CD40配基化的肿瘤特异性树突状细胞介导Th1细胞分化的研究

目的：探讨CD40配基化的肿瘤特异性DCs在介导Th1细胞分化中的作用。方法：采用GM-CSF和IL-4联合方案体外诱导小鼠髓系DCs，并利用mCD40L-CHO和TNF-α分别刺激凋亡肿瘤细胞负载的DCs制备DCs瘤莆；^3H-TdR掺入试验检测DCs对T淋巴细胞的促增殖效应；ELISA测定细胞培养上清中IL-10、IFN-1、IL-12的含量；胞内染色和流式细胞术检测经成熟DCs活化的T细胞中CD4^＋IFN-γ^＋T和CD4^＋IL-4^＋T的比例。结果：体外刺激T细胞增殖能力在CD40配基化DCs组最高（P〈0．05），CD40配基化DCs能更有效地促进活化T细胞分泌IFN-γ和介导CD4^＋IFN-γ^＋T细胞的分化（P〈0．05）。同时，CD40配基化DCs分泌IL-12的量也明显高于TNF-α组（P〈0．05）。结论：CD40配基化的肿瘤特异性DCs体外能有效介导Th1细胞的分化。     

青少年吸毒者免疫细胞、细胞因子和生长激素的改变

目的：通过测定青少年吸食海洛因者外周血中T细胞亚群、Th1／1112细胞因子和血清中的生长激素，从分子水平探讨吸食海洛因对青少年免疫功能和生长发育的影响。方法：用微量全血直接免疫荧光染色，用流式细胞术检测外周血中T细胞亚群；流式细胞（Cytometric bead array，CBA）技术测定Th1／Th2细胞因子；化学发光法测定生长激素。结果：青少年吸食海洛因组（n=20）CD3^＋、CD3^＋＋CIM^＋、CD3^＋＋CIM^＋／CD3^＋＋CD8^＋、Th1细胞因子（IL-2，TNF-α和IFN-γ）和Th2细胞因子（IL-4，IL-10）低于健康组（n=23）（P〈0．01或0．05）；且Th1细胞因子下降程度大于Th2细胞因子（P〈0．05）；血清生长激素显著高于健康组（P〈0．01）。结论：海洛因降低青少年机体免疫功能，对细胞免疫的损伤大于体液免疫；海洛因能升高青少年血清生长激素，机制需进一步探讨。     

休克期大面积切痂对严重烧伤大鼠细胞免疫功能影响的研究

目的 观察休克期大面积切痂对严重烧伤大鼠细胞免疫功能的影响，探索改善烧伤后机体免疫功能紊乱的有效方法。方法 将大鼠分成休克期切痂组（A组）、常规切痂组（B组）和正常对照组（C组）。A、B组造成30％TBSAⅢ度烫伤，C组不烫伤。A组伤后第6h、B组伤后第4d切痂，并于伤后第1、5、9d各活杀10只，取材送检，观察其免疫指标的变化。结果 （1）A、B组与C组比较：A、B组烫伤大鼠各时相点CD3^＋T细胞变化不大（P〉0．05），但CD4^＋T细胞、CD4^＋／CD8^＋比值明显下降、CD8^＋T细胞增高（P〈0．05或P〈0．01）。NK细胞活性明显下降（P〈0．05或P〈0.01），外周血CD25^＋T淋巴细胞表达及经活化后脾脏CD25^＋T淋巴细胞表达明显下降（P〈0．05或P〈0．01）。（2）A组与B组比较：A组CD4^＋T细胞、CD4^＋／CD8^＋比值明显升高、CD8^＋T细胞降低（P〈0．05或P〈0．01），NK细胞活性明显升高（P〈0．05或P〈0．01），外周血CD25^＋T淋巴细胞表达及经活化后脾脏CD25^＋T淋巴细胞表达均明显升高（P〈0．05或P〈0．01）。结论 （1）大鼠烫伤后细胞免疫状况发生了明显变化。（2）休克期切痂可以改善烫伤大鼠T淋巴细胞亚群分布，提高NK细胞活性，增加外周血CD25^＋T淋巴细胞的表达。提高经活化后脾脏CD25^＋T淋巴细胞数。从而改善烫伤大鼠伤后机体的细胞免疫功能。     

