刀豆蛋白A诱导人脐静脉内皮细胞表达P-ERKl／2

目的：探讨刀豆蛋白A （Concanavalin A,ConA）对CRL2480细胞（人脐静脉内皮细胞系）细胞外调节蛋白激酶（Extracellular signal-regulated kinase,ERK）1/2磷酸化的影响。方法采用MTT法检测ConA对CRL2480细胞活化的影响;采用Western印迹法检测CRL2480细胞磷酸化（p）-ERK1/2的表达;采用细胞免疫荧光技术检测p-ERK1/2在细胞内的分布。结果在5~20μg/ml范围,ConA刺激CRL2480细胞8 h的活化指数具有剂量依赖性;20μg/ml ConA显著增加CRL2480细胞的活化（P〈0.05）。ConA能够增加CRL2480细胞的p-ERK1/2表达水平（P〈0.05）,ERK途径抑制剂PD98059和U0126明显抑制p-ERK1/2表达。免疫荧光染色结果显示ConA刺激细胞的荧光信号明显高于对照细胞,荧光分布于细胞浆、细胞核周围和细胞核内。结论 ConA能够激活CRL2480细胞表达p-ERK1/2。     

芦荟苷通过调控MAPKs信号通路诱导胃癌细胞凋亡

目的探讨芦荟苷对人胃癌MKN-28和HGC-27细胞凋亡的诱导作用及可能的分子机制。方法胃癌MKN-28和HGC-27 细胞用含10%胎牛血清和NEAA（HGC-27细胞）的1640完全培养基常规培养,不同浓度的芦荟苷处理胃癌MKN-28和HGC-27 细胞特定的时间,CCK-8 实验检测芦荟苷对MKN-28 和HGC-27 细胞活力的影响;DAPI染色观察凋亡细胞核的形态改变; AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;Western blotting检测凋亡相关蛋白PARP和procaspase-3的表达及MAPKs信号通 路p38,ERK及JNK的磷酸化水平;p38,ERK及JNK的特异性抑制剂处理细胞,WB检测抑制剂的对p38,ERK及JNK激活的抑 制效果,DAPI染色观察抑制剂对胃癌细胞凋亡的影响。结果芦荟苷浓度依赖性地抑制胃癌MKN-28和HGC-27细胞的活力, 诱导胃癌细胞凋亡;芦荟苷处理胃癌细胞后,胞内JNK和p38的磷酸化水平明显增加,而ERK的磷酸化水平下降。特异性抑制 剂阻断ERK活化,能够增强芦荟苷诱导的细胞凋亡,阻断p38和JNK的激活,能够部分逆转芦荟苷诱发的胃癌细胞凋亡。结论 芦荟苷通过激活JNK和p38信号途径,抑制ERK信号途径诱导胃癌细胞凋亡。     

片仔癀通过PI3K/Akt信号通路诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡

目的探讨片仔癀诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）途径的关系。方法采用不同浓度片仔癀（0.4，0.8，1.2mg/mL）作用U2OS细胞，采用MTT法检测片仔癀对U2OS细胞增殖的影响；Hoechst 333258染色观察细胞凋亡情况；Western blot检测PI3K调节亚基p85α（PI3K p85α）、磷酸化PI3K调节亚基p85α（p-PI3K p85α）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、核多聚（ADP-核酶）聚合酶（PARP）、裂解PARP（Cleaved PARP）等PI3K/Akt途径相关蛋白的表达。结果片仔癀可明显抑制U2OS细胞的增殖，呈时间和浓度依赖性，诱导U2OS细胞凋亡；Western blot显示p-PI3K p85α、p-Akt蛋白表达明显下调，Cleaved PARP表达量增加，与空白对照组相比有明显差异（P<0.05）。结论片仔癀可通过抑制PI3K/Akt信号途径PI3K p85α、Akt磷酸化，促进PARP裂解，诱导骨肉瘤U2OS凋亡。     

Akt/PKB信号通路调控机制的研究进展

Akt/PKB是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,为多条信号途径的重要交叉点,在高等生物细胞内广泛存在。它通过磷酸化多种下游靶点如Bad、caspase 、Forkhead家族蛋白、NF-κB、GSK3 和p27kip1、p21Cip1等,激活或抑制一系列相关底物,参与细胞生长、增殖、凋亡、糖类代谢、新生血管形成、基因转录、细胞迁移等细胞活动。本文主要就Akt信号通路及其抗凋亡分子调控机制的研究进展做一综述。     

