RNAi靶向人端粒酶逆转录酶对人肝癌细胞的生长抑制作用

目的 利用RNAi技术降低人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达,抑制其活性,研究其对人肝癌细胞的增殖和凋亡影响.方法 构建针对hTERT基因的siRNA真核表达载体pLXSN-EGFP-U6-siTERT,制备靶向hTERT的重组逆转录病毒;用重组逆转录病毒感染HepG2人肝癌细胞,以TRAP法检测端粒酶活性变化;流式细胞仅检测细胞凋亡率;MTT法检测肿瘤细胞生长抑制情况.结果 成功制备出hTERT siRNA逆转录病毒表达载体;重组病毒感染HepG2细胞24、48、72 h后端粒酶活性分别下降了23.84%、58.03%和85.01%(P＜0.05);感染后24 h细胞凋亡率29.05%;MTT实验结果显示肿瘤生长受到抑制,并存在一定量效和时效关系.结论 hTERT siRNA能特异性使hTERT基因表达抑制,端粒酶活性下降,肝癌细胞增殖受到抑制.     

人端粒酶逆转录酶基因启动子区的克隆及其真核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶基因启动子区的真核表达载体。方法：用核酸内切酶NotⅠ和KpnⅠ酶切报告基因GFP,插入pcDNA3．1( )载体,得到pcDNA3．1( )-GFP(PG)载体;用PCR方法扩增hTERT基因ATG上游的启动子序列,测序后用核酸内切酶BglⅡ和KpnⅠ酶切插入PG载体,得到pcDNA3．1( )-GFP—hTERT(PGT)载体。将PGT载体转染人食管癌EC9706细胞系,经G418筛选,荧光显微镜下观察。结果：克隆得到的启动子序列与文献相符,重组载体经酶切鉴定方向正确,含有人端粒酶逆转录酶基因启动子序列。经转染人食管癌EC9706细胞系,在荧光显微镜下观察到绿色的阳性克隆。结论：克隆的人端粒酶逆转录酶基因启动子序列在真核细胞中具有启动子活性。     

人端粒酶逆转录酶启动子调控的真核荧光表达载体的构建与表达

目的:克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子,构建真核表达载体pEGFP-C3-hTERTp.方法:PCR方法扩增出hTERTp,依次克隆至pGEM-T Easy载体和重组载体pEGFP-C3上.经酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-C3-hTERTp转染人胚肾293A细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果:成功扩增出276 bp的hTERTp,测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致.重组载体pEGFP-C3-hTERTp转染293A细胞能观察到荧光表达.结论:成功构建了hTERT启动子调控的真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-hTERTp,其能够在人胚肾293A细胞中表达.     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗的研究进展

端粒酶与肿瘤发生发展的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一．端粒的磨耗限制大多数体细胞的复制,肿瘤细胞主要通过转录上调端粒酶限制成分催化亚基端粒酶逆转录酶（hTERT）维持端粒长度．由于hTERT启动子区域已被克隆,其特点也已被鉴定,hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗成为研究的热点．我们综述了hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗最新研究进展．     

端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的克隆及在人肝癌细胞的肿瘤特异性分析

目的:克隆hTERT基因启动子并检测其在不同肝癌细胞系和正常组织细胞中的转录活性,为肝癌靶向性基因治疗提供依据.方法:采用PCR法扩增获得hTERT基因的启动子片段,将之克隆到表达虫荧光素酶基因的报告质粒上,通过测定荧光素酶报告基因的表达,检测hTERT基因启动子在肝癌细胞系和正常组织中的转录活性,并将之与甲胎蛋白(alpha-fetal-protein,AFP)基因启动子活性相比较,评价其作为肝癌基因治疗中应用的肿瘤特异性启动子的可行性.结果:成功克隆了hTERT启动子,证实hTERT启动子在肝癌细胞中具有相当强的转录活性,其活性水平为AFP启动子的14～30倍;在原代培养的成纤维细胞中其启动子未表现转录活性.结论:hTERT启动子在肝癌细胞系中具有较强的启动活性和显著的肿瘤特异性,可望开发成为新型的肝癌靶向性基因治疗工具.     

