芬戈莫德联合骨髓间充质干细胞移植脑创伤大鼠记忆功能的变化

背景：单纯骨髓间充质干细胞移植对脑损伤的修复作用并不理想,需要结合药物及生物工程材料等手段进行综合治疗。目的：观察骨髓间充质干细胞移植同时应用芬戈莫德免疫抑制剂对脑损伤大鼠记忆功能恢复的影响。方法：选取健康SD大鼠60只,采用液压颅脑损伤仪,给予253.3125-303.975 kPa峰值的液压冲击力,制成重型液压颅脑损伤模型,随机分成为脑损伤组、骨髓间充质干细胞移植组、芬戈莫德＋骨髓间充质干细胞移植组。PKH-26标记的骨髓间充质干细胞移植后21-28 d进行Morris水迷宫试验。脑损伤4周后取脑组织行PKH-26免疫荧光、苏木精-伊红染色。结果与结论：移植后4周,各组平均潜伏时间均逐渐缩短,芬戈莫德＋骨髓间充质干细胞移植组平均潜伏时间较骨髓间充质干细胞移植组缩短（P＜0.05）,较脑损伤组明显缩短（P＜0.01）。芬戈莫德＋骨髓间充质干细胞移植组穿越平台次数及目标象限游泳距离与总距离百分比均高于脑损伤组和骨髓间充质干细胞移植组（P＜0.05）。芬戈莫德＋骨髓间充质干细胞移植组 PKH-26阳性细胞明显高于脑损伤组和骨髓间充质干细胞移植组（P＜0.05）。结果可见骨髓间充质干细胞移植可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的记忆功能,联合应用芬戈莫德免疫抑制剂有协同效果。     

经静脉移植间充质干细胞在脊髓损伤鼠体内的迁移

目的:观察67Ga-Oxine标记间充质干细胞的可行性,检测经静脉移植的间充质干细胞在脊髓损伤鼠体内的迁移和分布。方法:实验于2004-01/2005-01在北京大学干细胞研究中心完成。①从人脐带血分离培养间充质干细胞,体外进行67Ga-Oxine和Hoechst33342标记。②SD大鼠40只随机分为两组,实验组(脊髓损伤大鼠20只)和对照组(正常大鼠20只)均经尾静脉注射相同标记细胞悬液。③分别于1d和1周后取材,新鲜组织(脊髓、肺、肝、脾、肾、骨髓、静脉血)称湿重后伽玛计数仪检测其放射性,计算肺、肝、脾、肾、骨髓分别与静脉血单位质量放射性计数的比值,两组比较分析;实验组损伤脊髓和对照组相同部位脊髓分别与其临近正常脊髓放射性计数的比值之间比较。相应组织做冷冻切片(包括骨髓涂片),荧光显微镜观察Hoechst33342标记细胞在各组织内的分布。结果:40只SD大鼠全部进入结果分析。①体外间充质干细胞的67Ga-Oxine标记率为82.5%,放射活性为15.26MBq/106细胞,标记48h后细胞存活率>95%。②移植1d和1周后肺、肝、脾、肾、骨髓与静脉血单位质量放射性计数的比值,实验组与对照组对比差异均无显著性(P>0.05)。实验组损伤脊髓和对照组相同部位脊髓分别与其临近正常脊髓放射性计数的比值之间比较,1d后差异无显著性(P>0.05),1周后实验组明显高于对照组(1.441±0.038,1.003±0.022,P<0.01)。③相应组织连续冷冻切片荧光显微镜观察显示移植初期Hoechst33342标记细胞主要集中于肺部,而后在肝、脾、骨髓逐渐增加可持续到1周后。移植1d后脊髓未见明显标记细胞,1周后实验组损伤脊髓部位标记细胞明显增加并相对聚集于灰质。结论:间充质干细胞可在体外应用67Ga-Oxine成功标记,为核素显像示踪移植间充质干细胞的相关研究提供了依据。经静脉移植的间充质干细胞可以迁移到损伤脊髓,为应用间充质干细胞移植治疗脊髓损伤提供了一种可能的无创性移植方法。     

