单链抗体融合重构型人caspase-3蛋白的靶向抑瘤作用研究

目的：探讨分泌表达的抗ErbB2单链抗体与重构型人caspase3融合蛋白对ErbB2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。 方法：将重构型人caspase3基因亚克隆入pCMVe23scFvPEⅡPEⅢ相应位点，构建表达分泌型的抗ErbB2单链抗体与重构型人caspase3融合蛋白基因的真核表达载体pCMVe23scFvPEⅡrevcasp3，转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat，筛选并建系，ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达。用含有该融合蛋白的培养介质培养人宫颈癌细胞Hela、乳腺癌细胞SKBr3以及人卵巢癌细胞SKOV3等研究该蛋白对细胞生长的抑制作用；将转染建系的Jurkat细胞尾静脉注射SKBr3荷瘤裸鼠研究其对肿瘤的抑制作用，间接免疫荧光检测重构型人caspase3蛋白在瘤体的靶向分布。结果：融合蛋白基因可通过Jurkat细胞分泌表达并杀伤ErbB2抗原阳性的SKBr3和SKOV3细胞而对ErbB2抗原阴性的Hela细胞生长无明显影响，尾静脉注射该细胞可靶向抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长。结论：分泌表达的抗ErbB2单链抗体与重构型人caspase3融合蛋白靶向诱导ErbB2抗原阳性肿瘤细胞死亡。     

caspase-6基因诱导成骨肉瘤细胞凋亡

目的：探讨caspase6对成骨肉瘤细胞株的凋亡诱导作用。方法：应用RTPCR方法检测成骨肉瘤细胞株SOSP9607中caspase6基因的表达水平。以腺病毒adv5作载体，构建含caspase6基因的转基因载体，用脂质体包裹法转染SOSP9607细胞株， 用RTPCR方法检测转染后SOSP9607细胞中caspase6基因的表达。用MTT法检测转染caspase6对SOSP9607细胞株生长的影响。结果：成骨肉瘤细胞株SOSP9607中未检出caspase6表达。RTPCR法证实转染caspase6后SOSP9607中caspase6表达显著增强，MTT检测显示对SOSP9607细胞的生长有抑制作用，形态学观察及DNA电泳证实转染后的细胞株存在细胞凋亡特征。结论：caspase6对成骨肉瘤细胞的生长有抑制作用，并可诱导成骨肉瘤细胞凋亡。     

苦参碱诱导胶质瘤C6细胞凋亡及其可能的基因机制

摘 要 目的: 探讨苦参碱诱导C6胶质瘤细胞凋亡的作用特点和可能的基因作用机制。 方法：MTT法测定不同浓度苦参碱对C6细胞增殖的抑制率，求出IC50值；倒置显微镜及透射电镜观察苦参碱诱导C6细胞凋亡的形态学改变；Annexin/FITC染色流式细胞术检测不同浓度苦参碱诱导C6细胞的凋亡率；实时定量PCR芯片（Realtime PCR Array）检测苦参碱作用后C6细胞凋亡相关基因的差异表达；免疫细胞化学及Western blotting方法检测苦参碱对C6细胞caspase3表达的影响。结果：苦参碱对C6细胞增殖的抑制率随着药物剂量的增加（0.1~1.0 mg/ml）而增加（P<005），其IC50为0.715 mg/ml。倒置显微镜观察显示苦参碱可诱导胶质瘤细胞出现凋亡改变，透射电镜观察显示苦参碱诱导胶质瘤细胞出现凋亡的超微形态改变，流式细胞术检测显示胶质瘤细胞的凋亡率随着药物剂量的增加（0.2~1.0 mg/ml）而增大[(3.56±0.73)%~(27.55±1.92)%](P<0.05)。胶质瘤细胞经苦参碱作用后出现显著表达差异基因共68个，其中57个基因表达明显上调、11个基因表达明显下调，其中有22个基因与诱导凋亡的死亡受体相关，15个基因与线粒体途径有关；ICC及Western blotting检测都显示苦参碱可诱导C6胶质瘤细胞caspase3表达的上调(P<0.05)。 结论：苦参碱能诱导C6胶质瘤细胞的凋亡，其机制与死亡受体途径和线粒体途径的众多基因有关。     

