异种黑色素瘤相关抗原诱发抗肿瘤免疫伴发自身免疫性损伤

目的探讨腺病毒载体(Ad)介导异种黑色素瘤相关抗原酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)诱发抗肿瘤免疫与自身免疫性损伤的关系。方法用Ad编码的人或小鼠TRP2(AdhTRP2或AdmTRP2)皮内免疫C57BL/6小鼠,将小鼠分为正常对照组(d1703)、AdhTRP2和AdmTRP2免疫组。体内细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤试验和细胞内干扰素γ(IFNγ)染色(ICS)分析CTL杀伤活性和IFN-γ的产生(每组3只小鼠);皮下接种B16.F10黑色素瘤细胞(每组10只小鼠),观察荷瘤小鼠成活情况。结果AdhTRP2诱发小鼠CTL杀伤活性与免疫时间相关,免疫后1周活性达到最大,随后逐渐降低;AdhTRP2诱导的CTL杀伤活性具有剂量效应关系。AdhTRP2免疫小鼠1周其6hCTL杀伤率为94%±5%,脾脏产生IFNγ的CD8+T细胞占总CD8+T细胞的0.87%±0.12%,而相应地AdmTRP2分别为22%±8%和0.15%±0.05%。接种1×106B16.F10细胞,AdhTRP2免疫的小鼠观察3个月100%无瘤生长,但在病毒注射部位有白癜风形成;而接种1×105B16.F10细胞的AdmTRP2免疫小鼠3个月只有20%的成活率,并不伴局部白癜风形成。结论用Ad介导异种TRP2能有效地打破对自身TRP2的免疫耐受,诱发强烈的抗原特异性细胞免疫反应,同时伴发自身免疫性损伤。     

含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体对荷B16黑色素瘤小鼠免疫功能的影响

目的：研究含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体（AdCMVGM-CSF）直接注射荷B16黑色素瘤小鼠瘤体内对小鼠免疫功能的影响。 方法：将B16黑色素瘤细胞（5×10⁶/只）接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,将荷瘤小 鼠随机分为2组,每组12只,待瘤体直径达5 mm时分别注射AdCMVGM-CSF、AdCMVLacZ （5×10⁸ PFU/只）,检测每组小鼠的免疫功能及其对B16黑色素瘤的抑制作用。 结果：AdCMVGM-CSF实验组小鼠注射后第10天,荷瘤鼠血清中GM-CSF水平［(1 563.72±136.58)ng·L^-1］高于对照组（P<0.01）,肿瘤组织周围的CD8＋ T细胞表达明显增强。 结论：AdCMVGM-CSF可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,具有抑制肿瘤生长的作用。     

重组鼠白细胞介素12与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因联合治疗小鼠B16黑色素瘤

目的：研究重组鼠白细胞介素12（AdCMVIL-12）与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（AdCMVGM-CSF）的腺病毒载体联合应用对B16黑色素瘤的抗肿瘤作用。方法：将B16黑色素瘤细胞接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,待瘤体直径达5mm时将荷瘤小鼠随机分为4组,分别为AdCMVIL-12组、AdCMVGM-CSF组、AdCMVIL-12加AdCMVGM-CSF组（联合治疗组）和AdC MVLacZ组（对照组）,每组12只,并于肿瘤组织局部分别多点注射相对应剂量的腺病毒载体,观察各组小鼠肿瘤的生长情况及其诱导的细胞免疫反应,检测各组小鼠血清IL-12和GM-CSF表达水平的变化。结果：病理学观察,联合治疗组肿瘤组织内可见大片凝固性坏死,有大量的淋巴细胞、巨噬细胞浸润。治疗30 d后,联合治疗组肿瘤平均体积为（60.73±11.36 ）mm³,与对照组、AdCMVIL-12组和AdCMVGM-CSF组［分别为（675.18±80.59）、（1 86.91±19.15）和（223.45±23.11）mm³］ 比较差异均有显著性（P>0.01）。同时,AdCMVIL-12与AdCMVGM-CSF联合基因治疗可有效延长IL-12和GM-CSF的表达时间,并且对B16黑色素瘤细胞具有很强的特异性杀伤作用,杀伤率为（69.53 ± 9.20）%。 结论：IL-12与GM-CSF联合基因治疗可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,并能有效降低单独应用AdCMVIL-12的毒副作用。     

