肺动脉内皮细胞缺氧时内皮型一氧化氮合酶基因表达的变化及蛋白激酶C亚型的作用

目的　研究蛋白激酶C(PKC)及其亚型对缺氧引起的肺动脉内皮细胞内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因表达变化的调控作用。方法　将原代培养的猪肺动脉内皮细胞置于缺氧 (5 %O2 )条件培养 2、6、12、2 4、4 8h ,用RT PCR的方法检测eNOSmRNA的含量。用蛋白质免疫印迹技术检测eNOS和 8种PKC亚型的表达水平。加入选择性PKC抑制剂BIMⅠ (1μmol/L)和G 6 983(1μmol/L) 后观察其对 5 %O2 所引起的eNOSmRNA水平变化的影响。采用瞬时转染的方法 ,通过荧光素酶报告基因实验检测eNOS基因转录起始点上游长 1 6kb启动子区域的活性。加入转录抑制剂放线菌素D后比较不同时间点常氧培养组和 5 %O2 培养组eNOSmRNA的含量。结果　 5 %O2培养 12h可使肺动脉内皮细胞eNOS表达增加 ,2 4h达高峰。缺氧 2 4h组eNOSmRNA和蛋白质水平分别是常氧组的 171%± 18% (P <0 0 1)和 16 6 %± 2 1% (P <0 0 5 )。BIMⅠ和G 6 983可抑制缺氧 2 4h引起的eNOSmRNA表达上调。缺氧时新型蛋白激酶Cε(nPKCε)发生了膜转位。报告基因实验表明 ,缺氧 2 4h肺动脉内皮细胞eNOS基因启动子活性明显增加 ,为常氧组的 (2 2 9± 0 73)倍。放线菌素D实验表明缺氧对肺动脉内皮细胞eNOSmRNA的稳定性无明显影响。结果表明 ,缺氧上调eNOSmRNA是由于基因转录增强     

低氧诱导猪肺动脉内皮细胞间质转化的鉴定及其生物学意义

目的原代培养猪肺动脉内皮细胞,探讨缺氧环境对肺动脉内皮细胞的影响,为肺部疾病提供体外研究模型。方法将猪原代肺动脉内皮细胞分为两组分别置于常氧和低氧环境中培养1、4和7 d,采用免疫荧光法、Western blot及RT-PCR检测各组细胞内皮细胞和间质细胞特异性标志蛋白及mRNA表达。结果常氧组肺动脉内皮细胞呈现典型的鹅卵石样排列,低氧培养的内皮细胞出现长梭形外观。免疫荧光法观察发现低氧培养的内皮细胞开始表达间质细胞抗原α-SMA,且随着低氧时间的延长,α-SMA表达量逐渐增多(P<0.01)。Western blot结果显示与常氧组相比,低氧组内皮细胞VE-cadhrein蛋白表达逐渐下降,α-SMA蛋白表达逐渐上升,RT-PCR结果与此一致。结论低氧促进内皮细胞向间质细胞转化,可能参与体内多种疾病的发生。     

缺氧对肺动脉内皮细胞PDGF─A、─B链及其受体α、β亚基基因表达的影响

为了研究缺氧性肺动脉高压形成的机理，采用核酸分子杂交技术观察缺氧对肺动脉内皮细胞（ＰＡＥＣ）血小板源性生长因子（ＰＤＧＦ）－Ａ链、－Ｂ链及其受体α、β亚基基因表达的影响。结果表明低氧和无氧（２．５％Ｏ２和０％Ｏ２）１．５、３ｈＰＡＥＣ的ＰＤＧＦ－Ａ链ｍＲＮＡ表达显著增加（Ｐ＜０．０１，ｖｓ常氧组），而６～４８ｈＰＤＧＦ－Ａ链ｍＲＮＡ表达水平无明显改变。低氧和无氧１．５～４８ｈ均能显著地增加ＰＡＥＣ的ＰＤＧＦ－Ｂ链ｍＲ－ＮＡ表达（Ｐ＜０．０５）。常氧条件下ＰＡＥＣ均能低水平地表达ＰＤＧＦ－α亚基受体和β亚基受体，低氧和无氧则上调此两受体ｍＲＮＡ表达水平（Ｐ＜０．０５）。由此说明缺氧不仅能使ＰＡＥＣ“旁分泌”ＰＤＧＦ参与肺动脉平滑肌细胞增殖调节，也使ＰＡＥＣ通过“自分泌”ＰＤＧＤ及上调其膜上的ＰＤＧＦ受体基因表达，参与缺氧肺动脉内皮细胞自身功能调节，从而在缺氧性肺动脉高压肺血管收缩反应增强及肺血管结构改建中发挥重要作用。     