胰岛素样生长因子Ⅱ激活宫颈癌细胞株ERK1/2信号通路并诱导其增殖

目的 探讨胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF—Ⅱ）激活宫颈癌SiHa细胞株ERK1／2（p42／44MAPK）信号通路的模式变化及对其增殖的影响。方法 用MTT法观察细胞增殖，用Western blot测定细胞p42／44MAPK磷酸化表达。结果 IGF—Ⅱ可诱导SiHa细胞增殖，并呈剂量依赖性；用IGF—IR单克隆抗体（1，5，10μmol／L）预处理30min可显著抑制IGF-Ⅱ（20ng／mL）诱导的SiHa细胞增殖，并呈剂量依赖性。IGF—Ⅱ（100ng／mL）可诱导SiHa细胞p42／44MAPK磷酸化表达，20min达到高峰；IGF—IR单克隆抗体可显著抑制IGF—Ⅱ诱导的Siha细胞p42／44MAPK磷酸化。结论IGF—Ⅱ可激活宫颈癌SiHa细胞株p42／44MAPK信号通路，并可能通过p42／44MAPK信号通路调控SiHa细胞增殖。     

表儿茶素对H2O2引起的Huh7细胞氧化应激的作用

目的：探索表儿茶素对H2O2引起的Huh7细胞氧化应激的作用及其机制。方法：对H2O2和表儿茶素干预培养的Huh7细胞,应用MTT法检测细胞存活率,荧光探针DCFH-DA测定细胞内活性氧（ROS）生成量,免疫印迹测定丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt）,增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）,磷酸化应激激活的c-Jun蛋白水平。结果：0.8mmol/LH2O2孵育1h可诱导显著Huh7细胞损伤,细胞存活率下降到（40±3.2）%,ROS生成量比未处理细胞多5.4倍。细胞经150μmol/L表儿茶素与H2O2共孵育后,细胞存活率提高到（94.5±9.84）%;表儿茶素能显著抑制H2O2引起的Huh7细胞ROS生成,ROS生成下降60%（P〈0.01）。表儿茶素抑制H2O2引起Huh7细胞死亡和ROS生成随剂量增加抑制作用加强。表儿茶素抑制H2O2激发Huh7细胞磷酸化c-Jun表达,提高细胞Akt、PCNA水平。结论：表儿茶素抑制H2O2引起的Huh7细胞氧化应激损伤而导致的细胞死亡,其作用机制是通过减少细胞内活性氧生成,抑制H2O2激活磷酸化c-Jun,提高细胞Akt,PCNA水平。     

C5a激活Akt1⁃ERK1/2通路促进NSCLC细胞的增殖和迁移

目的：探讨C5a对非小细胞肺癌（non?small cell lung cancer,NSCLC）细胞增殖和迁移的影响及其潜在的分子机制。方法：RT?PCR和Western blot检测人正常支气管上皮细胞系BEAS?2B和3种NSCLC细胞系（H1703、PC9、H1299）中C5a受体（C5aR）的表达;CCK?8和划痕实验检测C5a对PC9细胞增殖和迁移的影响;Western blot检查C5a刺激PC9细胞后蛋白激酶Akt1、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal?regulated kinase,ERK1/2）和蛋白激酶C?α（protein kinase C?α,PKC?α）表达及磷酸化水平;用Akt1抑制剂Perifosine和ERK1/2抑制剂U0126分别处理PC9细胞后再给予C5a刺激,Western blot检测Akt1和ERK1/2的表达和磷酸化及其上下游调控关系,CCK?8和划痕实验检测Perifosine和U0126对细胞增殖和迁移的影响。结果：PC9细胞C5aR的表达水平显著高于其他细胞;C5a可明显促进PC9细胞的增殖和迁移能力;C5a刺激PC9细胞后,可显著增强Akt1和ERK1/2的磷酸化;Akt1和ERK1/2抑制剂均能明显降低C5a刺激PC9细胞后引起的细胞增殖和迁移,且Akt1抑制剂不仅能减弱Akt1的磷酸化,还能减弱ERK1/2的磷酸化,而ERK1/2抑制剂则仅能阻断其自身的磷酸化。结论：C5a刺激NSCLC细胞后可能通过激活Akt1?ERK1/2通路促进细胞的增殖和迁移。     