黄芪甲苷通过PPARγ抑制Th1、Th17分化改善自身免疫性脑脊髓炎

目的探讨黄芪甲苷实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)治疗作用及其机制。方法采用髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白_(35-55)(MOG_(35-55))免疫C57BL/6小鼠构建EAE模型,随机分为对照(PBS)组与黄芪甲苷(AS-IV)组(100 mg/kg)。免疫前3天连续腹腔注射黄芪甲苷,免疫后隔天注射,持续观察小鼠发病情况。取脊髓切片HE染色观察炎性细胞浸润,LFB染色评估脊髓髓鞘脱失,流式细胞数检测CD4~+T细胞向Th1与Th17细胞分化比例。提取正常小鼠脾脏中CD4~+T细胞,在细胞因子作用下诱导分化,加入不同剂量黄芪甲苷与PPARγ抑制剂T0070907探究其对CD4~+T细胞分化的影响。采用Western blot检测PPARγ、NF-κB与NLRP3表达。结果与对照组相比,AS-IV组EAE小鼠发病率降低,发病时间延迟,且骨髓炎性细胞浸润减少,髓鞘脱失抑制,脾脏与脊髓中Th1与Th17细胞表型的含量减少。体外实验中,黄芪甲苷剂量依赖性减少了CD4~+T细胞向Th1与Th17细胞表型分化,然而,T0070907逆转了黄芪甲苷的抑制作用。与此同时,无论是在体内还是体外实验中,黄芪甲苷有效增加了PPARγ表达,减少了p-NF-κB与NLRP3表达水平。结论黄芪甲苷通过激活PPARγ,介导NF-κB信号通路抑制,减少CD4~+T细胞向Th1与Th17细胞分化,减轻小鼠EAE症状。     

CD4+效应T细胞的新成员——Th17细胞

在抗原的刺激下，初始CD4^＋T细胞被诱导分化为效应或调节T细胞，传统上CD4^＋效应T细胞因产生的细胞因子的不同被分为两个亚群：Th1细胞——主要促进细胞内感染的病原体的清除，由IL-12诱导分化，产生的主要细胞因子是IFN-γ；和Th2细胞——主要促进寄生虫感染的清除（如蠕虫），由IL-4诱导分化，主要产生IL-4、IL-5、IL-13。     

FBL3细胞在小鼠体内外诱导CD4+CD25+调节性T细胞增殖的实验研究

目的：通过小鼠体内外实验观察肿瘤细胞是否可以诱导CD4^＋CD25^＋Treg的分化增殖。方法：将小鼠的红白血病瘤细胞系FBL3接种于C57BL/6小鼠腹壁皮下,流式细胞仪检测小鼠外周血、脾脏及瘤组织CD4^＋CD25^＋Treg细胞含量,RT-PCR检测小鼠脾脏及瘤组织Foxp3 mRNA的表达;体外实验检测FBL3细胞培养上清液对小鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg细胞的作用。结果：荷瘤鼠外周血CD4^＋CD25^＋Treg比例与正常鼠比较无统计学差异（P〉0.05）,但荷瘤鼠脾脏CD4^＋CD25^＋Treg比例显著高于正常对照（P〈0.01）,荷瘤小鼠脾脏组织Foxp3 mRNA的表达量明显增加;体外实验表明FBL3培养上清液促使CD4^＋CD25^＋Treg细胞比例增高,并诱导Foxp3 mRNA表达增加。结论：FBL3细胞及其分泌的可溶性物质能诱导CD4^＋CD25^＋Treg细胞的增殖,说明是肿瘤的发生促进了CD4^＋CD25^＋Treg增高。     