反义寡核苷酸对正常和常压缺氧大鼠肺血流动力学的作用

筛选出针对内皮素－１（ＥＴ－１）前体基因反义硫代寡核苷酸片断（ＥＴＡＳＯＤＮ）,已证明ＥＴＡＳＯＤＮ能显著抑制培养细胞ＥＴ－１的生成（Ｐ〈０．０５）,通过实验观察侧脑室注射该片断对常氧和常压缺氧大鼠的作用,发现缺氧性肺动脉高压大鼠下丘脑ＥＴ－１含量显著高于常氧大鼠（Ｐ〈０．０５）;侧脑室内注ＥＴＡＳＯＤＮ能显著降低常氧和缺氧大鼠下丘脑ＥＴ－１水平（Ｐ〈０．０５）、降低常氧大鼠肺动脉平均压（Ｐｐａ）     

反义寡核苷酸对正常和常压缺氧大鼠肺血流动力学的作用

筛选出针对内皮素 １ （ＥＴ １） 前体基因反义硫代寡核苷酸片断（ＥＴＡＳＯＤＮ）, 已证明ＥＴＡＳＯＤＮ能显著抑制培养细胞ＥＴ １的生成（Ｐ＜ ０．０５）。通过实验观察侧脑室注射该片断对常氧和常压缺氧大鼠的作用, 发现缺氧性肺动脉高压大鼠下丘脑ＥＴ １含量显著高于常氧大鼠（Ｐ＜ ０．０５）; 侧脑室内注ＥＴＡＳＯＤＮ 能显著降低常氧和缺氧大鼠下丘脑ＥＴ １水平（Ｐ＜ ０．０５）、降低常氧大鼠肺动脉平均压（Ｐｐａ） （Ｐ＜ ０．０５） 和降低缺氧大鼠的Ｐｐａ和肺血管阻力（ＰＶＲ） （Ｐ＜ ０．０１）, 而且缺氧组大鼠下丘脑ＥＴ １ 及Ｐｐａ下降的幅度均显著大于常氧组大鼠, 尤以两组Ｐｐａ与ＰＶＲ降幅差最为显著 （Ｐ＜ ０．０１）。结果表明： ＥＴ １ 作为中枢神经介质, 参与肺血管张力的调节和缺氧性肺动脉高压的形成, ＥＴＡＳＯＤＮ颅内注射能舒张肺血管和降低肺动脉压, 有可能用于肺动脉高压的基因治疗     

牛磺酸对肺动脉内皮和肺动脉平滑肌细胞增殖的双向调节作用

目的探讨肺动脉高压发生发展的细胞机制和牛磺酸对缺氧性肺动脉高压的防治作用。方法体外培养新生雄性小牛肺动脉内皮细胞(PAECs)及肺动脉平滑肌细胞(PASMCs),用3H-TdR掺入法比较缺氧时PASMCs与PAECs的增殖情况,同时测定在培养液中加入牛磺酸后其增殖的改变。结果2.5%O2和<1%O2条件下培养6~24 h,PAECs的3H-TdR掺入量均显著低于常氧对照组(降低15%~48%,P<0.05);而PASMCs于缺氧12 h后3H-TdR掺入量均显著高于常氧对照组(增加19%~34%,P<0.05)。牛磺酸对细胞增殖的影响与浓度有关,高浓度(10~20 mmol/L)的牛磺酸抑制缺氧的内皮及平滑肌细胞的3H-TdR掺入,而低浓度的牛磺酸促进缺氧时PAECs的3H-TdR掺入(P<0.05),抑制缺氧时PASMCs的3H-TdR掺入(P<0.05)。结论缺氧抑制内皮细胞的增殖而促进平滑肌细胞的增殖,适当的牛磺酸可以对抗缺氧对PAECs和PASMs的作用,减弱缺氧对PAECs的增殖抑制作用,抑制缺氧的促PASMCs增殖作用,使之接近常氧水平。     

