p27kip1的亚细胞定位对卵巢癌细胞周期的作用研究

目的 :研究卵巢癌中抑癌基因p27kip1蛋白在不同细胞周期中的亚细胞定位及表达形式,分析其对卵巢癌细胞周期调控的作用机制。方法:以人卵巢癌细胞株SKOV3为研究对象,用血清饥饿法同步细胞周期,采用免疫荧光法测定不同细胞周期中p27kip1、p-Ser10p27kip1蛋白的表达定位情况,并用Western Blot法检测p27kip1、p-Ser10p27kip1在不同细胞生长周期的表达。结果:在G0/G1期卵巢癌细胞中,p27kip1定位表达于细胞核,发挥抑制细胞周期的活性的作用。在S期细胞中,p27kip1以p-Ser10p27kip1的形式存在于胞质中。p27kip1的表达水平随着血清释放的时间延长而逐渐减少。p-Ser10p27kip1表达水平随着血清释放的时间延长而逐渐增加。结论:p27kip1定位于卵巢癌细胞核,抑制细胞周期活化,并以磷酸化的形态转移出核,丧失抑癌活性。     

p27~(Kip1)诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

目的:探讨过表达的p27Kip1对肝癌细胞的抑制作用。方法:利用脂质体介导法将真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His(+)C-p27Kip1基因导入HHCC细胞中,用Westernblot检测p27Kip1是否导入到肝癌细胞中;用流式细胞仪检测过表达的p27Kip1对肝癌细胞HHCC的抑制作用;电子显微镜技术探讨过表达的p27Kip1抑制肝癌细胞生长的可能机制。结果:Westernblot检测表明,转染p27Kip1的HHCC细胞大部分有p27Kip1蛋白的表达;而转染空载体或未转染的HHCC细胞,均未见p27Kip1蛋白表达。经连续3次克隆化后,转染pcDNA3.1/Myc-His(+)C-p27Kip1的HHCC细胞100%表达p27Kip1蛋白。过表达的p27Kip1对HHCC细胞有明显的抑制作用,其抑制率为49.09%～56%;过表达的p27Kip1可以封闭G1期的进程和诱导肝癌细胞发生凋亡,其凋亡百分比为12.3%。结论:过表达的p27Kip1可以通过诱导肝癌细胞凋亡抑制肝癌细胞生长。     

稳定表达趋化因子受体CXCR4卵巢癌细胞株的建立与鉴定

目的:构建人CXCR4真核表达重组质粒,转染人卵巢癌细胞SKOV3,建立稳定转染细胞系并观察其表达效果.方法:从人卵巢癌组织中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增CXCR4的基因编码序列,将序列定向克隆至真核表达载体pReceiver-M02,经酶切和测序鉴定后用脂质体介导的转染技术将质粒pReceiver-M02-CXCR4导入不表达CXCR4蛋白的SKOV3细胞,经G418抗性筛选得到阳性细胞克隆并扩大培养成系.分别采用RT-PCR,Western blot和免疫细胞化学方法检测稳定转染细胞株CXCR4 mRNA和蛋白的表达.结果:得到了抗G418阳性细胞克隆;RT-PCR的产物约为304 bp;Western blot可见一清晰的蛋白条带,与CXCR4的蛋白分子质量相符合.免疫细胞化学结果显示,转染质粒的SKOV3细胞质和细胞膜出现棕黄色颗粒.结论:成功建市稳定表达趋化因子受体CXCR4的卵巢癌细胞株,为CXCR4在卵巢癌中的研究工作提供依据及平台.     