三氧疗法对非霍奇金淋巴瘤患者Th1/Th2细胞亚群漂移的影响

目的：探讨三氧疗法（Ozone therapy）联合化疗对非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma，NHL）患者外周血CD4^＋T淋巴细胞Tn1／Tn2漂移的影响和临床疗效。方法：67例初治NHL患者随机分为治疗组（37例）和对照组（30例），治疗组化疗同时联合三氧（Ozone，O3）治疗，采用q自血回输（Major O3 auto-haemotherapy，MAH）和O3直肠注气疗法（Rectal O3 gas insutfiation，RI），应用两个周期。对照组单用相同化疗方案治疗。两组均化疗两周期，化疗前后采用流式细胞仪分析外周血CD4^＋T淋巴细胞内细胞因子IFN-γ、IL-4的表达，分别反应1h1、Th2细胞的数量，同时评价疗效以及肿瘤标志物LDH和β2-MG水平的变化。结果：①NHL患者Tn1细胞比例低于正常对照组（P〈0．05），Th2细胞比例与正常对照组差异无显著性（P〉0．05），Tn1／Tn2比值低于正常对照组（P〈0．05）；②治疗组Tn1细胞较治疗前升高（P〈0．05），Th2细胞与治疗前差异无显著性（P〉0．05），Tn1／Th2较治疗前升高（P〈0．05），LDH和β2-MG较治疗前降低；③对照组1h1细胞较治疗前降低（P〈0．05），Th2细胞较治疗前升高（P〈0．05），Tn1／3h2和LDH较治疗前降低（P〈0．05），β2-MG与治疗前差异无显著性（P〉0．05）；④两组治疗后比较，治疗组1h1细胞高于对照组，Th2细胞、LDH和β2-MG低于对照组，Tn1／Th2高于对照组，差异有显著性意义（P〈0．05）；⑤治疗组完全缓解率（CR）64．9％，部分缓解（PR）29．7％，有效率（CR＋PR）94．6％；对照组CR40．0％，有效率70．0％。治疗组与对照组比较，CR率及有效率明显提高，有统计学意义（P〈0．05）。结论：NHL患者外周血CD4^＋淋巴细胞向Th1细胞的分化明显减少，向Th2细胞的分化无明显变化，Tn1／Th2平衡失调并向Th2方向漂移。受化疗打击后Tn1反应向Th2漂移，抗肿瘤免疫功能进一步降低，O3可使化疗后Tn1／3h2平衡向1h1方向漂移。O3联合化疗较单纯化疗比，可以提高淋巴瘤患者的疗效。     

自身免疫性溶血性贫血患者外周血Th1／Th2、Th3／Tr1细胞的检测及意义

目的探讨自身免疫性溶血性贫血（AIHA）患者外周血Th1／Th2、Th3／Tr1细胞状态,分析它们在AIHA发病机制中的作用。方法收集AIHA患者及健康者外周抗凝静脉血,分离纯化淋巴细胞。运用FITC-CD3单抗,Cy5-CD4单抗,PE—CRTH2单抗,以CD3／CD4设门作三色流式细胞术检测Th1／Th2细胞,ELISA法检测血清中Th3细胞相关的细胞因子TGF-β1的含量和Tr1细胞的相关因子IL-10的含量。结果与正常对照相比．AIHA患者外周血CD3^＋CD4^＋CRTH2-T细胞（Th1）百分率、CD3^＋CD4^＋CRTH2^＋T细胞（Th2）百分率均下降（P〈0．05）,而CD4^＋CRTH2^-T／CD4^＋CRTH2^＋T比例（Th1／Th2）均明显升高（P〈0．01）,Th3／Tr1细胞分泌的相关细胞因子TGF-β1和IL-10的含量均降低（P〈0．05）。结论AIHA患者外周血存在细胞免疫功能失调,T细胞亚群极化状态发生改变,呈Th1型细胞优势,Th3／Tr1细胞因子含量下降,可能与AIHA的免疫学发病机制有关。     

