树突状细胞摄取和提呈颗粒化HPV-E7抗原能诱导高水平体液和细胞免疫应答

目的 研究特定大小聚苯乙烯微粒作为抗原载体介导树突状细胞(DC)摄取和提呈抗原,诱导体液和细胞免疫应答的能力,并与DC-微粒-卵清蛋白(OVA)及DC-E7抗原表位的诱导能力进行比较。方法 用粒一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)联合白细胞介素(IL)-3从小鼠骨髓黏附细胞培养制备DC,流式细胞术分析表型,细胞经荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的微粒-OVA或微粒-E7饲育,或用OVA抗原表位(SIIFEKL多肽)或E7抗原表位(RAHYNIVTF多肽)负载,流式细胞术分析DC对微粒-OVA和微粒-E7的摄取能力,B3Z细胞活化试验检测DC提呈微粒-OVA和OVA抗原表位的能力。分别用DC-微粒-OVA、DC-微粒-E7、DC-OVA抗原表位、DC-E7抗原表位经双侧足掌免疫小鼠,36h后取髂部引流淋巴结,流式细胞仪分析微粒阳性细胞的表型,10d后用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定小鼠血清的抗体水平,酶联免疫斑点法(ELISPOT法)检测小鼠脾细胞干扰素γ(IFNγ)形成单位。结果 小鼠骨髓黏附细胞在GM-CSF和IL-3条件下培养5d后大部分细胞呈树突状形态和表型,经微粒-OVA或微粒-E7饲育后,能高效地摄取和提呈抗原,用DC-微粒-OVA或DC-微粒-E7免疫小鼠后引流淋巴结微粒阳性细胞,主要组织相容(抗原)复合物(MHC)分子和共刺激分子表达率分别为87．06％(MHC-I),63．57％(MHC-Ⅱ),73．40％(CD80),58．43％(CD86),37．62％(CD40)。第10天血清IgG和IgM水平显著升高,脾脏IFNγ形成单位与未免疫小鼠相比显著增多,DC-微粒-E7所诱导的细胞免疫应答与DC-微粒-OVA差异无显著意义。用负载E7抗原表位或OVA抗原表位的DC免疫小鼠后也能诱导细胞免疫应答,但应答强度与DC-微粒-OVA和DC-微粒-E7相比显著减弱。结论 DC-微粒-E7免疫小鼠后,细胞能迁移到引流淋巴结并诱导高水平的体液和细胞免疫应答,提示DC-微粒-抗原可能是一较理想的肿瘤疫苗形式。     

抗人参皂苷Rg3抗血清的制备

目的:通过构建人工抗原制备抗人参皂苷Rg3的特异性抗血清.方法:采用高碘酸盐氧化法将Rg3与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)共价偶联,分别合成免疫抗原Rg3-BSA和包被抗原Rg3-OVA.用合成的Rg3-BSA免疫家兔,制得抗人参皂苷Rg3的特异性抗血清,并通过酶联免疫方法(ELISA)对抗血清进行鉴定.结果与结论:人工抗原Rg3-BSA制备成功,由其所得抗血清的效价为1:51 200,交叉反应率低于3%,具有很强的特异性.     

抗癌胚抗原单抗与生物素及链霉亲和素偶联物的制备及性能鉴定

目的　 研究抗癌胚抗原(CEA)单抗与生物素及链霉亲和素(streptavidin, SA)偶联物的制备方法。方法　 将CEA单抗按抗体与生物素活化酯物质的量之比为1:15～1:50进行生物素化。抗CEA单抗与SA的偶联采用3-（2-吡啶二巯基丙酸）-N-琥珀酰亚胺酯（SPDP）化学偶联法制备。抗CEA单抗偶联物的生物活性及免疫活性分别采用间接ELISA方法和放射免疫分析法进行测定。 结果　生物素化单抗每分子抗体中约偶联3分子生物素,具有良好的SA结合活性,经SDS-PAGE电泳证实为单一蛋白条带,仍保留95%的免疫活性。SA每分子中含有1～2个巯基,而抗CEA单抗每分子中含有2～3个3-（2-吡啶二巯基丙酸）-N-琥珀酰亚胺酯间接ELISA方法证实偶联物具有良好的生物素结合活性, SDS-PAGE电泳显示单抗-SA偶联物相对分子质量为210 000左右,仍保留着原单抗活性的70%左右。结论　所制备的两类抗CEA单抗偶联物基本保持完整的特异性结合肿瘤CEA的性质,可为进一步的预定位显像和治疗应用提供可靠的靶向载体。     

