三七甲羟戊酸激酶PnMVK1基因的克隆和生物信息学分析

药用植物三七通过甲羟戊酸途径(mevalonic acid pathway)合成三萜皂苷生物合成的前体。甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase,MVK)则是甲羟戊酸合成途径中ATP依赖的限速酶之一。本研究根据课题组已获得的三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]转录组数据中的MVK1转录本序列,利用RT-PCR方法获得三七MVK1(PnMVK1)基因的全长cDNA序列;对PnMVK1蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测了该蛋白的结构与功能;利用实时荧光定量PCR方法检测了PnMVK1基因在三七的根、茎、叶、花中的表达情况。序列分析表明,克隆获得的三七PnMVK1基因长为1 164 bp,编码387个氨基酸,GenBank登录号JQ957844。生物信息学预测PnMVK1蛋白不含跨膜区,不含信号肽,具有GHMP激酶等保守结构域。PnMVK1基因在三七的根中表达丰度最高。本研究成功克隆并分析了三七MVK1的全长序列,为进一步阐明三七三萜代谢途径奠定基础。     

三萜皂苷合成生物学元件的初步开发:三七鲨烯环氧酶编码基因克隆及表达模式分析

中药合成生物学是将合成生物学思路引入中药天然产物次生代谢途径研究的一门新兴学科,其发展初期的首要任务是进行元件的开发与标准化,建立标准化的合成生物学元件库。三七(Panax notoginseng)作为人参属重要的药用植物,具有较高的药用价值,其主要活性成分是三萜皂苷。鲨烯环氧酶(squalene epoxidase)被认为是三萜皂苷与植物甾醇次生代谢途径中的关键限速酶,是三萜皂苷合成生物学研究的重要元件之一。本研究克隆获得三七中两种类型的鲨烯环氧酶编码基因(PnSE1、PnSE2),对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法检测其在4年生三七不同组织部位的表达模式,以及受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导处理后基因的表达量变化,为实现中药合成生物学元件挖掘与开发奠定基础。PnSE1基因与PnSE2基因预测编码蛋白分别包含537和545个氨基酸,序列相似性为79%,但N端(前70个氨基酸)序列不保守。PnSE1基因在根、茎、叶、花中均有表达,以花中表达丰度最高;PnSE2基因只在花中表达量显著,其余组织较弱。PnSE1基因响应MeJA诱导,诱导24 h后在叶中的表达量最大;相同诱导条件下,PnSE2基因未响应诱导,表达水平无显著变化。结果表明,PnSE1和PnSE2基因具有不同的表达模式,在三七次生代谢产物合成中起不同催化作用,推测PnSE1基因参与三萜皂苷合成途径,PnSE2基因则在甾醇合成途径中起催化作用。     

过表达HMGR催化结构域以优化酵母工程菌原人参二醇代谢途径的研究

目的 过表达3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)催化结构域提高酵母工程菌中原人参二醇的产量.方法 分别克隆酿酒酵母中编码3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶催化结构域的基因tHMG1、人参中达玛烯二醇-Ⅱ合酶基因ds和原人参二醇合酶基因cyp1、拟南芥中CYP450还原酶基因cyp-re,构建相应表达质粒,转化酿酒酵母INVSc1,并检测重组菌中原人参二醇产量.结果 重组菌INVSc1-DS-GFP/CYP1／CYP-Re和INVSc 1-DS-GFP/CYP1/CYP-Re/tHMG1中原人参二醇产量分别为3.04 mg·L-1和26.5 mg·L-1.结论 导入基因tHMG1,使原人参二醇产量提高了8.7倍,该结果为优化酵母工程菌中人参皂苷代谢途径奠定了基础.     