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性放射性肺损伤

背景：针对放射性肺损伤,临床上除了糖皮质激素及抗生素等对症处理外,尚缺乏有效的治疗手段。近年来研究表明,骨髓间充质干细胞表现出强大的组织修复能力。目的：观察骨髓间充质干细胞对大鼠放射性肺损伤的治疗作用,并初步探讨其作用机制。方法：体外分离、培养并鉴定雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞。应用直线加速器照射60只雌性SD大鼠胸部,建立大鼠放射性肺损伤模型,随机分为骨髓间充质干细胞治疗组和生理盐水对照组。骨髓间充质干细胞治疗组经大鼠尾静脉输注骨髓间充质干细胞2×109L-1,生理盐水对照组注射等量生理盐水,分别于照射后1,2,4,6周时进行相关指标检测。结果与结论：照射后第1,2,4周时,骨髓间充质干细胞治疗组大鼠肺系数明显低于生理盐水对照组（P〈0.05）。镜下见骨髓间充质干细胞治疗组大鼠肺组织炎症渗出较少,肺泡、肺泡壁结构基本完整,纤维化程度等均明显轻于生理盐水对照组。照射2周时骨髓间充质干细胞治疗组血清转化生长因子β1、羟脯氨酸水平显著低于生理盐水对照组（P〈0.05）。照射2,4,6周时骨髓间充质干细胞治疗组肺组织超氧化物歧化酶活力显著高于生理盐水对照组（P〈0.05）,照射4,6周时骨髓间充质干细胞治疗组丙二醛含量显著低于生理盐水对照组（P〈0.05）。照射6周时骨髓间充质干细胞治疗组的肺表面活性物质B表达显著高于生理盐水对照组。PCR方法检测肺、肝脏、胰腺、肾脏等器官组织均有不同程度的Sry基因表达,尤以肺显著。结果表明骨髓间充质干细胞可以迁移到放射性损伤的肺组织,促进放射性肺损伤组织的修复,其治疗机制可能与抑制炎症反应、抗氧化、减轻肺组织纤维化等有关。     

骨髓间充质干细胞与急性皮肤放射损伤的修复

背景:皮肤放射性损伤难治愈易复发常成为临床上难以解决的问题.随着干细胞丁程与组织学工程的进展,骨髓间充质干细胞实际应用研究日益受到重视,特别是其多向分化的潜能,显示了在创伤修复领域诱人的应用前景.目的:观察骨髓间充质干细胞对皮肤局部急性放射损伤的修复作用.设计、时间及地点:随机分组设计,对比观察,于2008-06/08在苏州大学附属第二医院血液病实验室完成.材料:雄性昆明小鼠46只,体质量(25+2)g,其中40只用于建立皮肤局部Ⅲ度放射损伤模型.方法:随机选取40只小鼠以3.6%水合氯醛腹腔麻醉,以能量为4 MeV的电子线(1 Gy/min)照射小鼠臀部皮肤,面积为2.0 cm×1.5 cm,总吸收剂量为40 Gy,后将小鼠随机分为实验组和对照组,每组20只.实验组照射后即刻经尾静脉注射经CFDA SE标记的骨髓间充质干细胞注射液0.1 mL(浓度为2×1010 L-1),对照组注射等量生理盐水,剩余6只不做照射处理,仅经尾静脉注射等量骨髓间充质干细胞.主要观察指标:实验组与对照组小鼠创面损伤情况及照射后2,3周皮肤病理变化,免疫组织化学分析皮肤新生血管;观察不同时间骨髓间充质干细胞在实验组小鼠皮肤及其他组织的分布情况.结果:将骨髓间充质干细胞经尾静脉移植入实验组小鼠后,实验组皮肤创面愈合速度比对照组快4～6 d.实验组创面损伤面积较对照组小,病理表现中表皮、毛囊、皮脂腺及胶原纤维的损伤程度均较同时期的对照组小鼠轻.皮肤创面中的新生毛细血管数高于对照组.实验组骨髓间充质干细胞在皮肤及其他组织中广泛分布且数量明显高于未照射的小鼠.结论:骨髓间充质干细胞对局部皮肤放射损伤创面有明显有效的修复作用,其作用是在干细胞与创伤局部微环境相互作用下实现的.     