天花粉蛋白对结肠癌细胞株CMT-93凋亡及增殖的影响

目的探讨低剂量天化粉蛋白（TCS）对结肠癌细胞株CMT-93凋亡及增殖的影响。方法以不同质量浓度的TCS对体外培养的CMT-93进行十预,设立未添加TCS的CMT-93作为对照组,利脂实时细胞动态监测（RTCA）系统检洲细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡,Real—TimePCR检测细胞凋亡相关基因的表达,Westernblotting检测丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶Akt和γ-H2AX蛋白表达以及Akt磷酸化水甲（pAkt473和pAkt308蛋白表达）。结果与对照组比较,5．0μg／ml。TCS干预能使CMT-93增殖活性降低,细胞凋亡率升高;促凋产相关蛋hBid、Bax、BadmRNA表达上调;pAkt473和pAkt308蛋门表达减少,γ-H2AX蛋白表达增加。结论TCS对结肠癌细胞株CMT-93具有诱导凋亡和抑制增殖的作用;其机制可能与TCS通过抑制Akt的活性,进而激活促凋亡相关蛋白诱导细胞发生凋亡,以及TCS的DNA损伤作用有关。     

香烟提取物对气道平滑肌细胞增殖中ERKs及NF-κB表达的影响

目的探讨香烟提取物（cigarette smoke extract，CSE）对气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）增殖中细胞外信号调节蛋白激酶（ERKs）及核因子-κB（NF-κB）表达的影响。方法体外培养Wistar大鼠的气道平滑肌细胞，给予不同浓度的CSE刺激24 h后，MTT法检测细胞增殖情况，采用Western blot方法检测ERKs、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶（p-ERK）和NF-κB p65的表达。结果1/32 CSE组、1/16 CSE组及1/8 CSE组的细胞增殖和ERKs、p-ERK、NF-κB p65的表达均逐渐增高，且与对照组相比差异有显著性意义（P〈0.05，n=4）。NF-κB p65的表达水平与p-ERK的表达水平呈明显正相关（r=0.858，P〈0.05，n=4）。结论一定浓度的CSE作用于平滑肌细胞后引起ERKs及ERKs磷酸化的增加，磷酸化激活后的ERKs可能与NF-κB的活化和ASMCs的增殖有关。     

过表达TLR4基因对胃癌细胞自噬的抑制作用及其机制

目的 采用慢病毒过表达胃癌细胞中Toll样受体4（TLR4）基因,探讨其对胃癌细胞自噬的作用,并阐明其作用机制。 方法 处于对数生长期的胃癌BGC-823细胞和SGC-7901细胞分为未感染组、阴性对照病毒组和基因过表达组,分别给予无慢病毒感染、空载体慢病毒和过表达TLR4慢病毒稳定感染。采用Western blotting法检测正常胃黏膜上皮GES-1细胞及胃癌BGC-823细胞、SGC-7901细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法分别检测各组细胞中TLR4、Beclin1和微管相关蛋白轻链3（LC3）mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中磷脂酰肌醇-3激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）、磷酸化PI3K／磷酸化Akt（p-PI3K／p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）信号通路相关蛋白及细胞自噬相关蛋白（LC3、Beclin1和p62）蛋白表达水平。 结果 BGC-823细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平高于胃黏膜上皮GES-1细胞。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞增殖活性明显升高（P<0.05或P<0.01）。与阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）,BGC-823细胞中Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）,SGC-7901细胞中LC3和Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中LC3和Beclin1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,p62、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。 结论 过表达TLR4基因可以通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路明显抑制胃癌细胞的自噬活性。     