腺病毒介导的ING4基因对SMMC-7721人肝癌细胞生长的抑制效应

目的研究腺病毒介导的ING4（Ad-ING4）基因对体外SMMC-7721人肝癌细胞的生长抑制作用。方法将腺病毒空载体Ad-GFP及重组腺病毒Ad-ING4分别感染SMMC-7721细胞,采用RT-PCR法及间接免疫荧光检测ING4基因的转录和表达;荧光显微镜观察Ad-ING4对SMMC-7721细胞的细胞毒作用;MTT比色法绘制细胞生长曲线,计算生长抑制率;流式细胞术（FCM）检测Ad-ING4对细胞凋亡的影响;DAPI核荧光染色检测细胞凋亡的核形态学变化。结果 RT-PCR及间接免疫荧光显示Ad-ING4能在SMMC-7721细胞内稳定表达;Ad-ING4感染72h和96h后对细胞的生长抑制率达33.82%和50.70%;FCM检测有明显的凋亡峰,凋亡率可达46.7%;DAPI染色结果显示SMMC-7721细胞胞核呈现核深染、固缩、断裂等细胞核凋亡的形态改变。结论 Ad-ING4能够明显抑制SMMC-7721细胞的增殖,并诱导其凋亡。     

RMP基因在体内对肝癌细胞株SMMC-7721的生长抑制作用

目的探讨RMP基因在体内抑制肿瘤细胞生长的作用及其机制。方法通过体外构建真核表达载体pGPU6-Neo-RMP-484、pFLAG-CMV-4-RMP以及稳定表达细胞株shRNA-SMMC-7721、RMP-SMMC-7721,并测定RMPmRNA表达的变化,荷瘤裸鼠皮下注射各组肝癌细胞,观察移植瘤的大小及病理变化。结果成功构建了真核表达载体及稳定表达细胞系。实验组移植瘤体积、质量、病理及肿瘤相关蛋白的表达量均有明显变化。结论RMP基因在体内能有效地抑制肝癌细胞的生长,为RMP对肝癌的基因治疗/基因干预提供了有价值的靶点及体内分子机制的实验依据,为深入研究奠定了基础。。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子调控表达载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transeriptase,hTERT)基因启动子调控的荧光素酶基因表达载体。方法:用巢式PCR方法克隆hTERT序列长约1100bp的启动子片段,经测序无误后将其插入荧光素酶基因报告载体中,构建pGL3-hTERTp重组质粒,转化JM190细菌得到大量含有hTERT启动子的荧光素酶重组质粒。用双酶切和PCR法鉴定重组质粒,并送测序鉴定。结果:经过酶切和PCR法鉴定成功地构建了携带hTERT启动子的重组荧光素酶基因报告载体。结论:成功获得由hTERT启动子调控的荧光素酶基因表达载体,为研究As₂O₃对HL-60细胞端粒酶作用的分子机制打下基础。     

人端粒酶逆转录酶基因启动子介导重组Caspase-3治疗人肺腺癌的研究

目的 探讨使重组Caspase-3分子选择性诱导人肺腺癌细胞凋亡从而杀伤肿瘤细胞的可行性.方法 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因启动子调控下的重组Caspase-3分子,通过报告基因分析、Caspase-3酶活性分析、流式细胞分析、MTT方法和动物实验来研究其在肿瘤细胞中选择性诱导凋亡的作用.结果 通过Caspase-3酶活性分析,发现phTERT-Rev-Caspas-3在人肺腺癌细胞A549中能够诱导Caspase-3的活性表达,流式细胞分析和MTT方法提示其具有明显的诱导A549细胞凋亡、抑制增殖的作用;动物实验显示其能够有效地抑制肺癌裸鼠移植瘤的生长.结论 phTERT-Rev-Caspase-3是一种有效的选择性诱导人肺腺癌细胞凋亡的分子.     