经静脉移植间充质干细胞在脊髓损伤鼠体内的迁移

目的：观察^67Ga-Oxine标记间充质干细胞的可行性，检测经静脉移植的间充质干细胞在脊髓损伤鼠体内的迁移和分布。方法：实验于2004—01／2005—01在北京大学干细胞研究中心完成。①从人脐带血分离培养间充质干细胞，体外进行^67Ga-Oxine和Hoechst33342标记。（2）SD大鼠40只随机分为两组，实验组（脊髓损伤大鼠20只）和对照组（正常大鼠20只）均经尾静脉注射相同标记细胞悬液。③分别于1d和1周后取材，新鲜组织（脊髓、肺、肝、脾、肾、骨髓、静脉血）称湿重后伽玛计数仪检测其放射性，计算肺、肝、脾、肾、骨髓分别与静脉血单位质量放射性计数的比值，两组比较分析；实验组损伤脊髓和对照组相同部位脊髓分别与其临近正常脊髓放射性计数的比值之间比较。相应组织做冷冻切片（包括骨髓涂片），荧光显微镜观察Hoechst33342标记细胞在各组织内的分布。结果：40只SD大鼠全部进入结果分析。①体外间充质干细胞的^67Ga-Oxine标记率为82．5％，放射活性为15．26MBq／10^6细胞，标记48h后细胞存活率〉95％。（2）移植1d和1周后肺、肝、脾、肾、骨髓与静脉血单位质量放射性计数的比值，实验组与对照组对比差异均无显著性（P〉0．05）。实验组损伤脊髓和对照组相同部位脊髓分别与其临近正常脊髓放射性计数的比值之间比较，1d后差异无显著性（P〉0．05），1周后实验组明显高于对照组（1．441&;#177;0．038，1．003&;#177;0．022，P〈0．01）。（3）相应组织连续冷冻切片荧光显微镜观察显示移植初期Hoechst33342标记细胞主要集中于肺部，而后在肝、脾、骨髓逐渐增加可持续到1周后。移植1d后脊髓未见明显标记细胞，1周后实验组损伤脊髓部位标记细胞明显增加并相对聚集于灰质。结论：间充质干细胞可在体外应用^67Ga—Oxine成功标记，为核素显像示踪移植间充质干细胞的相关研究提供了依据。经静脉移植的间充质干细胞可以迁移到损伤脊髓，为应用间充质干细胞移植治疗脊髓损伤提供了一种可能的无创性移植方法。     

骨髓间充质干细胞诱导成神经元样细胞移植治疗脊髓损伤

背景：骨髓间充质干细胞诱导成为神经元样细胞移植治疗脊髓损伤已被证实有效,但不同诱导方法之间的差别尚无报道。目的：通过对脊髓损伤模型大鼠的行为对比及生化指标的检测,观察采用不同诱导方法将骨髓间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞后移植对脊髓损伤疗效的差别。方法：取4周龄雄性Wistar大鼠骨髓分离培养骨髓间充质干细胞,对第3代骨髓间充质干细胞分别进行化学诱导和生物因子诱导后,收集备用。8周龄雄性Wistar大鼠48只,采用脊髓半横切法建立大鼠的脊髓损伤模型,随机分为4组：1周后骨髓间充质干细胞组损伤部位局部注射第3代骨髓间充质干细胞,化学诱导组局部注射化学诱导成的神经元样细胞,生物诱导组局部注射生物诱导成的神经元样细胞,DMEM培养液组局部注射细胞培养液。对48只大鼠脊髓损伤模型分别于伤后1,2,3,4,6,8,10,12周进行BBB评分,并于第12周末对损伤部位进行取材做组织切片,观察脊髓损伤的修复情况。结果与结论：模型建立后12周,骨髓间充质干细胞组、化学诱导组和生物诱导组大鼠后肢功能恢复明显优于DMEM培养液组（P〈0．05）,骨髓间充质干细胞组和化学诱导组功能恢复无明显差别（P=0．4363）,生物诱导组恢复效果好于前2组（P〈0．05）。生物诱导组大鼠运动功能持续恢复显著好于其他3组。脊髓组织切片苏木精一伊红染色显示骨髓间充质干细胞组和化学诱导组近似,脊髓胶质细胞增生,神经元样细胞崩解、空洞形成少于DMEM培养液组,生物诱导组神经损伤修复效果最佳。提示化学诱导后的骨髓间充质干细胞与未经过诱导的骨髓间充质干细胞在修复神经损伤的效果上没有明显差别：而经过生物诱导的骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞后移植治疗脊髓损伤的疗效明显优于未经诱导和化学诱导的骨髓间充质干细胞移植的疗效。     