P27对卵巢癌多细胞球体紫杉醇耐药性影响的实验研究

目的：检测p27在卵巢癌多细胞球体中的表达,探讨p27反义寡核到（p27-ASON）对卵巢癌多细胞球体紫杉醇耐药的逆转作用。方法：以三维培养方法获得的人卵巢癌A2780、CAOV3多细胞球体（MCS）为模型,以单层细胞为对照,采用流式细胞仪（FACS）检测细胞周期变化,用蛋白质免疫印迹法（Western blot）、流式细胞仪（FACS）检测p27表达。用激光共聚焦显微镜（Confocal）检测p27蛋白的亚细胞分布。将p27-ASON经脂质体（LipofectAMINE）包裹转染人卵巢癌细胞A2780、CAOV3,用台盼蓝排除实验法和FACS检测细胞凋亡率来分别比较单层细胞、p27-ASON转染前后培养的MCS的紫杉醇敏感性。结果：（1）Western blot、Confocal检测提示MCS中p27表达明显高于单层细胞,FACS检测也提示将单层细胞培养成MCS时,其p27表达明显增高（PA2780=0.011,PCAOV3=0.024）,G0-G1期细胞比率增加,S期和G2-M期细胞比率降低。（2）不同浓度的紫杉醇（0.2、2.0、10.0、20.0μmol/L）作用后,MCS细胞抑制率明显低于单层细胞（PA2780=0.003,PCAOV3=0.015）;经20μmol/L的紫杉醇作用后,单层细胞的细胞凋亡率明显高于MCS,差异有显著意义。（3）p27-ASON转染前培养的MCS较致密,而转染后的较疏松。（4）p27-ASON转染后培养的MCS(p27-ASON/MCS),p27表达明显下调,G0-G1期细胞比率减少,细胞抑制率、细胞凋亡率检测其对紫杉醇的敏感性明显高于转染前。结论：卵巢癌MCS对紫杉醇化疗的耐药与p27的表达上调有关,p27-ASON可一定程度的逆转卵巢癌对紫杉醇化疗的耐药性,提高化疗疗效。     

ARLTS1基因重组质粒对卵巢癌细胞株SKOV3生长和凋亡的影响

目的 探讨Ras超家族成员ARLTS1基因对卵巢癌细胞株SKOV3生长及凋亡的影响.方法 构建真核表达质粒pCMV-Tag 3B-ARLTSI,并转染卵巢癌SKOV3细胞株,采用RT-PCR技术和Western blot方法检测ARLTS1基因转染组、空载体pCMV-Tag 3B转染组和未转染组中ARLTS1 mRNA及蛋白表达水平,用MTT及流式细胞仪检测各组细胞生长、周期及凋亡率等生物学行为的变化,Western blot检测细胞easpase-3和bcl-2蛋白表达水平的变化.结果 真核表达质粒pCMV-Tag 3B-ARLTSI转染SKOV3细胞后,经PCR和Western blot证实转染成功.ARLTSI转染SKOV3细胞后,细胞生长明显受抑(P<0.05).流式细胞术检测发现ARLTS1基因转染组与空载体转染组及未转染组细胞相比,S期细胞比例明显增多(P=0.035和0.011,细胞凋亡率(36.7%)显著高于另两组细胞(P均<0.001).ARLTS1基因转染组细胞中caspase-3和bel-2蛋白表达水平分别下降34.9%和47.7%,与未转染组细胞相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 ARLTS1基因转染后能抑制人卵巢癌细胞SKOV3的生长,调控SKOV3细胞周期,可能通过caspase途径促进肿瘤细胞凋亡·     

LY294002对胃癌MGC803细胞生长的影响

目的 观察磷脂酰肌醇-3-激酶的特异性抑制剂(LY294002)对胃癌MGC803细胞生长的影响.方法 选用LY294002处理胃癌MGC803细胞后,利用细胞生长曲线、平皿克隆与流式细胞术观察细胞的生长情况,采用免疫细胞化学染色和Western blot检测AKT蛋白与p27Kip1蛋白磷酸化及Cyclin E蛋白的表达.结果 LY294002处理后,MGC803细胞生长速度明显减慢,细胞克隆体积变小,数量减少;G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例降低.LY294002处理后,MGC803细胞中磷酸化的AKT蛋白与Cyclin E蛋白表达降低,而磷酸化的p27Kip1蛋白表达升高.结论 LY294002抑制胃癌MGC803细胞生长速度,呈现出G1/S期细胞周期阻滞.     

