广东地区宫颈病变HPV81型L1基因多态性分析

目的 调查我国广东地区宫颈病变患者组织中HPV81型的阳性率及其Ll基因多态性.方法 采用HPV通用引物对1200例HPV DNA检测阳性的宫颈脱落细胞标本中的HPV L1区基因序列进行PCR扩增,并结合基因测序分析.结果 和结论 获得HPV81型4例.检出率为0.33%.与Genbank标准株相比,广东地区发现的HPV81 L1基因有多处不同,与日本发现的HPV81病毒株相近.     

尖锐湿疣组织HPV6b和11型L1基因多态性及蛋白特性分析

目的：调查温州地区尖锐湿疣组织HPV6b和11型感染情况，分析其L1基因多态性及蛋白特性变化，为基因工程重组L1蛋白疫苗的应用提供理论依据。方法：采用HPV6b和11型L1基因特异性引物对31份温州地区尖锐湿疣组织标本进行PCR扩增，并各取7份阳性PCR产物直接测序，用软件分析HPV6b和11型L1基因多态性及蛋白特性。结果：31份标本中，HPV6b和11型阳性率分别为35．5％和45．2％。与标准基因序列比较，HPV6b和11型L1基因分别形成5和6种突变模式，同源性分别为99．8%～99．9％和99．7％～99．9%。HPV6b型L1基因中仅1处碱基突变引起所编码氨基酸的变异（S→P），但其编码蛋白在亲水性、表面可及性及抗原性上无明显变化；HPV11型L1基因的碱基突变均为无义突变，所编码氨基酸与标准株完全一致。结论：HPV6b和11型是温州地区尖锐湿疣的主要感染型别；HPVBb和11型L1基因序列高度保守。     

pQE32-HPV18L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒获得HPV18 L1活性蛋白，为进一步研制HPV18基因工程疫苗打下基础。方法 以重组质粒pBR322-HPV18为模板，利用PCR方法扩增HPV18 L1DNA片段，将HPV18 L1DNA与pUC19质粒重组构建pUC19-HPV18 L1重组质粒。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。再利用pQE32质粒做表达载体构建pQE32-HPV18 L1重组质粒，并用酶切电泳验证。结果 PCR扩增DNA片段约为1.7Kb，与预期结果相同。pUC19-HPV18 L1克隆重组质粒酶切后显示4.39Kb，酶切图谱与预期相同。测序验证插入片段全序列无改变。pQE32-HPV18 L1表达重组质粒酶切后显示其大小约5.16Kb，酶切图谱亦与预期相同。结论 pQE32-HPV18 L1表达重组质粒构建成功。     

HPV 1 6 L1蛋白在原核表达系统中的表达与纯化

目的：建立HPV16L1蛋白原核表达系统的纯化方法,纯化目的蛋白。方法：构建pGEX4T-HPV16L1表达质粒。在大肠杆菌BL21表达系统中表达,经过包涵体提取,8mol/L尿素溶解,分级透析除去尿素,亲和层析进行提纯。结果：HPV16L1蛋白在原表达系统以不溶性包涵体形式存在,通过本方法可以获得纯化的蛋白。结论：建立了一套纯化HPV16L1蛋白的方法,为研究HPV16L1的应用研究打下了基础。     

广东地区宫颈癌HPV52型L1基因突变分析

目的 调查我国广东地区宫颈癌患者组织中HPV52型的感染率及L1基因突变特性,为制备适合中国人群的疫苗提供流行病学资料.方法 采用HPV通用引物对130例宫颈癌标本中的HPV L1区基因序列进行PCR扩增,并结合基因测序分析.结果 获得HPV52型8例,检出率为6.15%,对所获得的各例HPV52 L1基因测序分析.结论 与Genbank标准株相比,广东地区发现的HPV52 L1基因有多处突变,与香港发现的HPV52突变株相近.     

宫颈癌患者HPV16型L1基因克隆及序列分析

目的 了解萍乡地方株HPV16 L1基因结构特点,分析其结构蛋白L1基因多态性及蛋白特性变化,为基于L1基因工程疫苗的设计和应用提供理论依据.方法 设计HPV16型L1基因特异性引物,从宫颈脱落上皮细胞中提取DNA,进行PCR扩增鉴定,将扩增的片段同T-载体连接,然后导入到大肠杆菌DH-5α中培养,提取质粒DNA进行测序.结果 测定的序列与标准基因序列(NC Sbjct 496)比较,萍乡地区宫颈癌感染的HPV16型L1基因同源性为98.9％～99.6％,分别形成5种突变模式,其中3处由于核苷酸的改变,翻译的氨基酸也相应发生变化,但有1处由于核苷酸的丢失造成翻译的氨基酸也相应发生变化.结论 萍乡地方株HPV16 L1核酸有一定程度的变异,可能会造成HPV16 L1蛋白免疫原性的差异..此株改变也可能是本地区导致宫颈癌的主要原因.实验结果为研制适应本地区的基于HPV16 L1的基因工程疫苗提供了可靠实验依据.     