间充质干细胞对睾丸辐射损伤的影响

目的:研究间充质干细胞(MSCs)对睾丸辐射损伤的影响,为临床上治疗放射性睾丸损伤奠定理论基础.方法:选取15只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组和治疗组.模型组和治疗组大鼠均接受直线加速器产生的高能电子线行一次性全身照射;对照组不接受照射.治疗组大鼠接受辐射24 h后尾静脉输注MSCs 3 × 106 /只;模型组和对照组大鼠尾静脉输注生理盐水1 mL;共3周.当模型组处于濒死状态时处死所有大鼠,检测各组大鼠血清中睾酮水平、血清和睾丸组织中丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用苏木精-伊红染色法 (HE染色法)制作大鼠的睾丸病理切片,观察辐射对睾丸形态学的影响.结果:模型组大鼠精神萎靡,反应迟钝,活动少,嗜睡,毛发变黄;治疗组大鼠较模型组反应灵敏.治疗组大鼠血清SOD明显高于模型组,而MDA水平低于模型组;治疗组大鼠血清睾酮含量明显高于模型组,但较正常组低.病理结果显示对照组生精小管横切面见精原细胞及不同发育阶段的精母细胞、精子细胞、精子,组成多种形态的完整生精上皮图像;模型组生精上皮变薄,生精层数减少,各级生精细胞明显减少,部分曲细精管内仅剩支持细胞和少量精原细胞,精子细胞及精子消失,显示辐射对大鼠睾丸组织损伤明显;治疗组外形较规则,各级生精细胞有序排列,初级精母细胞、精子细胞数量增多,精子发生良好,形态结构接近于对照组.结论:MSCs对睾丸的辐射损伤具有明显的修复作用,能够改善睾丸的生殖功能.     

高压氧联合骨髓间充质干细胞移植修复缺氧缺血性脑损伤

背景:单纯骨髓间充质干细胞移植对脑梗死组织的修复作用并不理想,需要结合药物及生物工程材料等手段进行综合治疗。目的:验证高压氧结合骨髓间充质干细胞移植修复大鼠缺氧缺血性脑损伤的效果。方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞。应用线栓法建立大脑中动脉阻塞大鼠模型,按随机区组法分为3组,即对照组、骨髓间充质干细胞移植组及高压氧+骨髓间充质干细胞移植组。静脉移植后24h,3d及伤后1,2周行Longa行为学评分,检测神经功能的损伤情况。移植2周后,应用RT-PCR法测定生长相关蛋白43mRNA的表达,并以BrdU免疫组化和苏木精-伊红染色行梗死处组织学检查以证实恢复程度。结果与结论:移植后1周,高压氧+骨髓间充质干细胞移植组大鼠神经功能障碍评分低于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组低于对照组(P<0.05)。2周后脑梗死周围组织生长相关蛋白43mRNA的表达高压氧+骨髓间充质干细胞移植组高于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组高于对照组(P<0.05)。BrdU免疫组化和苏木精-伊红切片中的神经元数量高压氧+骨髓间充质干细胞移植组多于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组多于对照组(P<0.05)。提示高压氧联合骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤可明显改善大鼠的神经功能,效果优于单纯骨髓间充质干细胞移植。     

高压氧联合骨髓间充质干细胞移植修复缺氧缺血性脑损伤

背景：单纯骨髓间充质干细胞移植对脑梗死组织的修复作用并不理想,需要结合药物及生物工程材料等手段进行综合治疗。目的：验证高压氧结合骨髓间充质干细胞移植修复大鼠缺氧缺血性脑损伤的效果。方法：体外培养大鼠骨髓间充质干细胞。应用线栓法建立大脑中动脉阻塞大鼠模型,按随机区组法分为3组,即对照组、骨髓间充质干细胞移植组及高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组。静脉移植后24h,3d及伤后1,2周行Longa行为学评分,检测神经功能的损伤情况。移植2周后,应用RT-PCR法测定生长相关蛋白43mRNA的表达,并以BrdU免疫组化和苏木精-伊红染色行梗死处组织学检查以证实恢复程度。结果与结论：移植后1周,高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组大鼠神经功能障碍评分低于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组低于对照组（P〈0.05）。2周后脑梗死周围组织生长相关蛋白43mRNA的表达高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组高于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组高于对照组（P〈0.05）。BrdU免疫组化和苏木精-伊红切片中的神经元数量高压氧＋骨髓间充质干细胞移植组多于骨髓间充质干细胞移植组,骨髓间充质干细胞移植组多于对照组（P〈0.05）。提示高压氧联合骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠缺氧缺血性脑损伤可明显改善大鼠的神经功能,效果优于单纯骨髓间充质干细胞移植。     