转基因树突状细胞瘤苗诱导的CTL对肿瘤细胞的靶向性杀伤作用

目的：观察mAFP基因转染的树突状细胞（DC）瘤苗诱导的靶向性细胞毒性T细胞（以下简称靶向性CTL）对肿瘤细胞的杀伤作用。方法：用构建的mAFP基因转染的DC瘤苗免疫C57BL／6小鼠,取免疫小鼠脾细胞诱导CTL,LDH非放射性细胞毒性试验检测其对不同肿瘤细胞的杀伤作用。用ELISA法检测CTL诱导过程中TNF—α和IFN-γ分泌变化规律。结果：AFP基因转染的DC瘤苗免疫小鼠后能诱导具有较高抗肿瘤活性的靶向性CTL,这种靶向性CTL对AFP分泌性肿瘤细胞具有更强的杀瘤活性,且在CTL诱导过程中TNF-α和IFN-γ分泌水平明显增高,与对照组比较差异有统计学意义（P〈O．05）。结论：AFP基因重组腺病毒修饰的DC瘤苗免疫C57BL／6J小鼠,能诱导出针对AFP抗原的靶向性CTL,并也能通过分泌TNF-α和IFN-γ实现对AFP分泌性肿瘤细胞的特异性杀伤。     

阳离子脂质体介导粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子基因转染的黑色素瘤细胞作瘤苗的研究

目的 本研究拟探讨采用阳离子脂质体介导的鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子基因转染的B16F1细胞作为瘤苗的抗肿瘤效果.方法 阳离子脂质体复合mGMCSF DNA转染B16F1细胞,ELISA法检测mGMCSF在B16F1中的表达.[3HTdR]掺入法分析B16F1分泌的mGMCSF生物活性.γ射线照射灭活基因修饰的B16F1细胞皮下免疫小鼠,ELISA分析小鼠血清中的mGMCSF水平.7d后免疫鼠皮下攻击未修饰的B16F1细胞以检测瘤苗在小鼠体内的抗肿瘤效果.51Cr释放实验检测免疫鼠抗B16F1的特异CTL反应.结果 阳离子脂质体介导mGMCSF基因转染B16F1细胞后,未经阳性克隆筛选,mGMCSF得到特异且具有生物学活性的表达.但表达逐步下降由第1天的(135.5±21.1)μg/L下降到第5d的(47.8±5.3)μg/L.随γ射线照射剂量的增加,mGMCSF的表达逐步降低,但仍具有生物学活性.γ射线照射的5×105基因修饰B16F1接种小鼠后,鼠血清中的mGMCSF水平在4h时为(198.4±23.1)ng/L,攻击的B16F1细胞在接种瘤苗的小鼠体内的生长完全被抑制,51Cr释放实验结果显示该瘤苗在小鼠体内诱导了特异的CTL反应.结论 本研究表明阳离子脂质体作为基因载体介导鼠粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子基因转染的黑色素瘤B16F1细胞,作为瘤苗在小鼠体内可有效地激发抗肿瘤免疫.     

IFN-γ基因修饰对G422胶质母细胞瘤细胞致瘤性及荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的：观察鼠干扰素－γ（mIFN－γ)基因修饰的小鼠G422胶质母细胞瘤细胞的致瘤性及免疫功能变化。方法：通过重组腺病毒以mIFN－γ基因转染G422胶质母细胞瘤细胞,观察肿瘤的生长和荷瘤小鼠的存活期,采用4h^51Cr释放法检测荷瘤小鼠脾细胞诱导的NK、LAK、CTL的杀伤活性,对治疗后的肿瘤进行常规病理分析。结果：mIFN－γ基因修饰的G422小鼠胶质母细胞瘤体内致瘤生长明显抑制（P＜0．01）,对荷瘤小鼠生存时间长于对照组（P＜0．01）。mIFN－γ组小鼠脾细胞的LAK、CTL杀伤活性显增强,肿瘤组织有灶性坏死,炎细胞浸润。结论：mIFN－γ基因对胶质细胞瘤有一定治疗作用,其机制可能是增强了宿主的局部和全身抗肿瘤免疫反应。     