血清饥饿释放过程中Raji细胞内Skp2与p27kip1的表达变化及意义

目的:探讨血清饥饿释放过程中淋巴瘤细胞株Raji细胞内Skp2与p27kip1的表达变化及意义。方法:采用免疫沉淀方法检测Raji细胞中p27kip1与Skp2的结合情况;采用血清饥饿合并释放同步化处理Raji细胞,经WesternBlot技术检测该过程中p27kip1、Skp2在Raji细胞中的表达变化。结果:免疫沉淀结果显示在Raji细胞中p27kip1与Skp2能够相互结合。在Raji细胞血清饥饿释放过程中,Skp2蛋白总量增加,p27kip1蛋白总量减少。结论:在Raji细胞血清饥饿释放过程中Skp2合成增加,可能通过加快p27kip1的泛素化降解而使细胞中p27kip1显著减少,从而推动了细胞周期的进程。     

外源性p27Kip1基因转染对人乳腺癌MCF-7细胞株细胞周期和增殖的影响

目的：探讨外源性p27Kip1基因对人乳腺癌MCF-7细胞株细胞周期和增殖的影响。方法：应用脂质体转染法将含人野生型p27Kip1基因质粒DNA转染乳腺癌MCF-7细胞,免疫细胞荧光化学方法验证p27Kip1基因转染MCF-7细胞后蛋白表达情况;流式细胞仪检测细胞周期的变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,观察外源性p27Kip1对乳腺癌细胞MCF-7生长的影响。结果：免疫细胞荧光化学方法证实p27Kip1基因转染MCF-7细胞后存在蛋白表达;流式细胞仪检测结果提示,细胞周期出现G0/G1期阻滞;细胞计数法绘制细胞生长曲线显示细胞增殖明显抑制。结论：外源性p27Kip1基因对乳腺癌MCF-7细胞生长和细胞周期有明显抑制作用。     

WT1反义核酸诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

[目的]研究WT1反义寡核苷酸转染对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响。[方法]实验分4组:正常对照组(加入转染液)、反义组(脂质体+反义寡合苷酸转染)、正义组(脂质体+正义寡合苷酸转染)和脂质体组(只加入脂质体)。分组转染卵巢癌SKOV3细胞株后,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期,MTT法检测细胞的增殖活性,RT-PCR检测WT1 mRNA表达水平,Western blot检测其蛋白表达水平。[结果]脂质体介导的WT1反义寡核苷酸转染明显抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖,抑制率为49.48%,G0-G1期细胞分布率增加达(79.10±2.79)%,凋亡细胞群明显增多,凋亡率为(13.18±2.00)%,同时转染后细胞WT1 mRNA及蛋白表达水平下降,与对照组及其他各组相比较差异均有显著性意义(P<0.05)。[结论]WT1反义核酸能抑制卵巢癌细胞增殖,诱导细胞凋亡。WT1反义核酸用于卵巢癌的基因治疗具有一定的潜在意义。     

干扰STAT3的siRNA真核表达载体对人卵巢癌的侵袭转移性的相关研究

目的：通过构建针对STAT3的siRNA真核表达载体,研究STAT3对卵巢癌SKOV3细胞侵袭转移能力的影响。方法：使用软件Primer Premier 5设计siRNA靶序列,在合成修饰靶序列之后,构建siRNA-STAT3-脂质体复合物,并转染卵巢癌SKOV3细胞;通过Western blot检测细胞STAT3的表达,通过Transwell小室及对卵巢癌SKOV3细胞侵袭相关蛋白MMP-2的检测,探讨siRNA-STAT3对卵巢癌细胞侵袭力的影响。结果：构建干扰STAT3的siRNA真核表达载体转染SKOV3细胞可显著抑制细胞中STAT3的蛋白表达;与SKOV3细胞对照组和SKOV3细胞阴性对照组相比,SKOV3细胞siRNA-STAT3组中细胞侵袭转移能力明显下降。结论：构建干扰STAT3的siRNA真核表达载体可有效抑制STAT3的表达及卵巢癌SKOV3细胞的侵袭转移能力。     

