRNA后EC9706细胞较未转染及转染Control siRNA组细胞相比,MRP1 mRNA和蛋白的表达均减少(P<0.05).结论:HIF-1α上调食管鳞状细胞癌细胞中MRP1的表达可能是乏氧条件下化疗耐药的机制之一;HIF-1α可望成为新的食管鳞状细胞癌治疗的靶点.     

体外RNA干扰下调ERM表达对胃癌SGC细胞转移能力的影响

 目的 探讨radixin和moesin是否也和ezrin一样在肿瘤转移中起调控作用。方法 选取ERM均表达的人胃癌SGC细胞作为模型,运用RNA干扰（RNAi）方法分别构建ezrin,radixin和moeisn表达特异性下调的稳定细胞株,并比较它们的体外转移能力。结果 体外细胞侵袭实验表明ERM中任一蛋白的特异性下调均能减弱细胞的转移能力,Western blot分析显示ERM中的任一蛋白的特异性下调均引起E-cadherin表达的明显增加。结论 3种ERM蛋白在SGC细胞的转移过程中都起重要的作用,下调ERM蛋白中的任一成员都能明显降低SGC细胞的转移能力,ERM与E-cadherin间的相互作用可能在肿瘤的发展过程中至关重要。我们的发现同时也为ERM功能冗余论提供了佐证。     

99mTc-HL91肺癌乏氧显像临床价值研究

[目的]探讨乏氧组织显像剂99mTc-HL91显像对肺癌诊断价值及与放射治疗前后肿瘤乏氧程度的改变.[方法]选取确诊的肺癌病例41例,非肺癌病例33例为实验组和对照组.实验组于放射治疗前后1,6 h行99mTc-HL91肺癌乏氧显像并测定其T/NT比值,放疗后前后4 h行CT+SPECT断层显像并测定T/NT比值;对照组行肺部1,6 h99mTc-HL91肺癌乏氧显像.[结果]41例肺癌患者治疗前均可见病灶处放射性分布早期增加,血流灌注峰与邻近正常组织比较明显增加.治疗前1、6 h平面显像T/NT值分别为1.2024±0.0745,1.4659±0.0820;治疗后1、6分别为1.0895±0.0553,1.2163±0.0694.治疗前后比较,P=0.000.对照组33例,1、6h平面显像双肺对应感兴趣区T/NT分别为0.978±0.055和0.980±0.030.肺癌组与对照组1 h,6 hT/NT值比较,差异有显著性,P=0.000.放疗后1、6 h分别为1.0895±0.0553,1.2163±0.0694.治疗前后比较,P=0.000.放疗后1 h,低度乏氧(1.0888＜T/NT≤1.2024)18例,其疗效CR9例,PR8例,SD1例,PD0例;高度乏氧(T/NT＞1.2024)23例,其疗效CR0例,PR18例,SD3例,PD2例.放疗后6 h低度乏氧(1.0898＜T/NT≤1.4659)22例,其疗效CR9例,PR12例,SD1例,PD0例;高度乏氧(T/NT＞1.4659)19例,其疗效CR0例,PR14例,SD3例,PD2例.放疗疗效和乏氧程度分布有显著统计学差异(P＜0.05).[结论]99mTc-HL91能检测肺癌乏氧与否及其程度,可作为评价肺癌乏氧程度的一种辅助手段;肺癌患者放疗前后99mTc-HL91乏氧显像T/NT值分布有明显差异,其乏氧程度和放疗疗效关系密切,可作为肺癌放疗疗效预测的手段之一.     

siRNA靶向沉默HIF-1α基因对肺癌A549细胞转移和侵袭的影响

目的:探讨质粒介导RNA干扰抑制HIF-1α基因对肺癌A549细胞转移和侵袭能力的影响。方法:利用基因工程方法构建HIF-1α的干扰表达载体,并将其转染至肺腺癌A549细胞;分别用RT-PCR方法、Western blot方法检测细胞转染前后HIF-1α以及MMP-2的mRNA及蛋白表达的变化。细胞划痕试验和Transwell实验检测转染前后肺腺癌A549细胞迁移及侵袭能力的改变。结果:转染后肺腺癌A549细胞中HIF-1α和MMP-2的mRNA表达分别下降86%和64%(P<0.05)。转染后细胞蛋白表达明显下降。转染前后穿膜细胞数分别为(135.2±13.2)、(63.7±10.5),差异具有统计学意义(P<0.05)。转染前后划痕宽度分别为(0.48±0.14)、(1.04±0.15)mm,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:RNAi可有效抑制HIF-1α的表达,同时可结合MMP-2启动子下调MMP-2基因和蛋白的表达,降低肺癌A549细胞的转移和侵袭能力。     

