豚鼠环磷酰胺预处理后再免疫对其ABR阈值的影响

目的建制一高阳性率、可供圆窗给药治疗内耳病研究用的自身免疫性内耳病动物模型。方法采用270—370g重的白色红目豚鼠97只作为实验对象，其中32只用于制备粗制内耳抗原，47只经环磷酰胺腹腔注射预处理2d后，再用粗制内耳抗原行皮内多点接种。动物于接种后4、6、8、10、12、14、20d(分别为6、7、7、6、9,6、6只)接受听性脑干反应(ABR)检测。正常对照18只，组1(12只动物)不行任何处理，组2(6只动物)仅行环磷酰胺预处理，不行粗制内耳抗原接种。结果实验组动物接种后4d时ABR阈值升高10dB以上者为67％，8d时为86％．14d时仍为58％，接种后20d时所有动物ABR阈值恢复正常。结论将豚鼠用环磷酰胺预处理后，用粗制同种异体内耳抗原只需单次接种即可建立听力损害发生率高的自身免疫性内耳病动物模型。     

同种异体内耳组织免疫后豚鼠听功能与内耳形态学变化的关系

目的 观察豚鼠接受环磷酰胺处理及免疫后其听功能与内耳形态学变化的关系。方法 采用86只白色红目豚鼠作为实验对象，其中32只动物提供粗制内耳抗原。实验组（42只）动物于腹腔注射环磷酰胺2d后用粗制内耳抗原接种，接种后4．6、8、10、12、14、20d时接受ABR检测及内耳形态光镜观察。对照组1（6只）不行任何处理，对照组2（6只）注射环磷酰胺，但不接种抗原。结果 接种后4d时67％动物ABR阈值明显提高，8d时为83％，14d时降为58％，20d时所有动物阈值恢复正常。光镜观察发现：接种后4d时，实验动物听功能受损耳出现炎性细胞浸润；8—12d时，所有实验动物内耳均有类似改变；6—14d时，内耳尚有血管周围炎、螺旋神经节细胞变性等改变，相关形态变化均以听功能受损耳明显为重；接种14d时，内耳炎性细胞浸润明显减轻，20d时，绝大多数动物内耳形态基本恢复正常。结论 豚鼠接受环磷酰胺预处理及同种异体内耳抗原接种后，其听功能与内耳形态学的变化基本相一致。     

实验性自身免疫性内耳病耳蜗热休克蛋白70的表达

目的　探讨自身免疫性内耳病模型动物耳蜗热休克蛋白的表达。方法　利用同种异体内耳抗原免疫豚鼠 ,以建立自身免疫性内耳病 (autoimmuneinnereardisease ,AIED)动物模型 ,并应用免疫组织化学及原位杂位技术 ,研究热休克蛋白 (heatshockprotein ,hsp) 70在正常对照组及AIED模型动物实验组耳蜗中的表达情况。结果　对照组豚鼠螺旋神经节细胞中存在hsp70样蛋白基础表达 ;实验组 2 8耳中 10耳 (35 7% )听阈提高≥ 10dB ;此组动物螺旋神经节细胞和血管纹、螺旋韧带hsp70及其mRNA表达明显增强。结论　以粗制膜迷路抗原免疫豚鼠 ,听阈提高动物hsp70在螺旋神经节细胞和血管纹、螺旋韧带合成增加。     

纯化内耳P0蛋白诱发实验性自身免疫性内耳病动物模型

目的：用从内耳组织中纯化的P0蛋白免疫豚鼠,建立P0蛋白诱发的自身免疫性内耳病动物模型,研究其在自身免疫性内耳病中的作用。方法：采用制备性SDS-PAGE从内耳组织中分离、纯化P0蛋白。以纯化的豚鼠内耳P0蛋白作为抗原免疫豚鼠,观察其听性脑干反应阈,血清中抗体水平和内耳形态学的改变,并用免疫组织化学法确定P0蛋白在耳蜗的分布情况。结果：SDS-PAGE结果显示纯化的蛋白质只在分子量为30 000的位置上出现单一的蛋白染色带,Western blot结果示该蛋白即为P0蛋白。免疫后有22%豚鼠的听性脑干反应阈升高,对照组动物无变化。实验组血清IgG显著升高（F=6.48,P〈0.01）,反应阈提高豚鼠的螺旋神经节细胞均有不同程度的数目减少,蜗轴小血管周围有炎性细胞浸润。P0蛋白在耳蜗仅分布于螺旋神经节、蜗轴神经纤维的髓鞘上。结论：用制备性SDS-PAGE能够成功地从内耳纯化P0蛋白,用于自身免疫性内耳病的研究。P0蛋白在部分豚鼠能够诱发自身免疫性内耳病,可能是自身免疫性内耳病的自身抗原之一。     