抗癌胚抗原单抗与生物素及链霉亲和素偶联物的制备及性能鉴定

目的 研究抗癌胚抗原（CEA）单抗与生物素及链霉亲和素（streptavidin,SA)偶联物的制备方法。方法 将CEA单抗按抗体与生物素活化酯物质的量之比为1：15－1：50进行生物素化。抗CEA单抗与SA的偶联采用3－（2－吡啶二巯基丙酸）－N－琥珀酰亚胺酯（SPDP）化学偶联法制备。抗CEA单抗偶联物的生物活性及免疫活性分别采用间接ELISA方法和放射免疫分析法进行测定。结果 生物素化单抗每分子抗体中约偶联3分子生物素,具有良好的SAI结合活性,经SDS－PAGE电泳证实为单一蛋白条带,仍保留95％的免疫活性。SA每分子中含有1－2个疏基,而抗CEA单抗每分子中含有2－3个3－（2－吡啶二基丙酸）－N－琥珀酰亚胺酯间接ELISA方法证实偶联物具有良好的生物素结合活性,SDS－PAGE电泳显示单抗－SA偶联物相对分子质量为210000左右,仍保留着原单抗活性的70％左右。结论 所制备的两类抗CEA单抗偶联物基本保持完整的特异性结合肿瘤CEA的性质,可为进一步的预定位显像和治疗应用提供可靠的靶向载体。     

酶放大时间分辨荧光免疫分析酶底物试剂5-氟水杨酸磷酸酯的研制(简报)

酶放大时间分辨荧光免疫分析法（EATRFIA），是酶放大湖系元素发光法（EALL）在免疫分析中的应用，集中了生物素（BT）一链霉亲和素（SA）的高亲和力和放大作用，酶放大作用，湖系元素的激发光与发射光波长之间距离大，荧光寿命长等特有优点，集其时间分辨和波长分辨测量技术等于一体，是近年来发展起来的一种全新的超灵敏生物分析法。例如检测血清中促甲状腺激素灵敏度可达0·003mlU／L，其原理是抗原与包被单抗和生物素化单抗同时反应后，再与链霉亲和素（SA）一碱性磷酸酶（AP）复合物（SA－AP）反应，成为结合了AP的免疫反应…     

重组E.coli. LLO/OVA明显增强小鼠CD11c细胞活性及抗肿瘤免疫

目的 探讨重组E.coli. LLO/OVA 诱导C57BL/6小鼠机体免疫的途径,观察其免疫后小鼠机体抑制B16-OVA黑色素瘤的效果.方法 磁珠分离E.coli. LLO/OVA及E.coli. OVA免疫后小鼠脾脏CD11c、CD4 和CD8 T细胞并检测CD11c细胞诱导同源CD4 和CD8 T增殖水平和细胞因子分泌程度;流式细胞检测小鼠脾脏内肿瘤抗原OVA257-264 SIINFEKL特异的细胞毒T细胞含量.比较两种E.coli. 免疫后,恶性黑色素瘤B16-OVA在小鼠肺内形成瘤结节的数量.结果 与E.coli. OVA相比, E.coli. LLO/OVA免疫后小鼠脾脏CD11c细胞诱导同源CD4 T细胞增殖作用增强、IL-2分泌增高;同时诱导CD8 T细胞增殖和IFN-γ分泌的作用也明显增强;OVA257-264 SIINFEKL特异的CD8 T细胞含量也明显增高;小鼠肺内形成B16-OVA瘤结节平均数明显减少. 结论 E.coli. LLO/OVA有效地诱导小鼠CD11c细胞活化,增强其对CD4 T细胞增殖和IL-2分泌以及对CD8 T细胞增殖、IFN-γ分泌的作用,诱导了更多的OVA特异的CD8 T细胞,使机体产生了更强的抗肿瘤免疫.     

SA/hIL-15融合蛋白的制备及生物学活性鉴定

目的 制备链亲和素(SA)/人白细胞介素-15 (hIL-15)融合蛋白SA-hIL15和hIL-15-SA,并鉴定其生物学活性.方法 构建原核表达质粒pET24a-6His-SA-hIL-15和pET32a-hIL-15-SA-6His,转化大肠杆菌BL21(DE3),用镍金属螯合(Ni-NTA)层析柱进行纯化,并对其进行复性.CCK-8检测融合蛋白PHA刺激的人外周血淋巴细胞增殖的活性,流式细胞仪分析融合蛋白对生物素化的B16.F10细胞锚定修饰率.结果 成功构建了两种重组融合蛋白的表达质粒并在大肠杆菌实现了高效表达,目标蛋白的表达约占细菌总蛋白的20%.经纯化、复性的SA/hIL-15融合蛋白具有双重活性,即:能促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖的hIL-15活性,和SA介导的高效结合至表面已生物素化的B16.F10肿瘤细胞的功能(表面锚定修饰效率大于95%).SA-hIL-15双功能融合蛋白促进PHA激活的人外周血淋巴细胞增殖活性高于hIL-15-SA双功能融合蛋白.结论 SA/hIL-15双功能融合蛋白的制备为hIL-15表面锚定修饰的肿瘤细胞疫苗的研制打下了基础.     