沉默survivin表达对甲状腺癌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的探讨沉默survivin表达对甲状腺癌细胞凋亡的影响及其可能的作用机制。方法采用免疫印迹法(Western blot)检测存活蛋白(survivin)在甲状腺癌组织(n=98)、癌旁组织(n=98)及细胞SW579中的表达;将survivin siRNA和non-target siRNA转染SW579细胞,分别设为干扰组和阴性组,以不做任何处理的细胞作为对照组。转染48 h后,Western blot检测survivin、cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果甲状腺癌组织和细胞中survivin蛋白相对表达量均明显高于癌旁组织和正常甲状腺细胞,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。对照组与阴性组细胞中survivin相对表达量比较,差异无统计学意义(P﹥0.05);干扰组细胞中survivin相对表达量明显低于对照组,差异有统计学意义(P﹤0.01)。对照组与阴性组细胞凋亡率比较,差异无统计学意义(P﹥0.05);干扰组细胞凋亡率明显高于对照组,差异有统计学意义(P﹤0.01)。干扰组细胞中cleaved caspase 3蛋白相对表达量明显高于对照组,Bcl-2蛋白相对表达量明显低于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.01);阴性组和对照组cleaved caspase 3和Bcl-2蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(P﹥0.05)。结论 survivin在甲状腺癌组织和细胞中呈高表达,沉默其表达可诱导甲状腺癌细胞凋亡,其作用机制可能与上调cleaved caspase 3和下调Bcl-2蛋白的表达有关。     

食管癌survivin、caspase-3表达与细胞凋亡的关系

目的探讨survivinmRNA、caspase-3蛋白在食管鳞癌中的表达及其与细胞凋亡的关系。方法分别采用RT-PCR和免疫组化技术检测38例食管鳞癌及其对应的正常组织中survivinmRNA和caspase-3蛋白的表达,运用TUNEL方法检测细胞凋亡。结果73.68%食管鳞癌组织呈survivinmRNA阳性表达,显著高于正常组织,并与食管鳞癌的分化程度、临床分期有关,与年龄、性别、淋巴结转移无关;caspase-3蛋白在食管鳞癌和正常组织中的阳性表达率分别为26.32%和89.47%,差异有显著性,并与食管鳞癌的分化程度有关,与年龄、性别、淋巴结转移和临床分期无关;在食管鳞癌组织中,survivinmRNA和Caspase-3蛋白表达呈负相关;survivinmRNA阳性的食管鳞癌组中细胞凋亡指数明显低于survivinmRNA阴性组,(P<0.01),caspase-3蛋白阳性的食管鳞癌组中平均细胞凋亡指数明显高于caspase-3蛋白阴性组(P<0.01)。结论survivin、caspase-3参与了食管鳞癌的发生、发展,可以作为食管鳞癌预后的指标,survivin通过抑制caspase-3的活性而发挥其抑制细胞凋亡的作用是其主要的分子机制。     

双环铂对人卵巢癌细胞A2780的凋亡诱导作用

[目的]探讨双环铂对人卵巢癌细胞A2780的凋亡诱导作用并初步探索其凋亡机制。[方法]MTT法观察双环铂对A2780细胞增殖的抑制作用,荧光显微镜观察细胞形态学变化．多参数流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡率,并测定caspase-3的活性变化及easpase抑制剂对细胞存活率的影响。[结果]双环铂可抑制A2780细胞的增殖,IC50 332．9±26．31μmol／L。双环铂剂量为1×IC50 2×IC50、4×IC50时,诱导A2780细胞凋亡率分别为18．5％±5．4％、39．7％±6．0％和63．7％±3．4％,呈明显的剂量依赖性。经双环铂作用后漂浮细胞呈现典型凋亡细胞形态学改变。casDase-3活性随着细胞凋亡率增加而增加,泛caspase抑制剂z-VADfmk部分抑制细胞死亡。[结论]双环铂可体外诱导A2780细胞凋亡,其凋亡途径存在caspase依赖性及可能存在非caspase依赖性途径。     