野生型及Thr187突变型p27Kip1 蛋白对HepG2细胞周期的影响

目的p27kip1氨基端第187号位置的苏氨酸(Thr187)磷酸化位点是该蛋白分子中重要的磷酸化位点,探讨人工诱变该位点苏氨酸为丙氨酸(T187A)后对肝癌细胞株HepG2细胞周期以及细胞增殖的影响。方法应用脂质体转染法将含人野生型和突变型p27kip1基因质粒DNA转染HepG2细胞,免疫细胞荧光化学检测p27kip1蛋白的表达,并用流式细胞仪分析细胞周期的变化。结果野生型和突变p27kip1基因转染HepG2细胞后均能在细胞核表达,并且可以明显抑制细胞增殖。p27kip1基因转染的HepG2细胞发生G0期阻滞,且突变型G0期阻滞作用明显强于野生型(P<0.01)。结论转染的p27kip1能够在HepG2细胞过度表达并能抑制HepG2细胞的增殖,Thr187磷酸化位点的人工诱变可能有利于p27kip1蛋白促使细胞G0期阻滞。     

ERK2的表达与宫颈癌的生物学行为的关系

细胞外信号调节激酶（extracellular singnal-regulated kinase,ERK）是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）的一个主要亚族.该酶被激活后成为磷酸化的ERK（p-ERK）,其持续激活是细胞通过G1期和G1/S转化所必需的.p-ERK介导信号由胞浆传递到胞核,通过转录调节激活多种癌基因,引起细胞的恶性转化[1].p-ERK可能通过重组细胞支架、改变细胞形态[2]及促进细胞质中基质金属蛋白酶和尿激酶纤维蛋白酶原激活剂的表达[3],从而促进肿瘤细胞的浸润和转移.本研究应用免疫组织化学SP法检测ERK2在宫颈癌中的表达,并分析其与宫颈癌临床病理特征的关系.     

分泌型cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ对胃癌细胞增殖相关基因表达的调控

目的: 初步探索分泌型cGMP依赖性蛋白激酶Ⅱ(type Ⅱ cGMP-dependent protein kinase,PKG Ⅱ)对人胃癌HGC 27和AGS细胞株基因表达的影响。方法: 采用Illumina HiSeq 2000高通量测序平台对使用谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S transferases, GSTs)标签表达的重组全长人PKG Ⅱ处理前、后的人胃癌AGS细胞株转录组进行测序;从表达差异明显的基因中筛选与肿瘤细胞增殖相关的基因,采用qRT-PCR法验证在cGMP类似物8-pCPT-cGMP的激活下重组PKG Ⅱ对相关基因转录水平的影响,并通过蛋白质免疫印迹进一步验证其对相关蛋白表达水平的影响。结果： 转录组测序结果显示,579个基因表达有明显差异,其中267个基因表达显著上调,312个显著下调;筛选9个与肿瘤细胞增殖相关的基因进行qRT-PCR检测,证实在GST-PKG Ⅱ和8-pCPT-cGMP共同作用下,EGF、DFNA5、DACT1、PSCA等mRNA水平在AGS和HGC-27两个细胞株中都表现出与转录组测序一致的趋势(与空白对照组相比P均<0.05);蛋白质免疫印迹结果显示,在GST-PKG Ⅱ和8-pCPT-cGMP共同作用下,表皮生长因子蛋白水平下调,与转录组测序和qRT-PCR结果一致。结论： 分泌型PKG Ⅱ可从转录水平调控人胃癌HGC-27和AGS细胞中EGF等增殖相关基因的表达,并能够抑制EGF的翻译。     

MEK抑制剂在K-RAS基因突变的结直肠癌细胞中的耐药机制

目的探讨丝裂原激活蛋白激酶的激酶（MEK）抑制剂曲美替尼（Trametinib）在v-Ki-ras2Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（K-RAS）基因突变的结直肠癌（CRC）细胞中的耐药机制。方法用Trametinib处理K-RAS基因突变型CRC细胞株LS174T、DLD-1、HCT116,Westernblot法检测STAT3上游蛋白JAK2、JAK3和Src等是否激活。用Trametinib、JAK2/STAT3抑制剂鲁索替尼（Ruxolitinib）/LY5或者两者联用处理HCT116细胞,Westernblot法检测p-STAT3Y705、STAT3、p-ERK1/2表达,磺酰罗丹明B蛋白染色实验观察细胞增殖情况。用Trametinib、LY5或Trametinib+LY5处理HCT116、DLD-1细胞,细胞迁移划痕实验观察细胞迁移情况,MTT实验检测细胞生存率。结果Trametinib能明显抑制ERK1/2的磷酸化,同时也能诱导p－STAT3Y705增加,诱导STAT3上游激酶p-JAK2高表达。Trametinib+Ruxolitinib/LY5联合用药,可同时阻断K-RAS基因突变的CRC细胞p－STAT3Y705、p-ERK1/2的激活,协同抑制肿瘤细胞的生长;可明显抑制肿瘤细胞克隆形成,减弱肿瘤细胞增殖能力;可抑制肿瘤细胞迁移能力,效果明显优于单药组（均P＜0.05）;可抑制细胞增殖,细胞生存率明显低于单药组（均P＜0.05）。结论MEK和STAT3信号通路双重抑制的联合用药方案,是CRC治疗方案的新研究方向。     