钛种植体表面固定生物素的实验研究

目的：利用生物素-亲和素系统,将生物素共价键合在钛基材表面,为钛种植体表面接枝生物活性分子提供新的实验方法。方法使用3-氨丙基膦酸( APP)对钛基材表面进行酸蚀处理并使其获得游离氨基,由碳二亚胺( EDC )介导,通过与羧基反应形成酰胺键以实现生物素-亲和素系统在钛种植体表面的固定。结果通过环境扫描电镜、傅立叶变换红外光谱、X射线光电子能谱、免疫荧光等检测方法对样品进行表征,证实钛基材表面已成功接枝生物素。结论采用生物素-亲和素系统,可以在氨基化的钛基材表面成功接枝生物素,为钛种植体表面生物化修饰的研究提供新的方法和思路。     

抗生物素的提取和高效率交联抗生物素与辣根过氧化酶

蛋清经过丙酮、硫酸铵沉淀、离子交换提取抗生物素。抗生物素使用 S—乙酰巯基琥珀酸酐处理以导入巯基。使用 N-(ε-马来酰亚胺已酰)琥珀酰亚胺酯将马来酰亚胺基导入辣根过氧化酶(HRP),然后与经化学修饰的抗生物素上巯基反应,高效率制备抗生物素—辣根过氧化酶交联物。这种交联方法不影响酶活力,抗生物素和 HRP 的回收率分别高达61.5%和79.3%。抗生物素—HRP 交联物可用于建立高灵敏度酶免疫测定法和免疫组织化学染色。     

靶向树突状细胞的肿瘤疫苗OVA慢病毒载体构建及其体外抗肿瘤效应

目的构建靶向树突状细胞(dendritic cell,DC)的肿瘤疫苗pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体,并观察肿瘤抗原特异性DC激活T细胞对小鼠Lewis肺癌细胞(lewis lung carcinoma cell,LLC)的抗肿瘤效应,为肺癌的临床治疗提供实验依据。方法以分子克隆方法构建携带模拟肿瘤抗原鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的慢病毒表达载体,经XhoⅠ及XbaⅠ双酶切后电泳和DNA测序验证;应用脂质体法三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,转导LLC,进行单克隆化筛选培养后,经RT-PCR、Western blot检测所获得的OVA稳定表达细胞株中OVA的表达;分离纯化小鼠骨髓DC;用慢病毒感染DC;分离纯化小鼠脾T淋巴细胞;应用MLR和MTT法检测肿瘤抗原负载的DC刺激T淋巴细胞对LLC的杀伤作用。结果 (1)构建的pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体经酶切后电泳和DNA测序,结果显示载体构建正确;(2)获得了纯化的小鼠骨髓来源的DC;(3)获得了携带肿瘤抗原OVA的LLC和DC;(4)负载肿瘤抗原的DC刺激T淋巴细胞能有效地杀伤负载相同肿瘤抗原的LLC。结论本研究成功地构建了携带肿瘤模拟抗原OVA的慢病毒表达载体pHR-CMV-EGFP-OVA,并成功地转导LLC与DC,获得了稳定表达OVA的肺癌细胞株和携带OVA的DC,基于肿瘤抗原靶向DC的抗肿瘤策略能有效地杀伤LLC,为靶向DC的肺癌免疫治疗提供了体外实验依据。     

日本本血吸虫患者尿液中32kD循环抗原的免疫生物学特征

目的研究日本血吸虫感染者尿液中特异性的诊断抗原，以尿液为样本诊断日本血吸虫病。方法用IgG的亲和层析柱分离和纯化抗日本血吸虫循环抗原抗体并用生物素标记分离纯化的IgG抗体；Western blot检测日本血吸虫虫卵可溶性抗原和日本血吸虫感染者尿液中存在的日本血吸虫主要的循环抗原分子。结果日本血吸虫患者尿液中存在日本血吸虫的特异性循环抗原，Western blot显示其尿液中主要循环抗原分子与虫卵可溶性32kD抗原分子相同。结论日本血吸虫感染者尿液中的32kD循环抗原分子可能来自日本血吸虫虫卵可溶性抗原，可作为血吸虫感染的诊断。     