CD4+ CD25+调节性T细胞对树突状细胞的杀伤作用

目的 探讨CD4^＋CD25^＋调节性T细胞是否对树突状细胞发挥免疫调节作用及其可能的机制。方法 用MACS（magnetic cell sorting）从BALB／c小鼠静息T细胞分离纯化CD4^＋CD25^＋T细胞，体外细胞增殖实验观察其对CD4^＋CD25^＋T细胞的免疫抑制作用；GM-CSF／IL-4培养自体小鼠骨髓来源DC，FACS（fluorescence-activated cell sorting）鉴定其表面分子特性；以CD3／CD28单克隆抗体活化CD4^＋CD25^＋调节性T细胞，FACS体外杀伤实验研究其对自体DC的调节作用，并观察穿孔素抑制剂EGTA对上述作用的影响。结果 用MACS法成功分离出CD4^＋CD25^＋T细胞，纯度可达98％，特异性表达而Faxp3基因，能明显抑制CD4^＋CD25^＋T细胞的体外增殖；骨髓来源的DC表达CDllc、MHCⅡ及少量协同刺激分子CD80、CD86；FACS体外杀伤实验证实以CD3／CD28抗体体外活化的CD4^＋CD25^＋调节性T细胞对自体DC有显著杀伤作用（P〈0．05），穿孔素抑制剂EGTA能部分抑制该杀伤效应（P〈0．05）。结论 CD4^＋CD25^＋调节性T细胞可通过杀伤作用对自体DC发挥免疫调节作用，穿孔素／颗粒酶杀伤途径可能参与其中。     

恶性肿瘤患者外周血淋巴细胞高效体外扩增的方法

探讨从恶性肿瘤患者外周血单个核细胞（PBMCs）中高效扩增淋巴细胞的方法,取3例恶性肿瘤患者的PBMCs,每例患者重复3次,在GMP实验室体系下,经淋巴细胞刺激因子体外诱导扩增淋巴细胞和观察扩增情况,应用流式细胞仪分析扩增前后总CD3^＋、CD3^＋CD4^＋、CD3^＋CD8^＋淋巴细胞、CD3^＋CD16＋56^＋（NK细胞）、CD3^＋CD16＋56^＋（NKT细胞）以及CD4^＋和CD8^＋T细胞比值的变化,分析培养前后各淋巴细胞亚群的扩增情况和重复性,同时观察淋巴细胞体外扩增培养后回输患者的生物安全性。结果表明,CD3^＋、CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD16＋56^＋细胞比例较培养前明显增加（P〈0．01）,而CD3^＋CD^＋、CD3^-CD16＋56^＋细胞比例、CD^＋和CD8^＋T细胞比值则明显的降低（P〈0．01）。CD3^＋、CD3^＋CD8^＋、CD3^＋CD16＋56^＋细胞增殖倍数的中位数分别为487．9、832．5和2540．6;而CD3^＋CD4^＋和CD3^＋CD16＋56^＋则分别为159．6和155．5。细胞体外扩增培养前后亚型和扩增倍数的重复性较差,在本研究中只有CD3^＋T细胞在体外培养前后、CD3^＋CD16＋56^＋细胞在培养后的CV值在10％以内。培养扩增后淋巴细胞细菌、真菌、支原体、外来病毒及内毒素检查后无阳性发现,所有患者细胞回输治疗后无明显的毒副反应。在本研究体系下体外诱导扩增培养肿瘤患者自体外周血NK细胞及致敏淋巴细胞效率较高,细胞毒性细胞比例增高较大,具有良好的生物安全性,为恶性肿瘤患者应用NK细胞进行过继免疫治疗提供了一种简单有效的扩增NK细胞的方法。