Mutant p27(Kip1) and its potential effect as hepatocellular gene therapy

BACKGROUND: The cyclin-dependent kinase (cdk) inhibitor p27(Kip1) is an important regulator of cell cycle progression as it negatively regulates G(0/1) progression and plays a major role in controlling the cell cycle. The screening of the p27(Kip1) sequence identified many potential phosphorylation sites. To investigate the effects of the overexpression of exogenous p27(Kip1) protein lacking the Thr157 sites on subcellular localization, cell cycle, and proliferation, a plasmid was constructed containing mutations of p27(Kip1) at Thr157 (T157A p27), and transfected into the SMMC7721 cell line with Lipofectamine. Wild-type and mutant p27 plasmids T157A were transfected separately as control groups. METHODS: We detected the proliferation of SMMC7721 cells by the Cell Counting Kit and FACS/Calibur Flow Cytometer and analyzed the expression and localization of p27(Kip1) by Western blotting analysis and cell fractionation. The cdk2 dependent kinase activity was determined by in vitro kinase assay. RESULTS: Proliferation of SMMC7721 cells was greatly inhibited and cell cycle was arrested in G(0/1) phase after exogenous p27(Kip1) mutant expression much more than wild-type p27(Kip1). The expressed T157A p27(Kip1) proteins were translocated from the cytoplasm into nucleus much more compare with wild-type. Compared with pcDNA3.1-Myc control, transient transfection of T157A p27(Kip1) decreased expression of cyclin D1 and the phosphorylated form of retinoblastoma protein. CONCLUSIONS: These findings support the potential effectiveness of a PI3K/Akt-resistant phosphorylated form of p27 in hepatocellular carcinoma gene therapy.     

庆大霉素诱导肾小管上皮细胞凋亡及细胞周期调节蛋白表达

目的：观察庆大霉素对体外培养的肾小管上支细胞凋亡的诱导作用；研究在细胞凋亡过程中细胞周期调节蛋白cyclinE、CDK2和p27^kipl蛋白表达的改变，并探讨细胞凋亡与细胞周期调节蛋白表达之间的关系。方法：0．2～3．2mg／ml的庆大霉素作用于体外培养的猪肾近端小管上皮细胞株(LLC-PK1细胞)24～96h,MTT法测定庆大霉素对细胞增殖的抑制率,琼脂糖凝胶电泳法观察凋亡细胞DNA条带，流式细胞术测定细胞凋亡率(AI)和细胞增殖动力学,Western印迹分析检测培养96h时细胞内cyclinE、CDK2和p27^Kipl的蛋白表达。结果：庆大霉素对LLC-PK1细胞增殖有抑制作用，庆大霉素具诱导细胞凋亡的作用,AI呈药物浓度和作用时间依赖性：庆大霉素致细胞周期停滞于G1期。随着庆大霉素浓度的增加，细胞内cyclinE和CDK2蛋白表达逐渐下调．而p27^Kipl蛋白表达则逐渐上调。结论：厌大霉素诱导的LLC—PK1细胞凋亡与细胞周期调节蛋白cyclinE和CDK2表达下调以及p27^Kipl表达上调有关。     

野生型p53基因重组质粒的构建及对人卵巢癌细胞的抑制作用

目的:研究p53基因转染对卵巢癌细胞系SKOV-3生物学行为的影响.方法:用分子克隆技术构建人野生型p53基因与真核细胞表达载体PCNDA3的重组体(PCNDA-p53),并用脂质体介导的转染技术,将其导入不表达p53的人卵巢癌SKOV-3细胞中,经筛选、鉴定后,观察细胞生长速度、集落形成能力和增殖周期的变化.结果:成功地构建了人野生型p53基因与真核细胞表达载体的重组体,转染后获得稳定表达p53的转染克隆.外源性p53基因的表达明显抑制了卵巢癌细胞的生长速度及集落形成能力,使细胞阻滞于G1期.结论:外源性野生型p53基因能抑制卵巢癌细胞的增殖.     

藏红花素对人膀胱移行细胞BIU-87细胞抗增殖作用研究

目的 研究藏红花素(crocin)对人膀胱移行细胞株BIU-87增殖的作用及机制.方法 MTT法测定crocin抗增殖效应,FCM分析细胞周期分布,RT-PCR技术测定Cyclin D1, p27kip1 mRNA表达变化,Western blot检测Cyclin D1,p27kip1蛋白表达变化.结果 crocin对细胞生长有抑制作用,且呈时间-剂量依赖关系.FCM检测显示,crocin可使细胞阻滞于G0/G1期;3.2mmol/L crocin作用于BIU-87细胞后RT-PCR结果显示,Cyclin D1 mRNA表达明显下调,p27 mRNA无显著变化;Western blot结果表明Cyclin D1蛋白明显下调;p27kip1蛋白表达显著增加.结论 crocin对细胞有抗增殖作用,可阻滞细胞于G0/G1期,其可影响Cyclin D1 mRNA转录,但并不影响p27 mRNA表达水平,并调控Cyclin D1、p27kip1蛋白表达.     

Survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞株中survivin和SMAC/DIABLO基因表达的影响

目的 观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3中survivin、Smac/DIABLO表达的影响,探讨survivin、Smac/DIABLO在ASODN诱导卵巢癌细胞凋亡和细胞周期改变中的作用和分子机制.方法 用脂质体(LipofectamineTM 2000)介导survivin ASODN转染人卵巢癌细胞株SKOV3,用MTT比色法检测细胞生长活性,流式细胞学技术检测细胞凋亡指数、细胞周期分布及survivin、Smac蛋白表达改变,逆转录酶链反应检测survivin、Smac/DIABLO基因表达改变.结果 同对照组比较,不同浓度ASODN作用后细胞生长明显减慢,转染后48 h IC50在600 nmol/1左右.用600 nmol/LASODN转染48h后,细胞凋亡指数(AI)明显增加,(t=6.3671,P＜0.05);更多的细胞停留在G0/G1期(t=10.3832,P＜0.01).Survivin mRNA和蛋白表达明显下调(t=3.5031,P＜0.05,t=7.8146,P＜0.01),SmacmRNA和蛋白表达上调(t=2.8011,P＜0.05,t=11.3917,P＜0.01).结论 ASODN诱导细胞凋亡,使更多的细胞停留在G0/G1期,减少进入有丝分裂细胞数的作用,是通过下调survivin基因,上调Smac基因表达来共同完成的,survivin、Smac/DIABLO基因在调节SKOV3细胞周期、凋亡的功能上密切相关,二者的相互作用是卵巢癌发生、发展的重要分子机制之一.     

野生型及Thr187突变型p27Kip1 蛋白对HepG2细胞周期的影响

目的p27kip1氨基端第187号位置的苏氨酸(Thr187)磷酸化位点是该蛋白分子中重要的磷酸化位点,探讨人工诱变该位点苏氨酸为丙氨酸(T187A)后对肝癌细胞株HepG2细胞周期以及细胞增殖的影响。方法应用脂质体转染法将含人野生型和突变型p27kip1基因质粒DNA转染HepG2细胞,免疫细胞荧光化学检测p27kip1蛋白的表达,并用流式细胞仪分析细胞周期的变化。结果野生型和突变p27kip1基因转染HepG2细胞后均能在细胞核表达,并且可以明显抑制细胞增殖。p27kip1基因转染的HepG2细胞发生G0期阻滞,且突变型G0期阻滞作用明显强于野生型(P<0.01)。结论转染的p27kip1能够在HepG2细胞过度表达并能抑制HepG2细胞的增殖,Thr187磷酸化位点的人工诱变可能有利于p27kip1蛋白促使细胞G0期阻滞。     

沉默Nek2基因对卵巢癌SKOV3细胞周期的影响

目的：研究RNA干扰NIMA相关激酶2（Nek2）表达对卵巢癌细胞SKOV3细胞周期的影响及其相关的分子机制。方法将针对Nek2基因的siRNA转染至SKOV3细胞中,采用流式细胞技术检测SKOV3细胞周期变化,并用Westernblot技术检测Nek2‐siRNA转染入卵巢癌SKOV3细胞48h后,与细胞周期相关的因子cyclinB1、CDK1及P27蛋白表达水平以及ERK1／2磷酸化水平的变化。结果空白对照组、阴性对照组和RNA干扰组中处于G2／M期的细胞比例分别为13．72％、12．27％和1．56％,与两对照组比较,处于G2／M期的干扰组细胞明显减少（P＜0．05）。Nek2基因沉默后,与两对照组比较,SK‐OV3细胞内cyclinB1和CDK1的蛋白表达水平明显下降,P27的蛋白表达水平明显上调,SKOV3细胞内ERK1／2磷酸化水平明显下降（P＜0．05）。结论沉默Nek2基因,可阻止卵巢癌SKOV3细胞启动有丝分裂,从而抑制其增殖。