茶多酚诱导鼻咽癌细胞caspase-3活化

目的：探讨茶多酚能否诱导鼻咽癌细胞系ＣＮＥ１－ＬＭＰ１凋亡及凋亡发生的分子机制。方法：用不同浓度的茶多酚处理ＣＮＥ１－ＬＭＰ１细胞,分别用荧光显微镜、ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳、ＭＴＴ和流式细胞仪等方法,观察细胞生化和形态学改变;同时,确定茶多酚诱导细胞凋亡过程中ｃａｓｐａｓｅ－３活性的动力学变化。结果：茶多酚处理后,荧光显微镜下可见ＣＮＥ１－ＬＭＰ１细胞在形态学上出现细胞核固缩、核碎裂、凋亡小体等凋亡细胞的形态学改变;琼脂糖凝胶电泳ＤＮＡ呈典型的“梯状”条带;ＭＴＴ测定发现茶多酚处理后细胞生长受到不同程度的抑制。同时,ＣＮＥ－ＬＭＰ１细胞在凋亡过程中ｃａｓｐａｓｅ－３活性的升高,呈明显的时效关系。结论：茶多酚能诱导ＣＮＥ１－ＬＭＰ１细胞凋亡,可能通过ｃａｓｐａｓｅ－３的活化诱导细胞凋亡。     

康莱特注射液诱导肝癌细胞凋亡及其对凋亡蛋白procaspase-3和caspase-9表达的影响

目的:探讨康莱特注射液(Kanglaite)对人肝癌BEL-7404细胞的增殖抑制作用、凋亡诱导作用以及对凋亡蛋白procaspase-3和caspase-9表达的影响.方法:采用MTT法检测康莱特注射液和阳性对照顺铂(cisplatin ,DDP)对BEL-7404细胞的增殖抑制作用,Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核的情况,FCM检测细胞凋亡率,Western印迹法检测凋亡蛋白procaspase-3和caspase-9的表达.结果:MTT结果显示,经不同体积浓度康莱特注射液(10、20、40、80及160 μL/mL)作用BEL-7404细胞后,80 μL/mL康莱特注射液作用48 h时对肝癌BEL-7404细胞有明显的抑制增殖作用;Hoechst 33258染色可见细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变;FCM法检测结果提示,空白对照组、DDP 10 μg/mL组和康莱特注射液80 μL/mL组的凋亡率分别为(1.23±0.40)%、(32.53±0.65)%和(3.13±0.32)% (P＜0.01);Western印迹法检测结果提示,康莱特注射液及DDP作用48 h后 procaspase-3蛋白的表达量明显降低 (P＜0.01),caspase-9蛋白的表达量显著升高(P＜0.01).结论:康莱特注射液可抑制肝癌BEL-7404细胞增殖并诱导其凋亡,其作用机制可能与凋亡相关蛋白procaspase-3表达下调及caspase-9表达上调有关.     