尖锐湿疣组织中survivin mRNA和人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及意义

survivin是近年发现的一种凋亡抑制基因，具有抑制细胞凋亡的作用，人端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶（telomerase）活性的限制性组分。尖锐湿疣（CA）增生快，治疗后常易复发，部分病例有恶变可能，这与CA存在细胞凋亡和端粒酶活性异常可能有关。而survivin在CA中表达情况未见报道，为研究CA组织中survivin mRNA和hTERT mRNA表达情况，我们应用逆转录-PCR（RT—PCR）和原位杂交法分别检测CA组织中survivin和hTERT mRNA的表达，并探讨他们在CA发病中的可能机制。     

以二氢吡唑为先导的新型化合物靶向hTERT 抑制 SMMC-7721的增殖

目的：观察以二氢吡唑为先导的新型化合物对人肝癌细胞株 SMMC-7721增殖抑制的影响。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法筛选对 SMMC-7721细胞株增殖的抑制作用较强的小分子化合物,并用流式细胞周期实验观察化合物对细胞周期的影响,采用改良的端粒重复序列扩增程序(TRAP)实验检测端粒酶的活性, Western blot 法检测化合物对hTERT 蛋白表达的影响。结果与香豆素类衍生物相对比,新型二氢吡唑类化合物显示出较好的抑制肿瘤细胞增殖的作用;流式细胞周期检测结果显示该化合物通过 S 期阻滞影响细胞增殖;改良的 TRAP 实验结果显示该化合物对端粒酶的活性具有较明显的抑制作用;Western blot 法结果显示该化合物可以显著降低 hTERT 蛋白的表达。结论以二氢吡唑为先导的新型化合物具有抑制 SMMC-7721细胞的增殖的作用和周期阻滞作用,初步发现这主要是通过靶向 hTERT抑制端粒酶的活性实现的。     

表阿霉素对人肝癌SMMC-7721细胞bcl-2蛋白表达的影响

目的 探讨表阿霉素诱导SMMC-7721细胞凋亡的可能分子机制。方法 采用流式细胞仪间接免疫荧光法检测表阿霉素作用于人肝癌SMMC-7721细胞后bcl-2蛋白的表达。结果 随着表阿霉素的浓度增加，作用于SMMC-7721细胞时间的延长，细胞bcl-2蛋白的表达逐渐降低，SMMC-7721细胞bcl-2蛋白的表达与表阿霉素作用浓度EY时间呈负相关。结论 Bcl-2基因表达下调可能是表阿霉素诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的重要机制之一。     

视黄酸和硒对SMMC-7721肿瘤细胞的协同抑制作用

用 SMMC-7721人肝癌细胞株,经视黄酸(RA)、硒(Se)、RA+Se 的不同处理,发现1×10~(-6)mol/LRA 和2.5×10~(-(6))mol/LSe 的联合对细胞株生长有明显的抑制作用,生长率为40.1%;而单独应用 Se 或 RA,生长率分别为67.4%和65.2%.3~H-TdR 掺入试验也表明,掺入率由单独作用的 Se86.1%和 RA 87.5%下降到74%.瑞氏染色发现联合抑制组细胞有重分化的迹象。本文提示低浓度Se 和 RA 的联合对肿瘤细胞有显著的协同抑制作用。     

白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT表达及其启动子的影响

目的：观察白藜芦醇对大肠癌细胞生长增殖的影响,并从人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcfiptase,hTERT）表达及其启动子方面探讨可能的抗癌机制。方法：以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌LS-174T细胞后,收集细胞,分别采用荧光实时定量RT—PCR和蛋白质印迹法检测癌细胞hTERTmRNA和蛋白水平。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至大肠癌LS-174T细胞中后,加入不同浓度的白藜芦醇,孵育48h后,检测报告基因萤虫素酶活性。结果：白藜芦醇处理大肠癌细胞后,增殖明显受到抑制,且与浓度有关。癌细胞hTERTmRNA和蛋白水平明显下调,且呈浓度和时间依赖性。白藜芦醇处理组萤虫素酶活性下降,且呈浓度依赖性。结论：hTERT启动子活性和hTERT表达下调,可能是白藜芦醇抑制癌细胞增殖的重要机制之一。     

姜黄素对人肝癌细胞SMMC-7721生长抑制和诱导凋亡的初步研究

目的:观察姜黄素对人肝癌细胞SM MC - 7721生长抑制和诱导凋亡的影响.方法:以不同浓度(10μmol/L、30μmoL/L、90μmol/L)的姜黄素作用于体外培养的SMMC - 7721细胞48h,MTT法检测姜黄素对细胞的生长抑制率;基于AnnexinV - FITC/PI双染的流式细胞方法检测不同浓度姜黄...     