加热对乏氧舌癌细胞杀伤力的影响

目的 探讨加热对乏氧的人舌癌Tca8113细胞的杀伤力，为热疗联合放化疗在口腔鳞状细胞癌的临床应用提供理论依据。方法 根据是否给予加热处理分为A组（未加热组）和B组（加热组）；根据乏氧时间A，B组又分别分为0，3，6，12，24h5个小组。依此分组，采用台盼蓝染色，流式细胞术分别检测乏氧的人舌癌Tca8113细胞在加热情况下的细胞死亡百分数和DNA降解率。结果 加热可增加乏氧Tca8113细胞的细胞死亡百分数和DNA降解率，杀伤乏氧的肿瘤细胞；随着乏氧时间的延长，加热对Tca8113细胞的杀伤力逐渐增加。结论 热疗与放化疗联合应用将有利于提高口腔鳞状细胞癌的治疗效果，值得进一步推广。     

乏氧对人口腔鳞状细胞癌细胞中叉头蛋白P3表达的影响及其机制

目的：观察乏氧对人口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞中叉头蛋白P3（FOXP3）表达的影响,阐明乏氧调控FOXP3表达的表观遗传学机制。方法：选取人OSCC细胞株FaDu和OECM-1细胞,常氧和乏氧条件下培养18h。采用实时定量PCR方法检测细胞中FOXP3 mRNA的相对表达水平,Western blotting 法检测FaDu和OECM-1细胞中FoxP3蛋白表达水平,染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）法检测FOXP3基因启动子上组蛋白修饰H3K4乙酰化（H3K4ac）、H3K4三甲基化（H3K4me3）和H3K27三甲基化（H3K27me3）水平。采用组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）基因沉默的FaDu细胞,以实时定量PCR和ChIP-qPCR法检测FaDu细胞中HDA3 mRNA相对表达水平和FOXP3mTNA表达抑制率。结果：与常氧条件比较,乏氧条件下FaDu和OECM-1细胞中FOXP3 mRNA相对表达水平均明显降低,分别下降65.6%（P<0.01）和75.7%（P<0.01）;Western blotting检测,乏氧条件下FaDu和OECM-1细胞中FOXP3蛋白表达水平明显低于常氧条件下;染色质免疫沉淀实验,与常氧条件比较,乏氧条件下FaDu细胞中FOXP3基因启动子上的H3K4ac和H3K4me3水平明显降低（P<0.01）,而H3K27me3水平无明显差异。与无HDAC3基因沉默的FaDu细胞比较,HDAC3基因沉默的FaDu细胞中缺氧诱导的FOXP3启动子上H3K4ac和H3K4me3表达抑制率明显降低（P<0.05）,缺氧诱导的FOXP3mRNA相对表达抑制率降低（P<0.05）。结论：乏氧可通过HDAC3介导的FOXP3基因启动子上H3K4ac水平下调而抑制OSCC细胞中FOXP3的表达。     

乏氧对舌癌细胞尿激酶受体表达的影响

目的 研究乏氧对人舌癌Tca8113细胞尿激酶受体(UPAR)表达的影响，探讨乏氧与口腔癌侵袭、转移的关系。方法 采用免疫组化染色和流式细胞术。对Tca8113细胞在不同乏氧时间(0h、3h、6h、12h、24h)下的UPAR蛋白表达进行定量分析。结果 乏氧可促进入舌癌Tca8113细胞UPAR表达，而且随着乏氧时间3h→6h→12h→24h的延长，UPAR表达逐渐增高。结论 乏氧可通过激活肿瘤细胞高表达UPAR而促进口腔癌侵袭和转移。     

趋化因子受体-4和乏氧诱导因子-1α双抑制对MCF-7细胞的影响

目的 同时抑制乳腺癌细胞株表达的趋化因子受体-4(CXCR4)和乏氧诱导因子-1α(HIF-1α),并考察其对乳腺癌细胞株MCF-7的影响.方法 应用RNA干扰策略,通过优化siRNA序列和改造U6启动子,构建能够在乳腺癌缺氧微环境特异性表达的增强型启动子5HRE-U6(△U6p),并能同步沉默CXCR4和HIF-...     

生存素表达与肺癌多药耐药株H460/cDDP化疗敏感性的关系

目的探讨生存素（survivin）与人肺癌多药耐药株H460／cDDP获得性耐药的关系。方法采用RT-PCR、Western印迹法检测耐药株H460／cDDP与敏感株H460的生存素表达;用针对生存素的小干扰RNA（siRNA）经脂质体介导转染入耐药株H460／cDDP,抑制生存素表达;用四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测顺铂（DDP）、紫杉醇（Taxol）对耐药株H460／cDDP的细胞毒作用。结果耐药株H460／cDDP的生存素mRNA和蛋白质表达均高于敏感株H460。生存素siRNA转染耐药株H460／cDDP后72h,生存素蛋白质的抑制率为92、3％。耐药株H460／cDDP和敏感株H460对DDP的Ic50分别为（6.3±0．6）mg／L、（0.8±0．1）mg／L,对Taxol的Ic50分别为（12．7±1．2）mg／L、（1．5±0．3）mg／L;生存素siRNA作用后,H460／cDDP对DDP、Taxol的IC50分别为（4．0±0.9）mg／L（P=0．002）、（8．1±1．7）mg／L（P=0．003）。结论生存素高表达与耐药株H460／cDDP的获得性耐药有关,生存素有可能成为逆转肺癌耐药性的有效靶点。     