三七PnUGT1基因的全长cDNA克隆和生物信息学分析

本研究通过对三七的转录组高通量测序结果进行分析,采用5’-RACE和RT-PCR方法,对其中一条可能参与三萜皂苷合成的UDP-糖基转移酶基因转录本(Pn02086)进行全长克隆,预测了该基因编码蛋白的理化性质、保守结构域等,并对其进行了进化分析。通过全长克隆,得到一条开放阅读框为1 488 bp的cDNA序列,命名为PnUGT1,GenBank登录号JX018210。该基因编码495个氨基酸,蛋白分子量为55.453 kD,属于不稳定蛋白。二级结构中α-螺旋占36.16%、β-折叠占11.31%、无规卷曲占52.53%。InterProScan预测该蛋白具有7个保守结构域,包括在植物次生代谢产物中相关糖基转移酶特有的PSPG保守基序。该蛋白不具有信号肽和跨膜区,最有可能定位在细胞质中。序列比对和进化关系分析表明,该蛋白和蒺藜苜蓿三萜合成相关的UDP-糖基转移酶AAW56092的亲缘关系较近,PSPG保守区域的相似性为66%。该基因在三七叶中表达量较在花、茎和根中的表达量高。推测PnUGT1基因可能参与了三七皂苷的合成。     

用含人参提取物或人参皂苷的制剂治疗癌症、过敏性疾病等

本品由人参提取物或其皂苷[人参炔三醇，人参环氧炔醇，人参炔醇，人参皂苷Rc、Rb1，20(S)-人参皂苷Rg3，20(R)-人参皂苷Rg3，20(S)-人参皂苷Rh2，20(R)-人参皂苷Rh2，20(R)-原人参萜二醇，20(S)-原人参萜三醇，20(S)-人参皂苷Rh1和20(S)-原人参萜三醇]及载体组成。     

薏苡3-酮酯酰-CoA合酶基因克隆和生物信息学分析

3-酮酯酰-CoA合酶(3-ketoacyl-CoA synthase,KCS)基因是调控长链脂肪酸生物合成过程中的关键基因,在薏苡的生长发育过程中起着重要的调控作用。本文以薏苡(Coix lacryma-jobi L.)作为实验材料,根据转录组测序数据,从薏苡的cDNA中克隆出KCS基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,薏苡KCS基因的cDNA全长序列为1548 bp,编码515个氨基酸,生物信息学预测结果显示该基因编码蛋白质为碱性亲水不稳定蛋白,分子质量为58608.12 Da,等电点为9.20,含有2个跨膜螺旋结构域,不含信号肽剪切位点,亚细胞定位主要在质体膜。多序列比对和进化树分析结果显示薏苡KCS与玉米、水稻、节节麦、高粱和小米等单子叶植物的同种基因具有3个相同的保守位点,而且亲缘关系更近,由此证明该基因在这些同科植物间的进化是保守的。此外,基因的表达分析结果显示KCS基因在不同油脂含量的薏苡资源中有明显的差异变化。本实验对KCS基因的克隆及其结构、性质等的研究有利于深入研究该蛋白在脂肪酸合成过程中的调控机制。     

蛇足石杉鲨烯合酶HsSQS1基因克隆和序列分析

鲨烯合酶(squalene synthase,SQS)是植物萜类化合物生物合成途径的关键酶。本研究根据课题组已获得的蛇足石杉(Huperzia serrata)转录组数据中的SQS1转录本序列,设计基因全长扩增引物,利用RT-PCR方法获得蛇足石杉SQS1基因的全长cDNA序列;利用实时荧光定量PCR方法检测了HsSQS1基因在蛇足石杉根、茎、叶中的表达情况;对HsSQS1基因进行生物信息学分析,并预测HsSQS1编码蛋白的结构与功能。研究结果表明,克隆获得的蛇足石杉SQS1基因长为1 263 bp,编码420个氨基酸,命名为HsSQS1,GenBank登录号JQ004938。HsSQS1基因在蛇足石杉的根中表达丰度高于茎和叶。本研究成功克隆并分析了蛇足石杉SQS1的全长序列,为进一步阐明蛇足石杉三萜代谢途径奠定基础。     