DDPH对缺氧内皮细胞条件培养液致肺动脉平滑肌细胞PGDF…

利用地高辛标记的ｃＤＮＡ探针，原位检测ＤＤＰＨ〔１０（２，６－二甲基苯氧基）－２－（３，４－二甲氧基苯乙胺基）丙烷酸盐〕对缺氧内皮细胞条件培养液致猪ＰＡＳＭＣ ＰＤＧＦ基因表达的影响。实验分６组：常氧、低氧无血清培养液组（Ｎ、Ｈ组），常氧、低氧内皮细胞条件培养液组（ＮＥＣＣＭ、ＨＥＣＣＭ组），ＮＥＣＣＭ＋ＤＤＰＨ、ＨＥＣＣＭ＋ＤＤＰＨ组。用自动图像分析仪检测各组细胞ＰＤＧＦ－Ａ和－Ｂ链杂交产物的平     

急性缺氧对肺动脉内皮细胞血栓素合酶基因表达及PGI2、TXA2代谢产物的影响

为进一步研究PGI2和TXA2在慢性缺氧性肺动脉高压和机体对慢性缺氧习服过程中的作用,动态观察了慢性缺氧进程中肺动脉内皮细胞(PAEC)血栓素合酶(TXS)基因表达及PGI2、TXA2代谢产物的变化.结果显示常氧培养的PAEC,急性缺氧后TXS、6-酮-PGF1αTXB2均增加,以6-酮-PGF1.增加更明显,TXA2/PGI2比值降低;慢性缺氧[PO2(5.3±0.7)kPa]培养的PAEC TXS、6-酮-PGF1α、TXB2均高于同代常氧组,复氧再急性缺氧.6酮-PGF.在第2、4代减少,第6代不变,TXS、TXB2在第4代增加,第6代减少;TXA2/PGI2在第2、4代增加,第6代减少.提示在慢性缺氧的不同阶段,由急性缺氧所致TXS、6-酮-PGF1α、TXB2及TXA2/PGI2的变化不同.     

低氧对大鼠不同节段肺动脉一氧化氮合酶mRNA表达的影响

目的探讨正常状态下肺动脉结构型一氧化氮合酶（ｃＮＯＳ）基因表达的定位及慢性低氧对不同节段肺动脉ｃＮＯＳ基因表达的影响。方法应用原位杂交技术,采用ｃＮＯＳｃＲＮＡ探针,观察低氧１周组、低氧２周组及对照组大鼠肺动脉ｃＮＯＳｍＲＮＡ的表达与分布。结果对照组大鼠与细支气管伴行的肺动脉内皮细胞ｃＮＯＳｍＲＮＡ的表达明显高于与呼吸细支气管及终末细支气管伴行的肺动脉（ｑ＝８１３,５４９;Ｐ均＜００１）。低氧１周及２周组大鼠与终末细支气管及细支气管伴行之肺动脉内皮细胞ｃＮＯＳｍＲＮＡ表达较对照组大鼠均明显降低。对照组大鼠各级肺动脉平滑肌细胞ｃＮＯＳｍＲＮＡ表达差异无显著意义（Ｆ＝２２６,Ｐ＞００５）;低氧１周及２周组大鼠与呼吸细支气管及终末细支气管伴行之肺动脉平滑肌细胞ｃＮＯＳｍＲＮＡ表达较对照组大鼠均明显降低。结论正常大鼠近端肺动脉内皮细胞ｃＮＯＳｍＲＮＡ表达强度最高;慢性缺氧主要抑制近端肺动脉内皮细胞及远端肺动脉平滑肌细胞ｃＮＯＳｍＲＮＡ的表达。     