Osteopontin knockdown suppresses non-small cell lung cancer cell invasion and metastasis

Background Osteopontin (OPN) was identified as one of the leading genes that promote the metastasis of malignant tumor.However,the mechanism by which OPN mediates metastasis in non-small cell lung canc...     

利用RNAi技术抑制Bcl 2基因表达增强肺腺癌A549细胞放射敏感性

目的利用RNAi技术抑制Bcl 2基因的表达,观察其对肺腺癌A549细胞凋亡和放射敏感性变化的影响。方法构建Bcl 2基因的干扰质粒pBcl 2 siRNA,稳定转染人肺腺癌A549细胞,同时设立转染无意义链组、空载体组和未转染组。采用Real time RT PCR和Western blot方法, 观察Bcl 2基因在mRNA和蛋白水平表达的变化。采用流式细胞术和克隆形成方法,检测RNA干扰对A549细胞放射敏感性的影响。结果成功构建bcl 2 siRNA质粒,转染A549细胞,获得稳定转染细胞株A549/Bcl2 Ins;Bcl 2mRNA、 Bcl 2蛋白表达明显降低;A549/Bcl2 Ins凋亡率［（10.11±0.92）%］明显高于对照组,6Gy X线照射后凋亡率［（28.81±1.10）%］明显高于对照组及未照射组;A549/Bcl2 Ins的D0和Dq值分别为1.399和1.298,明显低于转染无意义序列细胞株A549/Bcl2 Neg(1.695和2.480)、转染空载体细胞株A549/SD (1.706和2.227)和空白对照细胞A549(1.816和2.777)。结论RNAi技术可以有效抑制肺腺癌A549细胞Bcl 2基因的表达,增强A549细胞对X线的放射敏感性。     

多效蛋白在肺癌中的表达及其转移与预后的关系

目的探讨多效蛋白（PTN）在肺癌中的表达及其与转移和预后的关系。方法采用酶联免疫吸附试验（ELISA）,严格按照试剂盒说明书操作,检测63例肺癌患者中PTN的表达。结果在肺腺癌和肺鳞癌中的PTN阳性表达率均为100%;在不同病理类型、不同细胞分化程度、不同临床分期及是否有淋巴结转移中PTN表达情况的差异有显著性（P均〈0.05）;在Ⅰ～Ⅱ期肺癌的PTN平均值低于Ⅲ～Ⅳ期（P〈0.05）。结论 PTN表达的水平与肺癌的浸润转移关系密切,对判断肺癌患者预后有参考价值。     

非小细胞肺癌转移预测指标的研究

目的 :研究非小细胞肺癌 (NSCLC)淋巴结和远处转移的预测指标 ,并建立Logistic回归模型。　 方法 :通过免疫组化、ELISA、酶谱电泳等方法 ,对NSCLC肿瘤病理标本、血清、尿液和骨髓等进行检查 ,并通过Logistic回归分析建立预测概率模型。　结果 :免疫组化指标肿瘤组织内微血管密度 (IMVD)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)、白细胞分化抗原变异型 (CD4 4v6 )、基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )与NSCLC淋巴结转移危险有关 (P <0 .0 5 ) ,组织金属蛋白酶抑制物 (TIMP 2 )、上皮型钙粘素 (E cad)与NSCLC淋巴结转移危险下降有关 (P <0 .0 5 )。血清MMP 2、MMP 9,尿液MMP 2、MMP 9及骨髓上皮膜抗原 (EMA)阳性细胞与NSCLC远处转移危险有关 (P <0 .0 5 )。其中免疫组化指标CD4 4v6、IMVD、E cad及尿液MMP 2、骨髓EMA阳性细胞对NSCLC转移有显著回归效果而分别被选入概率模型 1和 2 ,其预测准确率分别为 81.1%和 72 .7%。　结论 :组织标本中CD4 4v6、IMVD、E cad以及尿液中MMP 2及骨髓EMA阳性细胞检查 ,可预测绝大多数NSCLC的淋巴结转移和远处转移状况 ,为NSCLC转移的早期诊断提供重要信息 ,有助于NSCLC的个体化治疗和改善预后     

RNAi沉默clusterin基因对卵巢癌SKOV3细胞放射敏感性的影响

目的:研究clusterin(CLU)基因沉默对卵巢癌SKOV3细胞放射敏感性的影响.方法:靶向CLU基因的siRNA转染卵巢癌SKOV3细胞,Western blot法测定CLU基因蛋白表达水平.给予不同放射剂量(2、4、6Gy)处理后,通过MTT法及克隆形成实验检测卵巢癌SKOV3细胞的存活率及克隆形成率,流式细胞...     