甘露糖修饰壳聚糖对巨噬细胞摄取纳米粒的影响

目的制备和评价甘露糖修饰壳聚糖包衣乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米粒,考察其对巨噬细胞毒性和对巨噬摄取功能的影响。方法采用复乳法制备负载卵清蛋白（OVA）的PLGA纳米粒,并经甘露糖修饰壳聚糖包衣处理后用激光粒度测定仪测定该纳米粒的大小与ζ电位,透射电镜观察纳米粒的外观形态,BCA法测定OVA含量后计算载药量与释放度。负载异硫氰酸荧光素（FITC）标记的OVA纳米粒与巨噬细胞（RAW 264.7）共孵育,MTT法测定细胞存活率,荧光显微镜考察摄取程度。结果 OVA-PLGA纳米粒的大小和ζ电位均随壳聚糖包衣液浓度的增加而变大（P〈0.05）,OVA载药量范围为7.2%～8.4%。壳聚糖与甘露糖修饰壳聚糖包衣FITC-OVA-PLGA纳米粒与RAW 264.7共孵育后,对细胞存活率的影响不大（P〉0.05）,但可明显促进FITC-OVA-PLGA纳米粒的巨噬细胞摄取（P〈0.05）。结论初步建立了负载模型抗原的甘露糖修饰阳离子型纳米粒系统,这为体内抗原递呈细胞靶向性研究提供了依据。     

中性粒细胞诱导适应性免疫应答过程中树突状细胞成熟活化

目的 探讨T辅助（Th）1细胞免疫应答过程中,中性粒细胞（PMN）对树突状细胞（DC）的调节作用。方法 将脂多糖（LPS）刺激的中性粒细胞（LPS-PMN）和未成熟树突状细胞（imDC）共培养,流式细胞术检测DC表面CD40和CD86,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测白细胞介素12（IL-12）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）。将与LPS—PMN共培养后DC（PMN-DC）提纯,与FITC标记的卵清蛋白（FITC-OVA）培养,检测其吞噬功能。将PMN-DC与D011．10T细胞和OVA17肽共培养,计活细胞数,胞内染色测干扰素γ（IFN-γ）、白细胞介素4（IL-4）。结果 LPS-PMN可刺激imDC CD40和CD86上调并分泌IL-12、肿瘤坏死因子（TNF）-α,且这种能力能被抗TNF-α单抗所抑制。与imDC对照,PMN—DC吞噬功能下降,能显著刺激D011．10T细胞增殖,分泌高水平IFN-γ、少量IL-4。结论 LPS-PMN具有促使imDC成熟活化,刺激其分泌细胞因子,发挥其在Th1免疫应答中抗原呈递,促进Th1分化的作用。     

The biodistribution and Kinetics of the Samarium-153 labeled avidin, streptavidin and biotin

Theextraordinaryhighaffinityofavidin(Av)andstrepavidin(SA)forbiotin(Bt)hasbeenutilizedinpretargetingtechniquefordeliveringradiolabeledbi-otinderivativessuitableforimagingandtherapytotarget-boundstreptavidin-oravidin-conjugatedmono-clonalantibodies(mAb).Preliminaryreportsusingthistechniquehavebeenavailableinbothexperimen-talandclinicaltrials,andmuchsuccesshasbeenachieved[1－3].However,questionsremainpertainingtothepharmacokineticsandbiodistributionofradiola-belledSAandAvinmice,andtherolesoft…     

DC-SIGN: binding receptors for hepatitis C virus

Objective To review the recent developments in and research into binding receptors of hepatitis C virus (HCV) and especially the role of dendritic cell-specitic adhesion receptor (DC-SIGN) in HCV. Data sources Both Chinese- and English-languge literature was searched using MEDLINE (2000-2003) and the databank of Chinese-language literature (2000-2003). Study selection Relevant articles on DC-SIGN and HCV binding receptors in recent domestic and foreign literature were selected.Data extraction Data were mainly extracted from 40 articles which are listed in the references section of this review. Results DC-SIGN, a dendritic cell-specific adhesion receptor and a type Ⅱ transmembrane mannose-binding C-type lectin, is very important in the function of dendritic cells (DC), both in mediating naive T cell interactions through ICAM-3 and as a rolling receptor that mediates the DC-specific ICAM-2-dependent migration processes. It can be used by HCV and other viral and bacterial pathogens including human immunodeficiency virus (HIV), Ebola virus, CMV and Mycobacterium tuberculosis to facilitate infection. Both DC-SIGN and DC-SIGNR can act either in cis, by concentrating virus on target cells, or in trans, by transmission of bound virus to a target cell expressing appropriate entry receptors. Recent report showed that DC-SIGN not only plays a role in entry into DC, HCV E2 interaction with DC-SIGN might also be detrimental to the interaction of DC with T cells during antigen presentation. Conclusions DC-SIGNs are high-affinity binding receptors for HCV. The clinical strategies that target DC-SIGN may be successful in restricting HCV dissemination and pathogenesis as well as directing the migration of DCs to manipulate appropriate immune responses in autoimmunity and tumorigenic situations.     