缺氧诱导Canstatin基因表达实验研究

目的构建Canstatin基因缺氧表达增强体系，观察其在常氧与缺氧条件的基因表达量和生物学效应。方法定向克隆法构建含有缺氧反应元件（HRE）的Canstatin基因表达载体，荧光定量PCR法检测转染细胞在常氧和缺氧条件下Canstatin mRNA表达量，流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡，电镜下观察内皮细胞超微结构的改变。结果成功构建Canstatin缺氧增强表达体系。缺氧条件下该体系转染的细胞Canstatin mRNA的表达显著增强。该体系转染后人脐静脉内皮细胞出现G0-G1期阻滞并伴有大量细胞凋亡，电镜下观察到典型的凋亡改变。结论Canstatin缺氧表达体系在缺氧条件下表达量及生物学效应显著增强。     

缺氧状态下内皮源性一氧化氮合酶与大鼠肺血管结构重建的关系

目的　探讨内皮源性一氧化氮合酶 (eNOS)对缺氧大鼠肺血管结构重建的影响。方法　将大鼠随分为2组 :常氧组 (n =12 )、低氧组 (n =12 )。以光学显微镜观测 2组大鼠中型肺动脉及小型肺动脉的相对中膜厚度(RMT)。应用eNOS的抗体经免疫组织化学技术对 2组大鼠肺动脉内皮细胞进行定位及半定量分析。结果　低氧组大鼠中型肺动脉及小型肺动脉RMT均高于常氧组 (P <0 .0 1) ;2组大鼠各级肺动脉内皮细胞中均有eNOS的表达 ,常氧组较低氧组表达增强 (P <0 .0 1) ;中型肺动脉内皮细胞中eNOS的表达与相应中型肺动脉RMT之间呈负相关 (r为 - 0 .875 7,P <0 .0 1) ;小型肺动脉内皮细胞中eNOS的表达与相应小型肺动脉RMT之间呈负相关(r为 - 0 .80 4 1,P <0 .0 1)。结论　缺氧大鼠肺动脉中eNOS含量下降参与肺血管结构重建。     

一氧化氮与慢性阻塞性肺疾病

一氧化氮（ＮＯ）是由内皮细胞内的一氧化氮合成酶（ＮＯＳ）作用于Ｌ－精氨酸（Ｌ－Ａｒｇ），在分子氧参与下合成的内源性舒张因子，它能调节肺血管阻力。慢性阻塞性肺疾病（ＣＯＰＤ）患者长期缺氧，ＮＯ合成分泌减少，肺血管收缩，导致肺动脉高压，吸入ＮＯ可选择性作用于肺血管，使之扩张而降低肺动脉压力，对ＣＯＰＤ患者预后有较大意义。     

缺氧复氧对内皮细胞间隙连接通讯功能的影响初探

目的　观察缺氧复氧刺激对内皮细胞间隙连接通讯功能的影响 ,初步探讨缺氧复氧引起内皮细胞损伤的机制。方法　将人脐静脉内皮细胞株 ECV30 4分为两组 ,常氧对照组在常氧状态下培养 12～ 18小时 ;缺氧复氧组先在氧浓度低于 1%状态下培养 12～ 14小时 ,再置于常氧状态复氧 0～ 6小时。应用荧光漂白回复技术对细胞间隙连接通讯功能进行分析 ,结果用荧光回复率表示。结果　常氧对照组内皮细胞荧光回复率为 34 .4%±16 .5 %;缺氧复氧组经缺氧处理以及复氧 4小时和复氧 6小时处理后 ,其内皮细胞荧光回复率分别为 42 .7%±2 2 .7%、37.8%± 13.2 %和 43.0 %± 16 .2 %,与常氧对照组相比差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;经复氧 2小时处理后 ,内皮细胞的荧光回复率为 2 5 .0± 7.4%,与常氧对照组和经缺氧、复氧 4小时、复氧 6小时处理组相比 ,差异十分显著(P<0 .0 1)。结论　在本实验条件下 ,单独缺氧 12～ 14小时不影响内皮细胞间隙连接通讯功能 ,而复氧 2小时则能显著抑制间隙连接通讯功能。由此提示 ,间隙连接通讯功能改变参与了内皮细胞缺氧复氧损伤的早期反应。     