骨髓间充质干细胞向脊髓损伤区的迁徙☆

背景:骨髓间充质干细胞移植到脊髓损伤区域后,如何观察其在体内的生存和转归情况,一直是让人困扰的问题。目的:观察骨髓间充质干细胞在大鼠脊髓损伤区内的迁徙情况。方法:36只Wistar大鼠随机分为2组,实验组制作脊髓损伤模型1周后,经尾静脉移植用DAPI标记的骨髓间充质干细胞(1×109L-1)1mL,连续注射2d。对照组未行脊髓损伤,与实验组同一时间同法行骨髓间充质干细胞移植。分别于移植后5,10,15d,制作损伤脊髓冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察骨髓间充质干细胞的迁徙情况。结果与结论:实验组于移植后5d,在脊髓损伤组织血管内出现少量荧光标记的骨髓间充质干细胞,10d后有血管外弥散,15d后有广泛弥散。对照组均未见DAPI标记的骨髓间充质干细胞。结果表明骨髓间充质干细胞经大鼠尾静脉移植后,能透过血脊髓屏障向损伤脊髓组织迁徙。     

骨髓间充质干细胞防治多脏器衰竭

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)防治半相合骨髓移植治疗致死剂量照射小鼠的多脏器衰竭(MOF)的作用及机制.方法 BALB/C小鼠8Gy60Coγ射线照射后,分为MSCs组,尾静脉输注经cm-Dil膜染剂标记的CB6F1小鼠的MSCs和骨髓细胞;对照组,只输注CB6F1骨髓细胞.正常组,不照射,输注标记的MSCs细胞.观察移植后不同时间,供者MSCs在受者体内分布,MSCs组和对照组小鼠外周血中IL-2,TNF-α和IL-10血清浓度变化情况.SAS 9.0软件对数据做成组t检验.结果 移植后15 d,正常组,MSCs主要集中在骨髓和小肠.MSC组,移植后不同时间,标记的细胞分别在胸腺、骨髓、小肠中富集.MSCs上调了IL-10的血清质量浓度,下调了IL-2和TNF-α的质量浓度,两组数据有统计学差异.结论 证实MSCs可以通过下调体内的促炎因子IL-2和TNF-α,及上调抑炎因子IL-10,抑制全身炎症反应综合征的发生,及MSCs体内多组织器官分布,发挥防治MOF的作用.     

人脐血间充质干细胞促进颅脑损伤大鼠修复的研究

目的 通过建立大鼠颅脑创伤模型,探讨移植人脐血间充质干细胞(MSCs)治疗颅脑损伤的可行性.方法 参考Feeney法制作大鼠颅脑损伤模型.实验分移植组、假手术组和对照组.采用盲法在移植后第1、4、12、21天分别对各组实验大鼠进行神经功能评分(NSS).荧光免疫组化观察移植MSCs 21 d后神经细胞的特异标志分子神经元核抗原(NeuN)的分布情况.结果成功培养人脐血MSCs.假手术组NSS评分在各时间点均与对照组差异有统计学意义(P<0.01),证明颅脑损伤模型建立成功.实验组大鼠NSS评分在第4、12、21天均显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).荧光免疫组化结果显示,移植MSCs 21 d后,移植组的神经细胞明显多于对照组.结论 在成功建立大鼠颅脑损伤模型的基础上,显示通过移植人脐血MSCs,对大鼠的颅脑损伤有明显的修复促进作用.     