肺癌纵隔淋巴结转移与预后的关系分析

目的:研究肺癌中不同形式的纵隔淋巴结转移与预后之间的关系。方法:收集术后病检证实伴有纵隔淋巴结转移的肺癌病例56例,统计纵隔淋巴结的具体转移情况并分为:(1)隆突下淋巴结转移组与非隆突下淋巴结转移组;(2)跳跃式转移组与非跳跃式转移组;(3)1组淋巴结转移组、2组淋巴结转移组及3组淋巴结转移组。比较各相应组的生存情况。结果:隆突下淋巴结转移组与非隆突下淋巴结转移组的生存曲线比较,差异无统计学意义(P>0.05)。跳跃式转移组生存情况较非跳跃式转移组差(P<0.05)。纵膈淋巴结转移组数越多预后越差,尤其是伴有3组以上淋巴结转移的患者预后更差(P<0.01)。结论:肺癌纵隔淋巴结的转移形式与预后相关,跳跃式转移及转移组数多的病例预后更差。     

肺癌脊柱骨转移CT、MRI检查的比较分析

目的总结肺癌脊柱骨转移的影像学变化特点,了解不同影像检查方法的优缺点。方法收集全身骨静态扫描（ECT）检查有阳性表现的35～85岁肺癌脊柱骨转移患者76例,追查其中进行过CT或MRI全脊柱检查的病例55例,观察三种检查方法在反应肺癌脊柱骨转移的不同影像学表现,比较三种检查方法诊断肺癌脊柱骨转移的敏感度。结果①55例CT和MRI显像后的骨质改变表现：呈溶骨性破坏者39例（70．9%）,蜂窝状溶骨性骨破坏11例（20．0％）;呈小片状、斑片状成骨性改变4例（7．3％）,兼有溶骨性及成骨性的混合性骨转移1例（1．8％）。②CT检查40例中,阳性17例,敏感度为42．5％,假阴性率57．5％。相同照射野中,ECT比CT多检出11个病灶。③MRI检查15例中,阳性14例,敏感度为93．3％,假阴性率6．7％。相同照射野中,MRI比ECT多检出8个病灶。结论MRI与ECT对肺癌脊柱骨转移的发现敏感度高,且MRI易发现多发隐匿性病灶,在肺癌脊柱骨转移的诊断中较CT具有明显的优势。如果临床或ECT检查高度怀疑肺癌脊柱骨转移,应该尽早或首选MRI检查。     

应用RNAi技术沉默survivin基因对肾癌786-O细胞的影响

目的 运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特异性阻断肾癌786-O细胞系中survivin基凶的表达,并研究survivin沉默后对786-O细胞的影响.方法 用真核转录载体pcDNA~(TM)6.2-GW/EmGFPmiR构建针对survivin基因的干扰载体,用脂质体法转染肾癌786-O细胞,通过RT-PCR、免疫组化分别检测survivin基因的mRNA和蛋白水平的表达,MTT法检测细胞生长的影响.结果 干扰载体有效地阻断了786-O细胞中survivin基因在mRNA与蛋白水平上的表达,细胞活性受到抑制.结论 RNAi技术沉默survivin基因可以下调肾癌786-O细胞survivin基因的表达,抑制细胞的活性.     

肺癌纵隔淋巴结转移分析

目的:分析肺癌纵隔淋巴结转移情况,促进术前对肺癌纵隔淋巴结转移的诊断。方法:分析86例手术治疗并病理确诊为肺癌病例的纵隔淋巴结肿大情况,并与53例肺部非恶性病变的病例比较。进一步分析相关因素与纵隔淋巴结转移的关系。结果:肺部良恶性病变的纵隔淋巴结肿大发生率差异具统计学意义(P=0.00),肿大与不肿大的纵隔淋巴结其癌转移率(MLNMR)差异具统计学意义(P<0.05)。肺癌纵隔淋巴结肿大部位主要发生在第2、3、5和7组。病程越长、原发病灶的T分级越高,则MLNMR越大(P<0.05),鳞癌、腺癌、小细胞癌的MLNMR依次增大(P<0.05),有毛刺征者比分叶征、偏心空洞征及单纯包块者MLNMR都大(P<0.05)。结论:肺癌纵隔淋巴结肿大和癌转移具有一定特征,掌握这些特征可以促进术前对纵隔淋巴结转移的诊断。