犬尿氨酸-3-单加氧酶SibC的体外蛋白表达纯化与生化反应

目的通过体外基因合成西比罗霉素(sibiromycin)生物合成途径中推测但未验证功能的犬尿氨酸-3-单加氧酶编码基因sibC(GenBank:FJ768674.1:1380-2810),研究该犬尿氨酸-3-单加氧酶SibC的体外生化功能,为解析放线菌素D中相关结构单元的生物合成途径提供参考。方法通过生物信息学分析体外全合成基因sibC的序列并克隆至表达载体,将重组质粒pET28a-sibC转化至E.coli BL21(DE3)中进行表达,利用Ni-NTA亲和层析法纯化SibC,以犬尿氨酸(kynurenine,kyn,1)为底物进行SibC的体外酶活性测试,利用高效液相色谱(HPLC)对酶反应产物进行分析。结果PCR验证证明表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a/sibC构建成功,SibC蛋白在E.coli BL21(DE3)中获得可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析法纯化获得SibC蛋白,纯化的SibC能够催化犬尿氨酸生成3-羟基犬尿氨酸(3-hydroxykynurenine,3-HK,2)。结论体外验证了sibiromycin中SibC的功能为犬尿氨酸-3-羟化酶,为进一步研究犬尿氨酸途径及放线菌素的生物合成奠定了基础。     

西洋参PqERF1基因的克隆和生物信息学分析

乙烯响应因子(ethylene response factor,ERF)是具有PETALA2(AP2)结构域的转录因子。本研究通过西洋参(Panax quinquefolius L)的转录组高通量测序结果分析获得75条具有AP2结构域的转录因子序列,并克隆到一条开放阅读框为933对碱基的基因序列,定名为PqERF1。基因表达分析结果表明PqERF1基因受茉莉酸甲酯(MeJA)的诱导,这与人参皂苷含量的受诱导模式相同。蛋白结构预测结果表明PqERF1是定位于细胞核的具有完整保守的AP2结构域的转录因子,InterproScan蛋白功能结构域分析结果表明PqERF1很可能为发病机制相关蛋白;序列比对和进化关系分析结果也显示PqERF1与发病机制相关蛋白(烟草NtERF4)、次生代谢产物相关合成蛋白(野胡萝卜DcERF1)和花衰老相关蛋白(矮牵牛PhERF12)的相似性高,且系统进化关系较近。因此,推测PqERF1基因可能是参与西洋参次生代谢产物合成调节、抗病性和衰老相关的重要基因。     

人神经营养素-3基因克隆及原核表达

目的通过基因工程的方法克隆人神经营养素-3成熟蛋白(hNT-3)的基因,并在大肠杆菌中进行表达,为研究hNT-3的生物学作用提供材料。方法以人胎脑cDNA为模板,采用PCR方法扩增hNT-3基因,并将其克隆在pGEM-T载体上,将经过序列分析确定的hNT-3基因插入原核表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达载体pGEX-6p-1-NT-3,用SDS-PAGE法测定其在大肠杆菌中的表达。结果经序列测定分析,所克隆DNA片断与文献发表序列(GenBank,MW002527)同源性为99.7%,并获得了高效表达hNT-3蛋白的重组菌株。结论体外成功扩增hNT-3基因,并在原核细胞中高效表达。     

我国人参保健食品的发展问题与对策

人参为五加科植物人参Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根及根茎.野生者名野山参,人工栽培者称园参,播种于山林野生状态下自然生长的又称为"林下参".味甘微苦、性温.人参中含有人参皂苷(ginsenosides)、人参多糖(ginseng polysaccharides)、麦芽醇(mato1),其中人参皂苷为人参的主要成分,按皂苷元的化学结构,人参皂苷可分为3类:人参二醇类皂苷、人参三醇类皂苷、齐墩果酸苷元的人参皂苷[1].野生和人工培植2种,人参虽然功能大小不同,但都是中药中的珍品,有其特殊疗效.     

我国人参保健食品的发展问题与对策

人参为五加科植物人参Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根及根茎。野生者名野山参,人工栽培者称园参,播种于山林野生状态下自然生长的又称为“林下参”。味甘微苦、性温。人参中含有人参皂苷(ginsenosides)、人参多糖(ginseng polysac-charides)、麦芽醇(matol),其中人参皂苷为人参的主要成分,按皂苷元的化学结构,人参皂苷可分为3类:人参二醇类皂苷、人参三醇类皂苷、齐墩果酸苷元的人参皂苷[1]。野生和人工培植2种,人参虽然功能大小不同,但都是中药中的珍品,有其特殊疗效。它有大补元气,生津止渴,安神等功效。经过中医多年的临床实验,人参能…     