实时定量PCR检测镉对人肝癌细胞SMMC-7721中TRPC1和TRPC4 mRNA表达的影响

目的：观察氯化镉（CdCl₂）处理后人肝癌SMMC-7721细胞中TRPC1和TRPC4 mRNA表达的改变,在mRNA水平探讨镉对肝癌细胞钙通道的影响。方法：以人肝癌细胞株SMMC-7721为研究模型,细胞暴露于氯化镉终浓度为0、5、10、20、30及40 μmol·L^-1的培养液中24 h。采用SYBR荧光实时定量PCR法检测TRPC1和TRPC4 mRNA表达,相对定量采用比较CT值法。结果：随着剂量的增加,TRPC1 mRNA表达有降低的趋势,除20 μmol·L^-1组外,各组mRNA表达均高于对照组（P<0.01）;TRPC4 mRNA表达有先增高后降低的趋势,5、10和30 μmol·L^-1组mRNA表达均高于对照组（P<0.01）。2个基因均在低剂量（5和10 μmol·L^-1）组表达增加幅度较大（P<0.01）。结论：低剂量镉可显著增加人肝癌SMMC-7721细胞中TRPC1和TRPC4的表达,镉可在mRNA水平对SMMC-7721细胞钙通道产生影响。     

人胎胃成纤维细胞hTERT和端粒酶的表达

目的：检测人胎胃成纤维细胞人端粒酶逆转录酶（hT ERT ）和端粒酶表达。方法分离培养人胎胃成纤维细胞,细胞角蛋白（CK）‐18免疫染色排除上皮细胞;免疫细胞化学方法检测hTERT表达;端粒重复序列扩增法（TRAP）检测端粒酶活性,成人胃成纤维细胞作阳性对照。结果分离的人胎胃成纤维细胞CK‐18免疫染色阴性;原位监测其胞质和胞核中均可见细颗粒状免疫荧光;端粒酶延伸片断长度约为170 bp ,稍长于成人胃成纤维细胞。结论人胎胃成纤维细胞表达hT ERT和端粒酶。     

口腔颌面肉瘤组织中端粒酶逆转录酶的表达

目的：探讨口腔颌面部肉瘤组织中端粒酶逆转录酶（hTERT）的表达.方法：应用原位杂交技术检测37例口腔颌面部肉瘤和14例良性间叶肿瘤组织中hTERT mRNA的表达,并探讨了肉瘤组织中hTERT表达与瘤细胞分化、临床复发或转移的关系.结果：肉瘤组织中hTERT mRNA的阳性表达率明显高于良性肿瘤（62.2% vs 14.3%,P＜0.05）.在高、中、低分化肉瘤组织中,hTERT mRNA阳性表达率分别为41.7%、50.0%和86.7%,其中高、低分化组差异有统计学意义（P＜0.05）;hTERT mRNA表达与肉瘤复发密切相关（P＜0.05）;发生淋巴结转移和（或）远处转移肉瘤组织中hTERT mRNA的阳性表达有升高的趋势,但差异无统计学意义（P＞0.05）.结论：在口腔颌面部肉瘤发生发展过程中hTERT基因可能起作用.检测hTERT mRNA表达对于评估口腔颌面部肉瘤的临床侵袭潜能及预后可能有参考价值.     

重组人BMP-2对人肝癌SSMC-7721细胞迁移和侵袭能力的影响

目的观察重组人骨形成蛋白2(rhBMP-2)对人肝癌SMMC-7721细胞迁移和侵袭能力的影响。方法以人肝癌SMMC-7721细胞株为研究对象,取对数期生长的SMMC-7721细胞随机分为4组:rhBMP-2200、400、600μg.L-1组和对照组。rhBMP-2200、400、600μg.L-1组分别加入rhBMP-2200、400、600μg.L-1,对照组加入2mLRPMI1640培养基。分别于12、24、48h后,用细胞划痕法检测细胞体外迁移能力,Transwell小室测定法检测细胞体外侵袭能力。结果rhBMP-2200、400、600μg.L-1组12、24、48hSMMC-7721细胞迁移率与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05),且rhBMP-2200、400、600μg.L-1组各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。rhBMP-2200、400、600μg.L-1组12、24、48hSMMC-7721细胞穿膜数与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05),rhBMP-2200、400、600μg.L-1组各组间差异具有统计学意义(P<0.05)。rhBMP-2200、400...