下调DC-SIGN-ManLAM结合信号恢复树突状细胞活化初始T细胞的能力

目的 探讨利用RNAi下调DC-SIGN与ManLAM结合信号对树突状细胞(dendritic cells,DCs)活化初始T细胞能力的影响.方法 利用筛选出的人DC-SIGN分子RNAi有效靶点,构建并包装产生慢病毒表达载体.实验分为:干扰组、空载体组和空白对照组.利用慢病毒表达载体下调DCs表面DC-SIGN分子水平,流式细胞仪、RT-PCR及Western blot检测各组DCs DC-SIGN分子水平变化,在LPS存在下,与ManLAM共培养18 h后,流式细胞仪检测DCs表面成熟标志物,ELISA方法检测DCs 刺激CD4+CD45RA+初始T细胞向Th1分化能力,以了解下调DC-SIGN与ManLAM结合信号对DCs活化初始T细胞的能力的影响.结果 ①包装慢病毒产生浓缩病毒悬液的滴度为1×109 TU/ml.②流式细胞仪检测干扰组DCs表面DC-SIGN分子表达水平较其余2组显著降低(F=14.19,P<0.05),RT-PCR检测干扰组DC-SIGN目的条带灰度值/内参灰度值(0.252 5±0.139 6)与空白对照组(0.572 2±0.190 9)及空载体组(0.548 7±0.119 3)相比灰度值显著下降 (F=8.142,P<0.05),Western blot检测干扰组DCs内DC-SIGN蛋白水平均显著低于空载体组和空白对照组(F=51.376,P<0.05).③干扰组DCs的成熟标志物CD86(F=15.59,P=0.004)、CD83(F=18.03,P=0.003)、HLA-DR(F=7.684,P=0.022)水平较空载体组和空白对照组明显增高.④DCs与初始T细胞共培养,干扰组分泌IFN-γ(F=18.434,P=0.003)、IL-2(F=31.08,P=0.001)水平较空载体组和空白对照组显著增高.结论 利用RNAi慢病毒载体下调DCs表面DC-SIGN水平,减弱DC-SIGN与ManLAM结合信号,能够恢复DCs的成熟受阻,最终使得DCs活化初始T细胞的能力恢复.     

DC-SIGN固有免疫调节机制的研究进展

树突状细胞(DC)是目前已知功能最强的抗原呈递细胞.它既可以激活初始免疫应答,又能够抑制免疫反应,这与其表达的多种模式识别受体有关,其中DC-SIGN是C型凝集素受体的主要成员,由于它在DC的细胞粘附、迁移、激活初始T细胞、引发免疫反应及参与病原体免疫逃逸等多个方面发挥免疫调节作用,已经成为近年来的研究热点,对其功能的研究可能会为某些疾病提供新的治疗方法,具有重要的临床意义.本文就DC-SIGN免疫调节机制的最新进展做一综述.     

金黄色葡萄球菌nuc基因特异性核酸探针的制备及应用

目的　建立核酸探针检测实验动物金黄色葡萄球菌的方法。方法　将重组质粒pGEM NUC中金黄色葡萄球菌nuc基因特异性片段酶切回收 ,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验探针 ,对细菌菌株及临床样品进行了检测。结果　核酸探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性 ,而与表皮葡萄球菌、化脓性链球菌、大肠埃希菌等其他细菌DNA呈杂交阴性 ,斑点杂交检测的灵敏度为 1pg基因组DNA。用斑点杂交试验和PCR对 32 2份SPF小鼠的临床样品进行了检测 ,检出率为 3 1% (10 /32 2 ) ,符合率为 10 0 % ,与细菌学检查的结果相一致。结论　建立的DNA探针检测金黄色葡萄球菌方法具有高度的特异性和敏感性 ,且较快速 ,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的监测。