凋亡及其相关基因在实验性自身免疫性内耳病小鼠内耳组织中的表达

目的探讨凋亡及其相关基因在自身免疫性内耳病形成和发展中的作用。方法选用近交系C57BL／6小鼠随机数字表法分为正常对照组和免疫7、14、21、28d组，每组16只。提取豚鼠内耳膜迷路组织为抗原，与等量完令弗氏佐剂，百日咳杆菌一次免疫实验组动物，制备自身免疫性内耳病动物模型，应用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase—mediated d-UTP nick end—labing，TUNEL）检测内耳中的细胞凋亡，应用免疫组化和逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）技术检测Fas、FasL及bcl-2在内耳的表达。结果正常小鼠内耳组织中，TUNEL染色阳性细胞极为少见，偶尔在Corti器或球囊斑的支持细胞发现。免疫7d后，内毛细胞和少量的血管纹边缘细胞TUNEL染色阳性，14d后TUNEL染色阳性的细胞数量及种类显著增加，但外毛细胞、螺旋神经节细胞与前庭神经节细胞免疫前后均未见凋亡表达。免疫组化染色显示，正常小鼠内耳中Fas表达广泛，FasL存部分螺旋神经节细胞与前庭神经节细胞表达，bcl-2仅在螺旋神经节细胞、前庭神经节细胞有较强表达。免疫后FasL在各种组织均有较强表达，bcl一2在外毛细胞出现表达，在耳蜗神经无细胞的表达增加。RT—PCR检测正常小鼠内耳组织的Fas mRNA、FasL mRNA、bcl-2mRNA均为阳性，FasL mRNA低水平表达，免疫后升高，在2周达到高峰后逐渐下降；bcl-2 mRNA在免疫后进行性升高。结论Fas／FasL信号系统介导的凋亡与自身免疫性内耳病的发生、发展过程关系密切，bcl-2对内耳中Fas／FasL介导的凋亡有重要的调节作用。     

实验性自身免疫性内耳疾病

取体重250～350克、耳廓反射正常的缝康、年轻豚鼠25只,分成两组,试验组15只,对照组10只。应用粗制、同种豚鼠的内耳抗原得到内淋巴积水、血管炎及内淋巴囊轻度细胞浸润等很明确的自身免疫性内耳疾病的动物模型。通过电生理、组织学和免疫荧光检查来研究内耳在功能、解剖和免疫学方面的变化。结果发现:在电生理方面,听阈提高10dB以上者有5耳(5/25)占20％,听诱发反应的阈     

三种内耳抗原与自身免疫性内耳病的相关性研究

目的探讨3种纯化的内耳抗原与自身免疫性内耳病的关系,并确定其在耳蜗的表达.方法以粗制内耳抗原的3种亚组份(31000、42000～45000和60000蛋白)作为抗原,分别免疫动物(B、C和D组),观察听阈、血清IgG水平和内耳形态学的改变,并应用免疫组织化学方法确定其在耳蜗的表达.A组为对照组,以不含抗原的聚丙烯酰胺凝胶匀浆液代替内耳抗原.结果免疫前各组听阈差异无显著性(F=0.07,P>0.05),免疫后对照组和C组听阈和内耳形态学未见明显改变,B组(9/30只)和D组(7/28只)部分动物出现听力损失.组间听阈差异有显著性(F=9.12,P<0.01).实验组动物血清IgG均显著性升高(F=7.46,P<0.01),B、C和D组与对照组相比差异有显著性.31000蛋白完全分布于耳蜗神经纤维,而42000～45000和60000蛋白分布广泛,螺旋神经节、Corti器、血管纹和螺旋韧带均有分布.结论粗制内耳抗原中31000和60000亚组份均能独立诱发自身免疫性内耳病,31000蛋白具有很高的组织特异性,可能作为一种标志性蛋白用于自身免疫性内耳病的临床诊断.     

实验性自身免疫性内耳病耳蜗热休克蛋白70的表达

目的 探讨自身免疫性内耳病模型动物耳蜗热休克蛋白的表达。方法 利用同种异体内耳抗原免疫豚鼠,以建立自身免疫性内耳病（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｉｎｎｅｒ ｅａｒ ｄｉｓｅａｓｅ,ＡＩＥＤ）动物模型,并应用免疫组织化学及原位杂位技术,研究热休克蛋白（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｍｔｅｉｎ,ｈｓｐ）７０在正常对照组及ＡＩＥＤ模型动物实验组耳蜗中的表达情况。结果 对照组豚鼠螺旋神经节细胞中存在ｈｓｐ７０样蛋白基     