一氧化氮对急,慢性缺氧大鼠血流动力学及缺氧性肺血管收缩…

观察了吸入０．００４％的一氧化氮（ＮＯ）对急，慢性缺氧大鼠血流动力学，缺氧性肺血管收缩反应（ＨＰＶ），血气及高缺铁红蛋白（ＭｅｔＨｂ）的影响，结果表明：（１）常氧吸入ＮＯ时能明显降低慢性缺氧在鼠肺动脉平均压（Ｐｐａ）和肺血管阻力（ＰＶＲ），但对正常大鼠的Ｐｐａ和ＰＶＲ无明显影响；（２）慢性缺氧大鼠急性缺氧时ＨＰＶ较正常大鼠弱，吸入ＮＯ不但降低两者的急性缺氧肺动脉高压，且完全逆转两者的ＨＰＶ，（３）     

一氧化氮对急、慢性缺氧大鼠血流动力学及缺氧性肺血管收缩反应的影响

观察了吸入０．００４％的一氧化氮（ＮＯ）对急、慢性缺氧大鼠血流动力学、缺氧性肺血管收缩反应（ＨＰＶ）、血气及高铁血红蛋白（ＭｅｔＨｂ）的影响。结果表明：（１）常氧吸入ＮＯ时能明显降低慢性缺氧大鼠肺动脉平均压（Ｐｐａ）和肺血管阻力（ＰＶＲ），但对正常大鼠的Ｐｐａ和ＰＶＲ无明显影响；（２）慢性缺氧大鼠急性缺氧时ＨＰＶ较正常大鼠弱，吸入ＮＯ不但降低两者的急性缺氧肺动脉高压，且完全逆转两者的ＨＰＶ；（３）吸入ＮＯ对急、慢性缺氧大鼠体循环血流动力学、血气及ＭｅｔＨｂ含量无明显影响。提示吸入ＮＯ能选择性降低，急、慢性缺氧性肺动脉高血压，且逆转ＨＰＶ。     

一氧化氮对慢性缺氧大鼠肺动脉内皮素基因表达的影响

目的探讨一氧化氮对慢性缺氧大鼠肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞内皮素－１（ＥＴ－１）ｍＲＮＡ表达的影响，全面了解缺氧性肺动脉高压的发病机制。方法对经Ｌ－精氨酸（Ｌ－Ａｒｇ）及Ｎω－硝基－Ｌ－精氨酸甲酯（Ｌ－ＮＡＭＥ）处理的慢性缺氧大鼠（４０只）肺组织，以ＥＴ－１ｃＲＮＡ探针进行原位杂交。结果缺氧１周及缺氧２周大鼠大部分肺动脉（７５％±３％及７１％±６％）其１％～５０％的内皮细胞显示ＥＴ－１ｍＲＮＡ杂交阳性信号。Ｌ－Ａｒｇ使大鼠肺动脉内皮细胞ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达明显抑制，而Ｌ－ＮＡＭＥ使其表达明显增强。缺氧１周及缺氧２周大鼠大部分肺动脉（８５％±６％及９８％±２％）的平滑肌细胞无ＥＴ－１ｍＲＮＡ表达，但Ｌ－ＮＡＭＥ使其表达增强。结论一氧化氮对慢性缺氧大鼠肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞ＥＴ－１－ｍＲＮＡ表达均有抑制作用。     