联合应用NK细胞及CTL对黑色素瘤B16细胞的影响

目的探讨联合应用自然杀伤(NK)细胞及细胞毒T细胞(CTL)对黑色素瘤B16细胞的作用。方法提取NK细胞及CTL,分别用白细胞介素-2(IL-2)(6 000、600IU/L)及植物血凝素(8μg/mL)活化,流式细胞仪检测细胞表面受体,将NK细胞及CTL互为靶细胞及效应细胞进行细胞毒性实验;以黑色素瘤B16细胞为靶细胞检测CTL的杀伤率。结果 NK细胞表面受体NK1.1+的百分比在87%以上,NKp46+在90%以上;CTL表面受体CD3+的百分比在99%以上,CD8+在98%以上。NK细胞与CTL相互无细胞毒性,联合应用NK细胞与CTL明显增加对黑色素瘤B16细胞的杀伤作用。结论联合应用NK细胞及CTL对黑色素瘤B16细胞有协同杀伤作用。     

肿瘤抗原冲击DC诱导淋巴细胞对小鼠胃肠癌的杀伤作用

目的：用胃肠癌冻融抗原冲击树突状细胞（DC）诱导荷瘤小鼠脾细胞，观察DC及细胞毒T细胞（CTL）的生物学功能及对胃肠癌靶细胞体外杀伤作用。方法：小鼠骨髓细胞经GM-CSF、IL-4诱导和胃肠癌细胞系 KATO3、CT26细胞冻融抗原（Ag）的冲击，诱生致敏的DC与活化脾淋巴细胞共培养，获得的CTL对相应靶细胞及对照黑色素瘤细胞进行体外杀伤。结果：制备的DC与CTL具有良好的生物学活性，胃肠癌 Ag冲击的DC诱导的CTL对相应靶细胞的杀伤率分别平均75.98%和86.75%，且效靶比显示量效关系；对无关靶细胞A375为10.57%和11.53%。结论：胃肠癌Ag冲击致敏的DC能诱导CTL产生特异性杀伤作用。     

转导白细胞介素2基因的B16细胞对机体免疫反应的影响

应用XM6逆转录病毒载体将人IL-2cDNA转入小鼠B16黑色素瘤细胞。丝裂霉素C处理的转染前后B16细胞作为瘤苗对小鼠进行免疫接种。结果显示，接种B16-IL-2细胞可明显排斥再移植黑色素瘤的生长。对脾淋巴细胞检测的结果表明，MLTR引起的淋巴细胞增殖与特异性CTL杀伤活性，以及NK、LAK活性与诱生的IL-2水平几项指标，B16-IL-2细胞免疫组均明显高于B16免疫组及对照组。提示转基因肿瘤细胞在体内分泌IL-2增强了机体的特异性与非特异性免疫功能。     

结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的：预测及鉴定结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，为基于表位的结核疫苗研究提供依据。方法：应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A＊0201限制性T细胞表位，利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HL-A＊0201分子的亲合力，选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞，检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性，逐步鉴定出Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。结果：SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA—A＊0201分子的抗原肽，其中3个抗原肽（170～178aa、317～325aa和144～153aa）显示与T2细胞上HLA-A＊0201分子有高结合力，而抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）能够诱导大多数HLA—A＊0201阳性结核患者及PPD（＋）健康志愿者产生特异性CTL细胞，并分泌大量的IFN-γ，能够诱导CTL体外发生增殖，能够产生特异性杀伤活性。结论：成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，可作为结核疫苗设计的候选表位，为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础。     

分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白对小鼠膀胱癌抑癌效应的研究

目的 探讨分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白对小鼠膀胱癌的抑癌效应.方法 采用小鼠T739可移植性膀胱癌模型,共80只分为10组,于移植瘤处局部注射分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白,并用Ag85B蛋白、BCG、IL-2和生理盐水作对照,观察治疗后各组的肿瘤质量、体积和存活期.光镜和电镜下观察肿瘤的形态改变.结果 分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白治疗组小鼠肿瘤瘤质量(2.49±0.60) g,非常显著低于Ag85B蛋白组、BCG组、IL-2组和生理盐水组(P《0.01);Ag85B/IL-2融合蛋白治疗组小鼠肿瘤瘤体积(3.01±0.95) cm3,显著低于Ag85B蛋白组、BCG组、IL-2组和生理盐水组(P《0.05,P《0.01);Ag85B/IL-2融合蛋白治疗组小鼠存活天数(35.50±2.60) d,显著长于Ag85B蛋白组,BCG组、IL-2组和生理盐水组(P《0.05,P《0.01);Ag85B/IL-2融合蛋白对小鼠的肿瘤质量抑制率为64.50%,肿瘤体积抑制率为62.24%,存活延率为48.66%.光镜下观察Ag85B/IL-2融合蛋白治疗组肿瘤细胞有明显的炎性细胞浸润、肿瘤细胞坏死、出血等改变;透射电镜下观察,可见细胞膜破裂,细胞器破坏,细胞质固缩,细胞核破坏,核染色质聚集,凋亡小体出现,巨噬细胞吞噬增多等现象.结论 分枝杆菌Ag85B/IL-2融合蛋白对小鼠膀胱癌具有抑制作用,并能延长膀胱癌荷瘤鼠的生存期.     