温州地方株HPV16型L1基因多态性及蛋白特性分析

目的：了解温州地方株HPV16 L1基因结构特点,分析其结构蛋白L1基因多态性及蛋白特性变化,为基于L1基因工程疫苗的设计和应用提供理论依据。方法：设计HPV16型L1基因特异性引物,从宫颈癌组织标本提取DNA,进行PCR扩增鉴定,PCR产物直接测序;进一步用Vector NTI 8.0和DNAStar软件分析HPV16型L1基因多态性及蛋白特性变化情况。结果：测定的序列与标准基因序列（NC 001526）比较,温州地区宫颈癌感染的HPV16型L1基因同源性为99.1%～99.8%,分别形成8种突变模式,其中3处由于核苷酸的改变,翻译的氨基酸也相应发生变化,但其编码蛋白在亲水性、表面可及性及抗原性上与标准株相比较无明显变化。结论：温州地方株HPV16 L1核酸有一定程度的变异。     

pQE31-HPV16 L1重组质粒的构建及鉴定

目的 构建重组原核表达质粒以获得ＨＰＶ１６ Ｌ１活性蛋白。为进一步研制ＨＰＶ１６基因工程疫苗打下基础。方法 以克隆质粒pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检查质闰重组后序列情况。结果 ＰＣＲ结果显示扩增片断大小为１.5Kb,与预期相同。重组质粒酶切后显示其大小约５.0Kb。大小及酶切图谱与预期相同。经测序发现插入片段两端序列无改变。结论 pQE３１－ＨＰＶ１６Ｌ１质粒构建成功。     

人乳头瘤病毒HPV16L1—E7C重组腺病毒载体的构建

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型野毒株质业中分离出ＨＰＶ１６Ｌ１（５５５９－７１５１ｂｐ）、ＨＰＶ１６Ｅ７Ｃ（６８２－８５５ｂｐ）基因片段,采用ＰＣＲ产物的Ｔ－Ａ克隆法,将Ｌ１、Ｅ７Ｃ分别插入ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ载体,构建克隆载体ｐＴＡＬ１、ｐＴＡＥ７Ｃ。ＢａｍＨ１、ＨｉｎｄⅢ酶切ｐＴＡＥ７Ｃ,Ｂｇ１Ⅱ、ＣｌａⅠ酶切ＰＴＡＬ１,回收Ｌ１、Ｅ７Ｃ片段,利用ＢａｍＨⅠ、Ｂｇ１Ⅱ酶切产竽相同粘末端的特点,     

HPV16L1—E7重组腺病毒rAd5HPV16L1—E7的构建及克隆表达

目的：研制人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）Ｌ１－Ｅ７重组腺病毒,以期获得防治宫颈癌的组腺病毒减毒活疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。方法：以ＨＰＶ１６型－１１４／Ｋ为模板,利用ＰＣＲ克隆技术构建可表达ＨＰＶ１６主要宙蛋白Ｌ１（１－３０１ａａ）和转蛋白Ｅ７（１－６０ａａ）融合基因的重组质粒ｐＵＣ１９Ｌ１－ｐＨＢＧ１０共转染２９３细胞,制备重组腺病毒ｒＡｄ５ＨＰＶ１５６Ｌ１－Ｅ７,密度梯度超速离心纯楷ＨＰＶ     

HPV16L1重组蛋白在甲醇营养型酵母菌中的诱导表达及鉴定

目的 ＨＰＶ１６Ｌ１重组蛋白的表达为研制ＨＰＶ１６Ｌ１预防性蛋白疫苗及诊断试剂盒打下基础。方法 ｐＰＬＣ３．５－ＨＰＶ;１６Ｌ１／ＧＳ１１５阳笥菌株,经０．５％甲醇诱导,运用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测Ｌ１蛋白;用鼠抗ＨＰＶ１６Ｌ１单克隆抗体,经Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ检测蛋白的特异笥;在透射电下观察类病毒颗粒（ＶＬＰｓ）结果 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测结果表明,在５５ＫＤ处有诱导蛋白带的出现;经Ｗ     

人乳头瘤病毒18型L_1基因果蝇表达系统的构建和鉴定

目的:利用基因重组技术,构建人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1基因果蝇表达质粒。方法:以pUC18-HPV18为模板,运用PCR方法扩增不含核定位序列的HPV18L1DNA片段;PCR产物连接至PGEM-TEasy质粒,并测序鉴定;将测序正确的HPV18L1DNA片段亚克隆到果蝇表达载体pMT/BiP/V5-HisA中;利用酶切及PCR方法鉴定重组质粒。结果:经双酶切及PCR鉴定,证实成功构建重组果蝇表达质粒pMT/BiP/V5-HPV18L1。结论:pMT/BiP/V5-HPV18L1重组果蝇表达质粒为下一步转染果蝇S2细胞及制备HPV18VLPs奠定了基础。     