人参皂苷Rg3羟丙基-β-环糊精包合物的制备和表征

目的考察人参皂苷Rg3羟丙基-β-环糊精包合物的制备工艺及其表征。方法比较研磨法和水溶液搅拌法制备人参皂苷Rg3羟丙基-β-环糊精包合物,以包合率为指标,采用L9(34)正交试验设计优化包合工艺条件,采用薄层色谱法、DSC差热分析、红外光谱法、X-射线衍射法等分析手段对包合物进行表征,测定包合物的体外溶出度。结果选择水溶液搅拌法制备包合物,最佳包合工艺为人参皂苷Rg3与羟丙基-β-环糊精的质量比1∶100,搅拌时间2 h,温度25℃,其包合率为86.11%,通过表征说明包合物已经形成,包合物的溶出速率明显提高。结论人参皂苷Rg3羟丙基-β-环糊精包合物制备工艺稳定可行,溶解性显著提高。     

人参皂苷Rg3抑制肺癌细胞增殖和侵袭的作用及机制

目的 探讨人参皂苷Rg3通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路抑制肺癌细胞增殖与侵袭的机制。方法 体外培养人肺癌细胞(A549),分为对照组(正常培养),低剂量实验组(30μmol·L^-1人参皂苷Rg3),高剂量实验组(60μmol·L^-1人参皂苷Rg3)。用细胞计数试剂盒8(CCK-8)评估人参皂苷Rg3对肺癌细胞存活率的影响,用流式细胞术检测肺癌细胞经处理之后的凋亡率,用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测重要凋亡基因的表达,用Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力,同时检测细胞内的氧化应激状况,用蛋白质印迹法检测PI3K和Akt磷酸化的水平。结果 对照组和低、高剂量实验组细胞活力分别为(98.67±0.88)%、(82.67±2.40)%和(74.77±3.09)%,B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)mRNA相对表达水平分别为0.96±0.04、0.87±0.02和0.71±0.01,caspase-3 mRNA相对表达水平分别为0.96±0.04、1.22±0.07和1.36±0.04,活性氧(...     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及稳定感染HepG2单克隆细胞株的建立

目的 构建PRL -3基因RNA干扰慢病毒载体并建立被稳定感染的HepG2单克隆细胞株.方法 设计PRL -3基因特异性RNAi靶序列,合成靶序列的DNA oligo,退火形成双链DNA,与含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的pGCL- GFP线性化载体连接,产生重组慢病毒质粒LV - PRL3 - siRNA,转化感受...     

AY887902全长扩增及其生物信息学研究

目的①对表达序列标签(EST)片段BQ135230进行全长扩增并应用生物信息学推测其开放阅读框(ORF)、染色体定位和功能。方法 ①从新鲜的膀胱肿瘤组织中提取RNA,并用快速cDNA末端扩增技术(RACE)方法获得BQ135230的5′端和3′端的DNA序列,然后应用GeneTool软件合成RACE测序结果。②根据NCBI提供的ORF Finder程序、电子-聚合酶链反应(e-PCR)程序、Blastn、Blastp,同时应用ExPASY ProtParam Tool、JUFO软件并结合Primer软件对AY887902全长及其相应蛋白AAX14401进行分析。Sequin软件编辑前述结果,上报NCBI GenBank,获取基因库获得序列号(GenBank accession number)。结果通过RACE得到了BQ135230的5′和3′端,GeneTool合成一个774 bp的全长序列。该序列在GenBank获得序列号(accession number):AY887902,初步分析含有完整的ORF和poly A尾。ORF翻译的多肽序列获得蛋白ID号AAX14401;染色体定位11q13,与GSTP1基因位置完全一致。AY887902的193¹95位编码赖氨酸的碱基AAA突变为终止子TGA,从而使有210个氨基酸的GSTP1突变为只有52个氨基酸的多肽,该假定蛋白不是跨膜蛋白和信号肽。结论①获得BQ135230的全长序列AY887902,推测该序列是GSTP1基因的突变体。②AAX14401在膀胱肿瘤的表达可能是膀胱癌发生发展的新的机制,为膀胱癌Ⅱ类癌提供了分子学标志,同时它有可能成为新的治疗靶点。     