mda-7/IL-24对裸鼠肝癌移植瘤的生长抑制和促凋亡作用

目的:探讨mda7/IL24对裸鼠肝癌细胞移植瘤的生长抑制和促凋亡作用及其相关机制。方法：构建携带mda7基因的重组腺病毒载体Admda7。以HepG2细胞皮下接种建立裸鼠肝癌移植瘤模型,采用瘤内单点注射的方法分别给予AdGFP、Admda7和ALLN（毒胡萝卜素,NAcLLnorleucinal）+Admda7,观察瘤质量和瘤体积的变化,通过免疫组化和TUNEL法检测肿瘤组织内凋亡相关蛋白caspase3活化、细胞增殖相关抗原ki67和微血管密度、细胞凋亡率,并通过Western blotting检测caspase12、caspase3和Bax的表达。结果： Ad.mda7治疗组和Ad.GFP对照组肿瘤体积分别为（312.6±30.2）mm3和（520.6±30.0）mm3（P<0.01）,两组的肿瘤质量分别为（0.321±0.031）g和（0.534±0.030）g（P<001）;Ad.mda7治疗后瘤细胞的凋亡率显著高于对照组（P<0.01）;Ad.mda7可抑制肝癌组织ki67表达、微血管密度和促进caspase3的表达。 经 ALLN 处理的裸鼠,明显抑制Ad.mda7对肝癌细胞的致凋亡作用（P<0.05）,并且下调Ad.mda7诱导的caspase12、caspase3和Bax的表达。结论： Ad.mda7可显著抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长和新生血管的形成,并通过内质网应激通路显著诱导肿瘤细胞的凋亡。     

高表达GRIM-19诱导结肠癌SW480细胞凋亡

目的：研究干扰素/维甲酸诱导死亡基因（retinoidinterferoninduced mortality,GRIM19）对结肠癌SW480细胞凋亡的影响。方法：构建GRIM19真核表达载体（pCMVFlagGRIM19）,转染入SW480细胞中,Western blotting检测GRIM19及凋亡相关蛋白Balxl的表达,采用AnnexinV/PI和线粒体膜电位JC-1染色检测SW480细胞的凋亡。结果：成功构建pCMVFlagGRIM19真核表达载体。pCMV-Flag-GRIM-19质粒转染SW480细胞后,GRIM19的表达上调,凋亡抑制蛋白Bclxl的表达则下调。转染空质粒pCMVFlag组SW480细胞凋亡率为（7.7±1.39）%,转染pCMV-Flag-GRIM-19质粒后SW480细胞凋亡率为（15.0±2.52）%（P<0.05）。线粒体膜电位检测显示转染空质粒pCMVFlag组SW480细胞膜电位降低细胞为（7.5±2.09）%,而转染pCMVFlagGRIM19后细胞线粒体膜电位降低细胞为（17.5±3.07）%（P<0.05）。结论：GRIM-19体外转染可有效诱导结肠癌SW480细胞凋亡。     

Irofulven Induces Apoptosis in Breast Cancer Cells Regardless of Caspase-3 Status*

Caspase-3 deficiency can limit the efficiency of pro-apoptotic anticancer treatments. Irofulven (hydroxymethylacylfulvene, HMAF, MGI 114, NSC 683863) is an antitumor drug, currently in a Phase III and multiple Phase II trials, which can differentiate between tumor and normal cells in apoptosis induction. This study investigated whether apoptosis induced by irofulven requires caspase-3. Irofulven action was compared in breast cancer cells differing in caspase-3 status: deficient MCF-7 cells and proficient MDA-MB-231 cells and in normal human mammary epithelial cells, HMEC. Irofulven induces significant, concentration and time-dependent apoptotic DNA fragmentation in breast cancer cell lines, regardless of caspase-3 status. After 12, 24 and 48h incubation at 1M irofulven ( 3×GI₅₀), fragmented DNA comprised 3.7, 14.1 and 34.6% and 8.4, 12.6 and 20.3% of total DNA in MCF-7 and MDA-MB-231 cells, respectively. Cell viability (trypan blue exclusion) remained largely unaffected during the first 24h but decreased markedly after 48h, indicating secondary necrosis. Net losses in cell numbers were apparent at 48h. Normal HMEC cells were refractory to 1M drug with only 3–9% fragmented DNA after 12–48h, although apoptosis was observed at drug levels >3M. The broad-spectrum caspase inhibitor Z-VAD-fmk inhibited irofulven-induced apoptosis of all cell lines at 20M with nearly complete abrogation of apoptosis at 100M. Irofulven treatment resulted in marginal caspase-3 processing in MDA-MB-231 and HMEC cells. These results indicate that whereas the caspase cascade mediates irofulven- induced apoptosis, caspase-3 is dispensable (supported by NIH CA70091 and CA78706).     