含抗内耳抗原特异性抗体的体液转移免疫致豚鼠先天性感音神经性聋的实验研究

目的：证实针对内耳组织抗原特异性抗体通过胎盘可造成子鼠先天性自身免疫性感音神经性聋。方法：同种粗制内耳抗原（CIEAgs）免疫豚鼠,造成自身免疫性感音神经性聋（ASNHL）动物模型。ELISA法测定示其血清抗体水平升高,耳蜗电图（ECochG）示其听神经复合动作电位和（或）耳蜗微音器电位阈值或伪阈升高。取其血清（含特异性抗内耳组织抗原抗体）持续转移免疫妊娠豚鼠,采用ECochG测试被动免疫妊娠母鼠和子鼠的听觉功能,再采用颞骨火棉胶切片和苏木精一伊红染色,光镜观察内耳组织形态学改变。结果：各组出现听觉损伤的动物是：采用ASNHL模型动物血清被动免疫的8只妊娠母鼠中有5只（7耳）和其所产子鼠8只中有6只（10耳）,采用非ASNHL模型动物血清免疫的妊娠豚鼠所产子鼠5只中有1只（2耳）。出现听力损失的被动免疫母鼠和子鼠内耳病理形态学改变主要为螺旋神经节细胞变性和Rosenthal管中炎性细胞（以单个核细胞为主）浸润,部分动物出现膜迷路积水。结论：同种体液转移免疫可造成自身免疫性内耳病变,子鼠产生听觉功能障碍主要是由于母鼠所产生的特异性抗内耳组织抗原抗体经胎盘到达子鼠体内所致。     

三种内耳抗原与自身免疫性内耳病的相关性研究

目的 探讨3种纯化的内耳抗原与自身免疫性内耳病的关系,并确定其在耳蜗的表达。方法 以粗制内耳抗原的3种亚组分（31000、42000－45000和60000蛋白）作为抗原,分别免疫动物（B、C和D组）,观察听阈、血清IgG水平和内耳形态学的改变,并应用免疫组织化学方法确定其在耳蜗的表达。A组为对照组,以不含抗原的聚丙烯酰凝胶匀浆液代替内耳抗原。结果 免疫前各组听阈差异无显著性（F＝0．07,P＞0．05）,免疫后对照组和C组听阈和内耳形态学未见明显改变,B组（9／30只）和D组（7／28只）部分动物出现听力损失。组间听阈差异有显著性（F＝9．12,P＜0．01）。实验组动物血清IgG均显著性升高（F＝7．46,P＜0．01）,B、C和D组与对照组相比差异有显著性。31000蛋白完全分布于耳蜗神经纤维,而42000－45000和60000蛋白分布广泛,螺旋神经节、Corti器、血管纹和螺旋韧带均有分布。结论 粗制内耳抗原中31000和60000亚组份均能独立诱发自身免疫性内耳病,31000蛋白具有很高的组织特异性,可能作为一种标志性蛋白用于自身免疫性内耳病的临床诊断。     

自身免疫性内耳病动物模型的建立

目的　建立一种自身免疫性内耳病的动物模型 ,其具有可重复性高 ,适于进行深入免疫学分析的特点。方法　提取豚鼠内耳膜迷路组织为抗原 ,与等量完全弗氏佐剂 ,百日咳杆菌一次免疫C5 7BL/6小鼠。检测反应阈、血清免疫学、内耳形态学及免疫组织化学的改变。结果　免疫后小鼠听性脑干反应阈显著提高 ,内耳中出现显著的炎性细胞浸润、内淋巴积水和螺旋神经节细胞变性、数量减少等形态学改变 ,血清中可检测到抗内耳自身抗体 ,鼓阶内浸润细胞中的淋巴细胞主要为CD4 T细胞。结论　应用这种方法在C5 7BL/6小鼠可成功建立自身免疫性内耳病的动物模型     

内淋巴囊同种抗原免疫致自身免疫性Mnière病的实验研究

采用同种粗制内耳抗原（CIEAg）在已致敏的豚鼠内淋巴囊（ES）局部免疫，诱发出明显的前庭和听觉功能障碍，以及与Meniere病极为相似的内耳膜迷路水肿改变。从而证明ES局部同种内耳抗原免疫是一种有效的造成Meniere病的方法，揭示部分Meniere病的发病机制可能与自身免疫因素有关。     

Spontaneous remission in experimental autoimmune labyrinthitis.

We investigated the time course of hearing impairment and cellular infiltration into the inner ear after systemic sensitization of guinea pigs with a single intradermal injection of bovine inner ear antigen (IEAg) in complete Freund's adjuvant (CFA). Lymphocytes and polymorphonucleocytes appeared mainly in the scala tympani on days 7 to 14, and in addition there was thickening and cellular infiltration of the round window membrane at day 14. These cellular infiltrations resolved after day 28. The auditory brain stem response thresholds from IEAg-sensitized animals were significantly elevated after day 7. Some sensitized animals (n = 5) had spontaneous remissions after day 28; however, the hearing thresholds did not completely recover. These results demonstrate that experimental autoimmune labyrinthitis can be induced by a single inoculation of IEAg-CFA and that remission, as evidenced by clearing of the cochlear cellular infiltration and improved hearing thresholds, can occur spontaneously.     