人参皂苷生物合成相关糖基转移酶研究基本策略及进展

人参、西洋参和三七等传统中药材因其广泛且良好的药理活性一直倍受关注,而人参皂苷是其主要活性成分。糖基转移酶是催化人参皂苷生物合成最后一步的关键酶。人参皂苷苷元经过糖基转移酶的修饰,产生了复杂多样的人参皂苷,从而具有广泛的药理活性。目前人们已通过合成生物学技术实现了人参皂苷苷元和稀有人参皂苷compound K的合成。人参皂苷苷元的糖基化作为人参皂苷生物合成途径的最后一步,是整个合成途径中最重要的环节之一,近年来也取得了一些研究进展。本文介绍了人参皂苷生物合成途径中相关糖基转移酶研究的基本策略,并对相关进展进行了综述,为人参皂苷生物合成途径的深入解析及通过合成生物学途径获得人参皂苷提供理论参考。     

人参皂苷Rg3对低氧条件诱导的Hep-2细胞作用机制的初步研究

目的:研究人参皂苷Rg3对低氧条件下人喉鳞癌细胞Hep-2中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法:通过体外低氧培养Hep-2人喉鳞癌细胞株,同时设立阴性对照组和阳性对照组(顺铂).人参皂苷Rg3作用24 h后,应用免疫细胞化学技术和流式细胞技术检测Hep-2细胞HIF-1α和VEGF蛋白表达的变化;应用RT-PCR技术检测HIF-1α和VEGF mRNA表达的变化.结果:在低氧条件下,Rg3组和顺铂对照组的Hep-2细胞中的HIF-1α和VEGF蛋白表达低于阴性对照组(P<0.05);Rg3组的HIF-1α和VEGF mRNA水平明显低于阴性对照组(P<0.05),顺铂组的HIF-1α和VEGFmRNA水平无明显变化.结论:低氧条件下,人参皂苷Rg3抑制Hep-2细胞中的HIF-1α和VEGF蛋白和mRNA的表达,这可能是Rg3抗肿瘤作用的机制之一.     

PI3K/Akt信号通路在小檗碱联合人参皂苷Rg3诱导鼻咽癌细胞凋亡中的调控作用

目的研究PI3K/Akt信号通路在小檗碱联合人参皂苷Rg3诱导鼻咽癌细胞凋亡中的作用。方法RTCA法检测小檗碱联合人参皂苷Rg3对鼻咽癌CNE2、6-10B细胞增殖的影响;Hoechst 33342染色法、荧光双染流式细胞仪检测药物对CNE2细胞凋亡的影响;Western blot法检测PI3K/Akt信号通路关键蛋白及凋亡相关蛋白表达的变化。结果小檗碱联合人参皂苷Rg3可抑制鼻咽癌CNE2、6-10B细胞的增殖,诱导CNE2细胞的凋亡。与单独用药组相比,联合用药组细胞的PI3K/Akt信号通路关键蛋白PI3K p110α和p-Akt的表达明显下调(P<0.05)。加入PI3K/Akt信号通路的激活剂SC79后,小檗碱联合人参皂苷Rg3抑制CNE2细胞增殖和诱导细胞凋亡的效应降低,p-Akt、Survivin、PCNA及Bcl-2表达量增加,Bax的表达下降。结论小檗碱联合人参皂苷Rg3可通过PI3K/Akt信号通路发挥抑制鼻咽癌细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。     

人参皂苷Rb_3在Caco-2单细胞层模型上的吸收特征研究

目的:研究人参皂苷Rb3在Caco-2单细胞层模型上的吸收特征。方法:人参皂苷Rb3细胞样品经高速离心后取上清液,以乙腈-1mmo·lL-1甲酸铵水溶液(34∶66)为流动相,以人参皂苷Rg2为内标,采用电喷雾离子源(ESI),在负离子条件下以多重离子反应监测模式(MRM)检测。检测离子:m/z1077.7→m/z783.4(人参皂苷Rb3),m/z783.6→m/z475.1(人参皂苷Rg2)。测定透过Caco-2单细胞层的人参皂苷Rb3浓度并计算其表观渗透系数(Papp)。结果:人参皂苷Rb3的线性范围为50～2000ng·mL-1,日间、日内精密度均小于15%。Papp从基顶侧(AP)到基底侧(BL)为3.22×10-6cm·s-1,从BL侧到AP侧为6.0×10-6cm·s-1,其P(BL-AP)/P(AP-BL)比值为1.86。结论:本方法简单、灵敏度高,可用于研究人参皂苷Rb3在Caco-2单细胞层模型上的吸收特征。