痰热清注射液对急性放射性肺炎大鼠血清TGF-β1水平及肺病理学改变的影响

目的:观察痰热清对Wistar大鼠急性放射性肺炎肺组织病理学改变及血清转化生长因子-β1(TGF-β1)水平的变化。方法:45只雌性Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、痰热清治疗组(治疗组),每组动物均为15只。用6MV-X线直线加速器对大鼠双肺进行单次照射25Gy。分别于照射后2、4、6周三个时间点,每组各随机取5只大鼠活体观察和取材。分别取1mL和4mL腹主动脉血于试管中用于检测血常规和TGF-β1;测定肺泡灌洗液(BALF)中性粒细胞计数;分离大鼠肺脏经宏观检查并称重后,计算肺系数;取右上肺组织切片,行HE染色进行光镜观察病理改变。结果:模型组大鼠于照射后4周出现较严重的放射性皮肤损害,治疗组大鼠皮损相对较轻。模型组大鼠肺组织于照射后2周就出现急性放射性肺炎改变,第6周时肺间质增厚明显,肺泡腔纤维素渗出。除空白组外,治疗组大鼠肺组织放射性肺炎反应最轻,而且肺系数和血常规及BALF中白细胞数相对较低(P<0.05),血清TGF-β1较模型组低(P<0.05)。结论:痰热清可抑制TGF-β1表达,减轻急性放射性肺炎的炎症反应,痰热清对急性放射性肺炎具有较好的治疗作用。     

放射损伤对小鼠早期骨髓造血基质细胞细胞周期及其DNA含量的影响

背景造血微环境的异常是造血功能障碍的重要影响因素,但关于造血基质细胞是否对辐射具有敏感性,尚无统一定论.目的观察放射损伤对小鼠早期骨髓造血基质细胞周期及NDA含量的影响,为深化放射辐射条件下导致的造血功能障碍的认识,并为早期干预环境中的有害因子提供科学依据.设计以实验动物为研究对象,完全随机分组设计,随机对照实验.单位一所军医大学高原军事医学系中心实验室、预防医学系防原医学教研室.材料本实验于2002-10/2003-04在解放军第三军医大学动物实验中心完成.实验昆明种健康雄性小白鼠60只.按随机数字法将小鼠分为放射损伤组和正常对照组各30只.方法对放射损伤组30只小鼠,用60Co-γ射线照射,距离4 m,照射率1.27 Gy/min.正常对照组30只小鼠未实施干预措施.取放射损伤后3,7 d小鼠骨髓细胞进行体外培养,分别对培养14,21 d的骨髓基质细胞进行检测.主要观察指标射线照射后骨髓基质细胞集落数量、细胞周期和DNA含量的变化.结果5.0 Gy照射后,骨髓基质细胞仍能贴壁生长,但骨髓基质细胞集落数量显著低于正常(P<0.01).照射7 d后的骨髓基质细胞集落数量虽比照射后3 d所增加,但恢复缓慢,延长培养时间,显示照射鼠的骨髓基质细胞增殖受抑.流式细胞仪检测结果表明放射损伤组照射3,7 d后G2+M期细胞(2.60±0.41,4.20±1.27)和DNA含量(58 40±0.79.61.17±1.35)显著低于正常对照组(12.60±0.75,78.57±0.83)(P<0.05～0.01).结论骨髓造血基质细胞具有较高的辐射敏感性,且持续时间较久.     