自身免疫性内耳病动物模型的建立

目的建立一种自身免疫性内耳病的动物模型，其具有可重复性高，适于进行深入免疫学分析的特点。方法提取豚鼠内耳膜迷路组织为抗原，与等量完全弗氏佐剂，百日咳杆菌一次免疫C57BL／6小鼠。检测反应阈、血清免疫学、内耳形态学及免疫组织化学的改变。结果免疫后小鼠听性脑干反应阈显著提高，内耳中出现显著的炎性细胞浸润、内淋巴积水和螺旋神经节细胞变性、数量减少等形态学改变，血清中可检测到抗内耳自身抗体，鼓阶内浸润细胞中的淋巴细胞主要为CD4^ T细胞。结论应用这种方法在C57BL／6小鼠可成功建立自身免疫性内耳病的动物模型。     

In vivo visualization of endolymphatic hydrops in guinea pigs: magnetic resonance imaging evaluation at 4.7 tesla

In order to find out whether it is possible to visualize experimental endolymphatic hydrops in the cochlea with magnetic resonance imaging (MRI) at 4.7 T, we used 11 guinea pigs. Five normal guinea pigs were used as controls. Early manifestation of endolymphatic hydrops was evaluated in endolymphatic sac (ES)-intact animals (n = 6), and advanced manifestation in ES-damaged animals (n = 5) by means of MRI with gadolinium-diethylenetriaminepentaacetate-bismethylamide (Gd-DTPA-BMA) contrast agent. Hearing was tested with electrocochleography. The surface area of 3 partitions of the cochlea was used to quantify endolymphatic hydrops. The fine structure of the 3 partitions of the cochlea was visualized with MRI in all animals, as Gd-DTPA-BMA appeared mainly in the scala tympani and scala vestibuli. As early as 5 days after endolymphatic sac surgery, endolymphatic hydrops started to appear as visualized by MRI and also verified with histology. Severe damage to the inner ear barrier with Gd-DTPA-BMA leakage into the scala media was detected with MRI in 1 ES-damaged animal that had a 60-dB hearing loss. To conclude, endolymphatic hydrops can be visualized with high-resolution MRI by means of Gd-DTPA-BMA, and it is possible to quantify the extent of endolymphatic hydrops. Damage to the inner ear barrier or possible rupture of membranes can be shown with the assistance of Gd-DTPA-BMA.     

用4.7特斯拉磁共振成像活体内观测豚鼠实验性内淋巴积水

目的探讨用4.7特斯拉试验用磁共振成像系统能否在豚鼠中检测内淋巴积水.方法20只白色或者杂色豚鼠用于该研究.5只正常豚鼠作为对照组,15只豚鼠用于制作内淋巴积水模型.9只内淋巴囊破坏组中的5只和6只内淋巴囊完整组(与乙状窦游离)动物采用gadolinium(Gd)-DTPA-BMA增强MRI检测内淋巴积水.结果由于Gd-DTPA-BMA主要进入鼓阶和前庭阶,耳蜗的三个阶可在所有动物中由MRI清晰显示.在内淋巴囊完整组,内淋巴囊手术后6天MRI即可检测到内淋巴积水,并且由组织学证实.在内淋巴囊破坏组中的1只动物,因内耳屏障的严重破坏而使Gd-DTPA-BMA快速漏入中阶,MRI可检测到该变化,其听力损失为60dB.结论用Gd-DTPA-BMA增强的高分辨MRI可检测出内淋巴积水,有可能对积水程度进行定量测试.在Gd-DTPA-BMA的帮助下,内耳屏障损伤或可能的膜破裂可以被检出.     

Expression of heat shock protein 70 in immune response of the guinea pig inner ear]

OBJECTIVE: To explore whether the immune response of the inner ear could induce heat shock protein (hsp) 70 in guinea pig cochlea. METHODS: A model of autoimmune inner ear disease (AIED) was established by systemically immunizing the guinea pig with the homologous crude inner ear antigen (CIEAg). The immunized cochleae and normal control cochleae were examined for the expression of hsp70 with techniques of immunohistochemistry and in situ hybridization. RESULTS: In the control animals, the expression of the hsp70-like protein appeared only in the spiral ganglion, whereas in the cochleae with CIEAg immunization, strong expression of the hsp70-like protein and its mRNA appeared in the spiral ganglion as well as in the stria vascularis and the spiral ligament. The hearing thresholds were significantly increased in 10 out of 28 cochleae (35.7%) with CIEAg immunization. CONCLUSION: The results suggest that the immune response of the inner ear can induce the expression of hsp70 in the guinea pig cochlea.