乙型肝炎表面抗原作为肿瘤免疫攻击靶点的研究

目的　研究乙型肝炎表面抗原 (HBsAg)作为肿瘤相关抗原用于肿瘤免疫基因治疗的可能性。方法　以 1× 10 6的编码HBsAg的重组腺病毒载体转染的DC(DC HBsAg)、编码增强型绿色荧光蛋白的重组腺病毒载体转染的DC(DC EGFP)、DC以及等体积的 1×PBS静脉免疫B6小鼠 2次 ,每次间隔 1周。于最后一次免疫 1周后 ,每只小鼠皮下接种 7× 10 5B16 HBsAg或等量的B16黑色素瘤细胞。观察各免疫组小鼠皮下肿瘤的生长情况。同法以 1× 10 6的DC HBsAg和DC EGFP、1μg重组HBsAg以及等体积 1×PBS免疫B6小鼠 ,亦于最后一次免疫 1周后 ,处死部分小鼠 ,检测血清中anti HBsAg抗体滴度 ,其余小鼠皮下接种等量的B16 HBsAg ,观察肿瘤生长情况。结果　DC HBsAg疫苗可以诱导出明显强于重组HBsAg疫苗的HBsAg特异的抗瘤免疫 ,但其诱导的体液免疫水平则明显低于重组HBsAg免疫。结论　HBsAg可以作为肿瘤免疫攻击的有效靶点用于抗肿瘤免疫。     

结核分枝杆菌Ag85A在毕赤酵母中的表达、纯化及酶联免疫斑点试验研究

目的利用毕赤酵母表达和纯化结核分枝杆菌AgS5A蛋白,以期得到高效刺激T淋巴记忆细胞产生1．干扰素的特异性抗原。方法用PCR扩增得到Ag85a基因,构建出重组质粒pPic9k085a,通过电转化进入毕赤酵母,经遗传霉素G418抗性筛选、硫酸铵沉淀浓缩及离子交换层析纯化得到目的蛋白。最后以大肠杆菌和毕赤酵母表达的A邸5A分别为抗原刺激物进行酶联免疫斑点（Elispot）试验,分析其刺激BCG免疫小鼠T淋巴细胞产生Υ-干扰素（IFN-Υ）的能力。结果在毕赤酵母中成功克隆并稳定表达了Ag85A蛋白,Elispot检测结果表明,毕赤酵母比大肠杆菌产生的Ag85A蛋白,对小鼠T淋巴细胞的刺激效果更加明显（P〈0．05）,能产生更多的免疫斑点。结论毕赤酵母表达的Ag85A蛋白可以更高效的刺激T淋巴细胞,可用于检测结核杆菌感染诱导的细胞免疫应答。     

携带鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因腺病毒载体对B16黑色素瘤的抑制作用

目的 :观察携带鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因腺病毒载体 ( Ad CMVGM- CSF)对B1 6黑色素瘤的致瘤性及抑制作用。方法 :将 B1 6黑色素瘤细胞与 Ad CMVGM- CSF在 37℃、5 %CO2 培养箱中孵育 ( RPMI- 1 640培养基 ) 2 h后注射到 C5 7BL/ 6小鼠右侧背部皮下 ( MOI=5 0 0 ) ,观察 Ad CMVGM- CSF对 B1 6黑色素瘤致瘤性的抑制作用 ;观察瘤内一次注射及二次注射对 B1 6黑色素瘤的抑制作用。结果 :Ad CMVGM- CSF能有效地抑制 B1 6黑色素瘤细胞的致瘤性 ,抑瘤率达 60 %;瘤内一次注射 Ad CMVGM- CSF可延缓肿瘤的生长 ,二次瘤内注射 Ad CMVGM- CSF能够强化抗肿瘤效果。结论 :Ad CMVGM- CSF具有抑制肿瘤生长的作用     