同种异体骨髓间质干细胞移植在大鼠肝内的定居能力

背景:骨髓间充质干细胞具有极强的自我复制能力和多向分化潜能,但当体外分离培养的骨髓基质干细胞移植到体内后,其分布和定居情况不明,这关系到骨髓基质干细胞是否可以作为靶细胞治疗应用于临床。目的:探索绿色荧光蛋白标记的大鼠骨髓间质干细胞(MSCs),经不同途径移植到同种异体大鼠,其定居于肝脏的能力。设计:析因设计。单位:广东省第二人民医院普外科/中山大学博士后科研基地,南方医科大学珠江医院普通外科,中山大学附属第三医院器官移植科。材料:实验于2003-01/2004-12在解放军第一军医大学基础部药理教研室完成。选取清洁级成年SD大鼠36只,随机分为5组:CCL4 门静脉移植组(6只)、门静脉移植对照组(6只)、CCL4 尾静脉移植组(6只)、尾静脉移植对照组(6只)、混合组(12只)。方法:①从大鼠骨髓中分离培养获取骨髓间充质干细胞,以绿色荧光蛋白进行标记,体外扩增后,以细针移植骨髓间充质干细胞悬液,移植量为0.5mL/100g。②CCL4 门静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3d,每天按20g/L的CCL42.5mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植。门静脉移植对照组:骨髓间充质干细胞移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从门静脉移植。CCL4 尾静脉移植组:骨髓间充质干细胞移植前3d,每天按20g/L的CCL42.5mL/kg体质量灌胃饲养,首次计量加倍,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植。尾静脉移植对照组:移植前正常饲养,标记的骨髓间充质干细胞从尾静脉移植。混合组:前4组条件下,各设2只大鼠移植未标记的骨髓间充质干细胞;另设CCL4喂养3d和正常喂养大鼠各2只,不行骨髓间充质干细胞移植。③于移植后的第3,7天,通过荧光定量PCR检测各组移植的骨髓间充质干细胞在大鼠肝脏的表达。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的分离纯化、体外扩增及表型鉴定结果。②绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞结果。③移植同源异体骨髓间充质干细胞后大鼠的生长情况观察。④各组肝脏组织中绿色荧光蛋白阳性DNA数的定量检测结果。结果:实验选取SD大鼠36只全部进入结果分析。①Percoll梯度分离液分离大鼠骨髓,所获得的细胞传代、扩增后,形态呈基本一致的梭性。细胞表面不表达CD34与CD45,而表达CD29,CD44,CD90等骨髓间充质干细胞的表面标志,是骨髓中区别于造血干细胞的另一群处于未分化状态的非定向干细胞。②骨髓间充质干细胞转染24h后即可见发绿色荧光的细胞。48～72h阳性细胞明显增多,强度增强,高倍视野下转染率达20%～30%,多为明亮的绿色荧光的细胞。作为对照的骨髓间充质干细胞中未发现发绿色荧光的细胞。③所有大鼠从不同途径移植标记或未标记的同源异体骨髓间充质干细胞后,第1天精神、食欲差,少活动;移植后第2天基本恢复正常饮食和精神,各组大鼠之间无明显差异。④除混合组外,其余各组于移植术后第3,7天,肝脏内均可检测到含绿色荧光蛋白阳性细胞。且CCL4 门静脉移植组、CCL4 尾静脉移植组肝脏组织中的绿色荧光蛋白阳性DNA数显著高于门静脉移植对照组、尾静脉移植对照组升高(P<0.05)。结论:干细胞定居于肝脏的时间与细胞数量可能与肝脏是否受损有关,与移植途径关系不密切。正常动物肝脏未受损情况下,干细胞可定居于肝脏,定植的细胞量与移植途径、移植后时间相关。     

多模态成像对间充质干细胞移植后活体示踪的应用研究

目的 探讨生成像（BLI）和MRI相结合对移植入大鼠损伤肝脏内的间充质干细胞（MSCs）的实时、无创示踪的能力及移植的MSCs对大鼠损伤肝脏的功能修复作用。方法 对急性肝损伤大鼠模型移植标记了荧光素酶和SPION的MSCs,分析大鼠的血浆转氨酶水平及肝脏病理学改变,观察MSCs对肝功能损伤的修复作用,并利用BLI和MRI观察MSCs在大鼠肝脏内积累的时间进程,最后进行大鼠肝脏组织切片的原位免疫组织化学染色。结果 MSCs移植后的第5、9、10天检测的大鼠血浆天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平较对照组显著降低（P均<0.05）。MSCs移植后第1天,大鼠肝脏区域的生物发光强度显著增强,T2^*WI标准化信号强度明显减低,于移植后第10天才逐渐恢复到移植前水平。并且随着大鼠肝脏生物发光强度的逐渐下降,荧光素酶阳性的MSCs数目亦随时间进程逐渐减少。结论 移植MSCs对大鼠损伤肝脏的功能具有良好的修复作用;且将BLI和MRI相结合可实时、无创示踪移植入大鼠损伤肝脏内的MSCs。     

Wistar大鼠的咬肌放射损伤模型

背景：构建稳定可靠的咬肌放射损伤模型对颌面部肿瘤放疗的相关研究有重要意义。目的：以放射剂量40Gy照射后Wistar大鼠咬肌构建大鼠咬肌放射损伤模型。方法：成年Wistar大鼠20只,随机分成正常对照组和放射损伤组。放射损伤组采用直线加速器照射大鼠咬肌区累积40Gy制造咬肌放射损伤。在28d后,在光镜及电镜下观察咬肌放射区病理改变,RT-PCR检测转化生长因子B1的基因表达。结果与结论：40Gy照射后28d大鼠咬肌区出现结构受损、血管密度减低（P〈0．01）等放射损伤表现,同时引起转化生长因子β1的基因表达升高（P〈0．001）等机体被动修复表现。结果证实Wistar大鼠咬肌区直线加速器40Gy照射可以作为咬肌放射损伤模型。     