丹酚酸乙对乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制及诱导凋亡研究

[目的]观察丹酚酸乙对乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制及诱导凋亡作用。[方法]MTT法观察丹酚酸乙对体外培养MCF-7细胞的增殖抑制作用;Hoechst33258荧光染色法观察细胞凋亡的形态学变化;流式细胞仪检测丹酚酸乙作用于MCF-7细胞48h后细胞凋亡率和细胞周期的变化;Western Blot检测caspase-3蛋白表达的变化。[结果]丹酚酸乙能明显抑制MCF-7细胞的生长,呈剂量和时间依赖性;荧光染色结果显示,丹酚酸乙与MCF-7细胞共培养24、48和72h后,细胞呈现明显的核固缩、碎裂以及凋亡小体形成等细胞凋亡现象;流式细胞仪检测结果显示,不同浓度的丹酚酸乙处理MCF-7细胞48h后,细胞凋亡率和S期细胞的比例逐渐升高;Western Blot显示,随着丹酚酸乙浓度的增加,MCF-7细胞caspase-3蛋白表达水平逐渐升高。[结论]丹酚酸乙对MCF-7细胞具有明显的生长抑制和促凋亡作用,这种作用可能与上调caspase-3表达以及阻滞细胞于S期有关。     

紫草素诱导人绒毛膜癌JEG-3细胞凋亡机制的研究

背景与目的：研究紫草素（shikonin）诱导人绒毛膜癌JEG-3细胞的凋亡作用及其机制。材料与方法：采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定紫草素对JEG-3细胞生长的抑制作用;Hoechst33258荧光染色和流式细胞术（FCM）检测紫草素处理JEG-3细胞后发生凋亡的形态变化;Western blot检测凋亡相关蛋白的活化。结果：MTT分析表明,紫草素抑制JEG-3细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性（P〈0．01）,其半数有效抑制浓度（IC50）为（6．3&#177;0．6）μmol／L;紫草素处理JEG-3细胞后,Hoechst33258染色出现典型的凋亡特征,且FCM检测出现明显的亚二倍体峰,Annexin V／P1双染出现早期凋亡细胞;Western blot检测结果显示经紫草素处理后JEG-3细胞的Caspase-3、ERK、JNK蛋白均被激活,而PARP蛋白被剪切成cleaved PARP（85KD）。结论：紫草素可能经Caspase-3途径诱导人绒毛膜癌细胞JEG-3凋亡,并且MAPK通路的活化、抑制对细胞的凋亡有一定的影响。     

肝癌细胞自噬性凋亡过程中caspase-3基因的克隆与鉴定

目的从长春新碱诱导发生自噬性凋亡的肝癌细胞系HepG2中克隆caspase-3基因。方法提取细胞总RNA,采用RT-PCR技术扩增目的片段,构建重组克隆载体,测序鉴定及分析。结果经RT-PCR获得了预期的扩增产物即caspase-3基因625bp的核苷酸片段,其测序结果与文献报道一致。结论初步证明该caspase-3基因片段参与了长春新碱诱导的HepG2细胞自噬性凋亡过程。     