白细胞介素12基因转染抑制B16细胞成瘤性及转移性的研究

目的探讨白细胞介素１２（ＩＬ１２）基因转移对弱免疫原性的小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞生长与转移的影响。方法构建小鼠ＩＬ１２两个亚单位ｐ４０、ｐ３５ｃＤＮＡ表达载体;经脂质体ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮ介导,将两真核表达载体同时导入Ｂ１６细胞;应用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测ｐ４０、ｐ３５ｍＲＮＡ表达;用生物学活性检测法（致分裂激活的活化的小鼠脾细胞增殖）检测ＩＬ１２分泌;经皮下或静脉接种肿瘤细胞,检测其体内成瘤性及转移性。结果ＩＬ１２基因转染的Ｂ１６细胞（Ｂ１６ＴＩＬ１２）能够表达ｐ４０及ｐ３５ｍＲＮＡ,分泌有生物活性的ＩＬ１２;Ｂ１６ＴＩＬ１２细胞体内成瘤性降低,成瘤延迟,肿瘤生长慢,荷瘤小鼠存活期延长（Ｐ＜００１）;肺转移率降低,肺内转移灶明显减少（Ｐ＜００１）。结论ＩＬ１２基因转染可明显抑制肿瘤生长与转移     

基因枪在肿瘤基因治疗中的应用价值

目的 研究基因枪经小鼠皮肤转移基因的效率、被转基因的表达量、表达时间,以及对小鼠肿瘤的治疗效果,探讨作为一种 基因转移工具,基因枪在基因治疗中应用的可能性。方法 （１）用荧光显微镜观察基因枪对体外培养细胞系的基因转导效率和被转基因表达时间;（２）通过基因枪向小鼠皮肤转Ｌａｃ￣Ｚ基因后,取转瓣皮肤做冰浇灌发片进行β－ｇａｌ染色,观察转基因蛋白在皮人中表达的部位;（３）用ＥＬＩＳＡ法检测向小鼠皮肤转ｍ     

树突状细胞摄取和提呈颗粒化HPV-E7抗原能诱导高水平体液和细胞免疫应答

目的 研究特定大小聚苯乙烯微粒作为抗原载体介导树突状细胞(DC)摄取和提呈抗原,诱导体液和细胞免疫应答的能力,并与DC-微粒-卵清蛋白(OVA)及DC-E7抗原表位的诱导能力进行比较。方法 用粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)联合白细胞介素(IL)-3从小鼠骨髓黏附细胞培养制备DC,流式细胞术分析表型,细胞经荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的微粒-OVA或微粒-E7饲育,或用OVA抗原表位(SIIFEKL多肽)或E7抗原表位(RAHYNIVTF多肽)负载,流式细胞术分析DC对微粒-OVA和微粒-E7的摄取能力,B3Z细胞活化试验检测DC提呈微粒-OVA和OVA抗原表位的能力。分别用DC-微粒-OVA、DC-微粒-E7、DC-OVA抗原表位、DC-E7抗原表位经双侧足掌免疫小鼠,36h后取髂部引流淋巴结,流式细胞仪分析微粒阳性细胞的表型,10d后用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定小鼠血清的抗体水平,酶联免疫斑点法(ELISPOT法)检测小鼠脾细胞干扰素γ(IFNγ)形成单位。结果 小鼠骨髓黏附细胞在GM-CSF和IL-3条件下培养5d后大部分细胞呈树突状形态和表型,经微粒-OVA或微粒-E7饲育后,能高效地摄取和提呈抗原,用DC-微粒-OVA或DC-微粒-E7免疫小鼠后引流淋巴结微粒阳性细胞,主要组织相容(抗原)复合物(MHC)分子和共刺激分子表达率分别为87．06％(MHC-I),63．57％(MHC-Ⅱ),73．40％(CD80),58．43％(CD86),37．62％(CD40)。第10天血清IgG和IgM水平显著升高,脾脏IFNγ形成单位与未免疫小鼠相比显著增多,DC-微粒-E7所诱导的细胞免疫应答与DC-微粒-OVA差异无显著意义。用负载E7抗原表位或OVA抗原表位的DC免疫小鼠后也能诱导细胞免疫应答,但应答强度与DC-微粒-OVA和DC-微粒-E7相比显著减弱。结论 DC-微粒-E7免疫小鼠后,细胞能迁移到引流淋巴结并诱导高水平的体液和细胞免疫应答,提示DC-微粒-抗原可能是一较理想的肿瘤疫苗形式。