MSCs移植并GS对大鼠脊髓损伤后期修复的影响

目的观察骨髓间充质干细胞（MSCs）移植联合应用促细胞生长物质（GS）对脊髓损伤后期大鼠运动功能修复的影响。方法应用全骨髓法分离培养MSCs,10 mg/L的BrdU标记细胞核。将成年雄性Wistar大鼠36只,以改良Allen打击法制备T10脊髓损伤模型,制模后2周随机分为MSCs＋GS组、MSCs组与对照组,每组12只,伤后2周各组损伤处分别注入MSCs＋GS、单纯MSCs、培养液。分别于伤后1、2、3、4、5、6周进行BBB评分;损伤后6周处死大鼠,取损伤段脊髓及其上下各1 cm组织,行苏木精-伊红染色及SABC免疫组织化学方法染色,观察损伤脊髓组织病理变化和BrdU阳性细胞及GAP-43的相对表达。结果制模后1~2周3组大鼠后肢运动功能BBB评分未见明显差异（F=0.322、0.044,P〉0.05）,3~6周MSCs＋GS组大鼠后肢运动功能BBB评分较MSCs组和对照组高（F=13.729~97.187,P〈0.05）;MSCs＋GS组大鼠脊髓损伤中心及头、尾端均可见BrdU染色阳性细胞。同时,MSCs＋GS组及MSCs组损伤节段脊髓内GAP-43的表达面积明显多于对照组,MSCs＋GS组多于MSCs组。结论 MSCs移植联合GS促进大鼠损伤脊髓结构和功能恢复的效果明显优于单纯细胞移植,两者联用具有协同效应。     

骨髓腔输注间充质干细胞对骨髓移植后造血重建和移植物抗宿主病作用的实验研究

目的比较骨髓腔内（IBM）及静脉内（IV）输注异基因间充质干细胞（MSC）对大鼠骨髓移植（BMT）模型的骨髓造血、MSC重建和移植物抗宿主病（GVHD）的影响，优化MSC输注途径及探讨MSC促进造血的机制。方法①MSC体内动力学示踪。②建立大鼠BMT模型。③实验分组：IBM组[MSC（IBM）＋骨髓有核细胞（IV）]；IV组[MSC（IV）＋骨髓有核细胞（IV）]；骨髓移植（BMT）组；单纯MSC组；照射对照组；空白对照组。④移植后观察受体存活、外周血常规结果及植入证据、骨髓MSC、CFU-Mix恢复及GVHD。结果①IBM途径输注MSC主要分布于骨髓。②MSC与骨髓共移植可以提高大鼠存活率：照射对照组、单纯MSC输注组均在预处理后2周内全部死亡；BMT组2周内存活率为70％；IV存活率为80％；IBM组存活率为100％。③MSC可促进BMT大鼠外周血象恢复：移植后第14天（＋14天）移植组白细胞计数均明显高于BMT组，IBM组又明显高于IV组，＋21天IBM组三系均恢复，IV组＋21天白细胞计数恢复，血红蛋白浓度和血小板计数至＋30天恢复正常；BMT组三系恢复延迟约2周。④MSC促进BMT受体骨髓MSC恢复和造血重建：＋21天和＋30天共移植组CFU-Mix和MSC克隆生长恢复均较BMT组快（P＜0．05）；IBM组优于IV组（P＜0．05）。⑤植入证据的检测：BMT及共移植组存活大鼠外周血均检测到F344大鼠供体抗原RT1A’阳性细胞，比例＞90％。⑥GVHD发生率：BMT组GVHD发生率为42％；共移植组无明显GVHD表现。结论IBM输注MSC优先定位于骨髓、极少丢失于非造血器官；输注MSC可促进BMT后造血恢复及提高受体生存率；MSC促进BMT受体骨髓MSC及造血干细胞恢复，缩短骨髓抑制期，并降低GVHD；IBM输注途径效果优于IV途径。