缺氧性肺动脉高压大鼠肺动脉一氧化氮合酶的实验研究

目的：研究大鼠肺动脉中一氧化氮合酶（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ,ＮＯＳ）的含量及分布变化与慢性缺氧性肺动脉高压（ｈｙｐｏｘｉｃｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ, ＨＰＨ）发生的关系。方法：采用ｅＮＯＳ多克隆抗体,对慢性ＨＰＨ 大鼠的肺组织进行免疫组织化学分析,观察缺氧组及对照组大鼠各级肺动脉中ｅＮＯＳ含量及定位;同时应用分光光度计测定缺氧组及对照组大鼠血浆中ＮＯ的间接浓度。结果：正常大鼠肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞均含有较高的ｅＮＯＳ表达,且各级肺动脉中ｅＮＯＳ含量差异无显著性;缺氧组大鼠各级肺动脉内皮细胞及平滑肌细胞ｅＮＯＳ含量均较对照组显著减少;缺氧组大鼠血浆ＮＯ间接浓度较对照组明显降低。结论：大鼠肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞ｅＮＯＳ含量下降及血浆ＮＯ浓度下降参与慢性ＨＰＨ 的形成。     

缺氧时猪肺动脉平滑肌细胞中环氧合酶和血栓素合酶基因表达变化…

应用培养的猪肺动脉平滑肌细胞经分子杂交和放射免疫免疫检测发现；缺氧可使环事酶（ＣＯＸ）基因表达增加，缺氧６、２４、４８ｈ，环氧合酶２（ＣＯＸ－２＿和环氧酶－１（ＣＯＸ－１）ｍＲＮＡ水平分别是常氧组的、３、１、１倍和１、２、２．７倍。并在不同时间缺氧（６、２４、４８ｈ），平滑肌细胞条件培养基中６－酮－前列腺素Ｆ１α含量 于相应对照组（Ｐ〈０．０５），但缺氧对血栓纱合酶（ＴＸＳ）基因表达及血栓纱ＡＱ２     

缺氧对冠状动脉内皮及平滑肌细胞环氧合酶和血栓素A_2合成酶基因表达的影响

用放免及斑点杂交法研究缺氧对培养的冠状动脉内皮细胞（CAEC）和平滑肌细胞（CASMC）的环氧合酶（COX）和血栓素A2合成酶（TxS）基因表达的影响。实验表明在缺氧时，CAEC和CASMC中COX-1表达增加，总光密度比常氧对照组分别高3倍和1．8倍；COX-2及TXS表达无明显变化。CAEC及CASMC条件培养液中6-ketc-PGF1a含量明显升高，而TxB2与对照组无明显差异。结果提示，缺氧致冠状动脉舒张反应中可能有内皮和平滑肌细胞COX-1基因表达及PGI2生成增多的作用。     

低氧对人胚肺成纤维细胞表型与增生的影响

采用单层细胞超薄切片技术和免疫细胞化学方法， 观察常氧（Ｎ）、低氧（Ｈ）、常氧和低氧猪肺动脉内皮细胞条件培养液（ＮＥＣＣＭ 和ＨＥＣＣＭ） 等不同条件， 对肺血管外膜成纤维细胞的表型与增殖的影响。结果表明： （１） 仅ＨＥＣＣＭ 组成纤维细胞显示表型转变，胞浆内出现微肌丝、致密体、基膜等平滑肌细胞超微结构，粗面内质网明显减少；且此组细胞α－平滑肌肌动蛋白（α－ＳＭＡ） 表达较其余３ 组明显增高（Ｐ＜ ０． ０１）； （２） Ｈ 和ＨＥＣＣＭ 组增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ） 表达较Ｎ 和ＮＥＣＣＭ 组明显升高（Ｐ＜ ０． ０１）。结果提示： （１） 低氧可经肺动脉内皮细胞介导， 引起人胚肺成纤维细胞向平滑肌样细胞转化，而单纯低氧无此作用；（２） 低氧可直接或经内皮细胞介导，刺激人胚肺成纤维细胞增殖。