HPV6b VLPs检测尖锐湿疣病人血清和宫颈分泌物抗体的意义

目的 :探讨人乳头瘤病毒 (HPV)感染后尖锐湿疣 (CA)病人机体产生的免疫反应及特异性抗体用于HPV感染的诊断价值。方法 :采用重组杆状病毒 昆虫细胞系统制备HPV 6bL1VLPs抗原 ,以酶联免疫吸附试验 (ELISA)分别检测 4 9例CA病人和 4 5例正常对照的血清抗体、4 6例CA病人和 36例正常对照的宫颈分泌物抗体 ,并用血凝抑制试验检测抗体的中和活性。结果 :CA组HPV6bL1VLPs特异性的血清IgG抗体和分泌物IgA抗体的OD值和阳性率均显著高于正常对照组 (P <0 .0 0 1)。HPV 6型与HPV 11型DNA阳性者的血清IgG和分泌物IgA抗体的阳性率差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。血清IgG和分泌物IgA抗体血凝抑制试验平均效价较正常对照组为高。结论 :生殖道HPV感染后可产生全身和局部生殖道粘膜抗体反应 ,两类抗体均具中和活性。HPV6型与HPV11型感染者的血清和分泌物抗体均存在交叉反应。血清抗体和局部分泌物抗体可能具有用于诊断HPV感染的价值     

携带人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶( APE1)基因重组慢病毒载体的构建及体外表达检测

目的:构建携带人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶-1 (Apurinic/apyrimidinic endonuclease-1,APE1)基因重组慢病毒载体内英文摘要中,并检测其体外表达目的基因的水平.方法:应用基因克隆技术将人APE1基因克隆入慢病毒载体LV中,经过PCR、酶切和测序鉴定后,与包装四质粒系统共转染293T细...     

NMNAT1基因慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶.1(NMNAT1)基因慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据.方法:将靶向NMNAT1基因连接到慢病毒载体pGC-E3/Lenti中,获得pGC-E3-NMNATI统一质粒,经PCR检测以及测序鉴定后,与慢病毒包装质粒通过LipofectamineTM2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,并测定其滴度.结果:PCR扩增和测序结果证实,Nmnatl核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为1×105U/L.结论:成功构建NMNAT1基因慢病毒载体,为研究其在面神经损伤修复中的功能和基凶治疗奠定了基础.     

小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶基因打靶载体的构建及鉴定

目的：对牙釉质丝氨酸蛋白酶（EMSP1）基因 进行体外扩增，构建基因打靶载体，利用基因打靶技术建立转基因动物模型，研究EMSP1生理功能和病理学意义。方法：根据EMSP1的DNA序列，采用Oligo 6.0软件设计两对引物，以129品系小鼠基因组DNA为模板，分别扩增长为5 000 bp和1 700 bp片段作为同源长短臂。将其分插入通用型基因敲除载体pSSC-9的正向筛选基因neo两侧，用PCR方法、限制性酶切DNA 序列分析进行鉴定。结果：采用双酶切鉴定，阳性重组克隆分别切出5000 bp和1700 bp片段，表明长短臂已克隆于载体中。DNA序列分析表明，成功构建 EMSP1基因打靶载体pSSC-9- EMSP1。结论：成功构建小鼠EMSP1基因打靶载体。     

重组人RAMP-1基因腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建携带人受体活性修饰蛋白-1（RAMP1）基因的腺病毒表达载体,为进一步深人研究RAMPl的功能奠定基础。方法通过基因工程技术将RAMP1基因克隆到穿梭质粒pShutde—GFP—CMV中;I-CeuI＋I—SceI双酶切穿梭质粒pShuttle—GFP—CMV—RAMPl,将回收的GFP-CMV—RAMP1片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒Ad—RAMP1并进行PCR鉴定及滴度测定。结果构建的重组穿梭质粒pShuttle—GFP—cMVl-RAMP1双酶切后,得到O．8kb（RAMP1）和5．1kb（pShuttle—GFP—CMV）两个片段;重组腺病毒质粒pAdxsi—GFP—CMV—RAMP1用XhoI酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒Ad—RAMP1 PCR鉴定可见阳性扩增条带;病毒滴度检测达4．5×10^11PFU／ml。结论成功构建了携带人RAMP1基因的重组腺病毒载体,为进一步研究RAMPl的功能研究奠定了基础。     

PTPN1基因siRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建可沉默PTPN1基因的siRNA（siRNA）表达载体,并鉴定它对大鼠心肌细胞PTPN1基因的沉默率。方法合成3对发夹siRNA模版寡核苷酸链,退火形成双链后插入pSilencer载体,构建成可沉默PTPN1基因的siRNA表达载体,通过酶切和测序鉴定构建的siRNA表达载体,并导入培养的大鼠心肌细胞,通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应和免疫印迹分析导入了siRNA表达载体的大鼠心肌细胞PTP1B的表达水平。结果酶切鉴定和测序结果证实构建的3个siRNA表达载体构建正确。实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测显示构建的3个siRNA表达载体的干扰率分别为73.2%、84.7%及32.5%。它们的干扰效果被免疫印迹分析所证实。结论干扰率为84.7%的表达载体为构建成功的siRNA表达载体,可用于心肌细胞PTPN1基因的功能研究。