Caspase-3在脐血CD34+造血干/祖细胞中的表达及其意义

目的 为了探讨脐血CD34~+干/祖细胞在不同细胞因子支持下体外扩增过程中Caspase-3表达及意义,我们采用了RT-PCR、Western blot和流式细胞仪技术测定了脐血CD34~+细胞在体外扩增过程中的生物学特性及Caspase-3的表达。检测结果显示,Caspase-3mRNA在新鲜分离的脐血CD34~+细胞中低水平表达,在细胞因子支持下体外培养3天,扩增的CD34~+细胞中Caspase-3mRNA和蛋白质水平表达上调,但在这两种细胞中仅能检测到分子量为32KDa的非活性酶原形式的Caspase-3;随着体外培养时间的延长,在IL-3,IL-6和GM-CSF组合条件下,Caspase-3被激活,可检测到分子量力20KDa的裂解片段。本研究表明,虽然造血干细胞的凋亡是个复杂的过程,但在脐血CD34~+干/祖细胞体外扩增过程中,Caspase-3参与了凋亡事件并发挥着重要的作用。     

全反式维甲酸诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的初步研究

[目的]研究全反式维甲酸（ATRA）体外诱导人肝癌细胞株HepG2的凋亡及其作用机制。[方法]ATRA处理HepG2细胞。MTT法分析细胞增殖反应;Hoechst染色法检测细胞凋亡情况;Western blot检测细胞中caspase-9、caspase-3和NF-κB蛋白表达情况。[结果]A-TRA可抑制HepG2细胞增殖并诱导细胞凋亡,可上调细胞中caspase-9、caspase-3表达水平（P〈0.05）。[结论]ATRA可抑制HepG2细胞增殖并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与cas-pase-9、caspase-3表达上调有关。     

Caspase-3在X线诱导的鼻咽癌细胞凋亡中的调控作用

目的探讨X线诱导后鼻咽癌CNE-2细胞凋亡存在形式以及Caspase-3酶活性、mRNA、蛋白的表达及相互之间的关系,拟阐明Caspase-3在X线诱导的鼻咽癌细胞凋亡中的调控及意义。方法用不同剂量X线照射鼻咽癌CNE-2细胞,于不同时间检测细胞形态学及早期细胞凋亡率变化,分别用比色法、Western blot 、RT-PCR检测Caspase-3酶活性、蛋白含量、mRNA,同时设立酶活性抑制剂AC-DEVD-CHO对照组,观察Caspase-3酶活性被阻抑后细胞凋亡及Caspase-3表达的变化。结果（1）X线照射后鼻咽癌CNE-2细胞呈典型的凋亡特征,且早期凋亡率与射线剂量、诱导时间成正比;（2） CNE-2凋亡细胞中Caspase-3酶活性明显增高,用AC-DEVD-CHO抑制Caspase-3活性后细胞的凋亡率减少,且凋亡形态学特征不明显。（3）凋亡细胞中Caspase-3 mRNA表达量未见明显升高,而蛋白在凋亡形成后则完全裂解为17kD的活性Caspase-3,在正常细胞为32kD的pro-Caspase-3。结论X线诱导后CNE-2细胞呈典型的凋亡改变。凋亡细胞中有明显的Caspase-3激活,其Caspase-3的活性增高并非源于其转录的提高,而可能是翻译后酶前体的活化。抑制鼻咽癌Caspase-3酶活性,凋亡的发生可被抑制或是延迟。     

PDCD5与Caspase-3在人非小细胞肺癌中的表达

目的：研究PDCD5及Caspase-3在人非小细胞肺癌（non-smallcelllungcarcinoma,NSCLC）组织中的表达及其相关性,探讨二者在非小细胞肺癌发生、发展中的作用。方法：采用免疫组织化学法检测54例NSCLC肿瘤组织和20例癌旁正常肺组织中PDCD5和Caspase-3蛋白的表达情况。结果：PDCD5和Caspase-3在NSCLC组织中表达明显低于癌旁正常肺组织（79.6%vs100%,75.9%vs100%,P〈0.05）,且二者在肺癌中的表达随NSCLC临床分期的上升及组织学分级的下降逐渐减弱。结论：PDCD5和Caspase-3在非小细胞肺癌组织中表达下调,且二者在肺癌组织中的表达呈正相关,PDCD5可能作为Caspase-3蛋白的正调控因子促进细胞凋亡。