雷公藤诱导皮肤T细胞淋巴瘤Hut102的凋亡及机制

目的探讨雷公藤内酯醇（TP）诱导皮肤T细胞淋巴瘤Hut102细胞株的凋亡及机制。方法采用MTT法检测Hut102细胞的增殖抑制率,Annexin v-FITC/PI双染流式细胞术检测Hut102细胞的凋亡率,Western印迹法检测Hut102细胞中磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、caspase-3、热休克蛋白27（Hsp27）的表达。结果雷公藤内酯醇可诱导Hut102细胞凋亡（P〈0.01）,磷酸化p38MAPK、caspase-3被激活,同时抑制Hsp27的表达。用p38MAPK特异性抑制剂SB203580干预后,雷公藤内酯醇诱导Hut102细胞凋亡率下降,磷酸化p38的表达降低,caspase-3激活被抑制,Hsp27的表达增加。结论雷公藤内酯醇可诱导Hut102细胞凋亡,该作用可被p38MAPK特异性抑制剂SB203580显著抑制,提示雷公藤内酯醇可能通过激活p38MAPK信号通路使部分Hut102细胞产生凋亡。     

磷酸腺苷激活的蛋白激酶参与调节细胞外信号调节激酶1/2活化发挥对血管平滑肌细胞胰岛素样生长因子-1信号的抑制作用

目的 进一步证实在猪主动脉平滑肌细胞中磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）抑制胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）刺激引起的细胞增生,以及探讨其可能的机制。方法 使用AMPK活化剂二甲双胍增强细胞内AMPK的活化（表现为AMPK第172位苏氨酸磷酸化增高）;采用定点突变获得组成性激活型AMPK突变体,设计短发卡RNA（short hairpin,shRNA）序列构建AMPK干扰载体,并分别包装产生组成性激活型AMPK和AMPK敲低慢病毒。分别采用AMPK活化剂二甲双胍处理、组成性激活型AMPK慢病毒感染和AMPK敲低慢病毒感染猪主动脉平滑肌细胞,观察AMPK活性对猪主动脉平滑肌细胞中IGF-1刺激引起的细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1/2,ERK1/2）活性（表现为202位苏氨酸和204位酪氨酸的磷酸化）及其下游细胞增生的影响。结果 二甲双胍明显增强AMPK的活性（表现为172位苏氨酸磷酸化增高）,并明显抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化（表现为202位苏氨酸和204位酪氨酸的磷酸化受到抑制）;组成性激活型AMPK表达能明显抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化以及下游的细胞增生;在AMPK敲低细胞中,IGF-1能引起更强的ERK1/2活化。结论 AMPK能通过抑制ERK1/2活化抑制血管平滑肌细胞IGF-1信号,并能抑制IGF-1刺激引起的血管平滑肌细胞增生。     

miR-1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对高糖诱导的H9c2心肌细胞自噬的影响

目的 探讨miR-1对高糖诱导的H9c2心肌细胞自噬及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的影响。方法H9c2细胞随机分为4组。正常组使用普通培养基培养,未转染;诱导组使用含33 mmol/L葡萄糖的培养基诱导,未转染;miR-1 NC组使用含33 mmol/L葡萄糖的培养基诱导,转染miR-1 NC;miR-1 inhibitor组使用含33 mmol/L葡萄糖的培养基诱导,转染miR-1 inhibitor。在加入葡萄糖诱导前48 h,使用Lipofectamine 3000转染试剂盒进行转染。实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测H9c2细胞和高糖诱导的H9c2细胞中miR-1表达水平;CCK-8法检测各组H9c2细胞增殖活性;蛋白免疫印记法（Western blot）检测各组H9c2细胞中Beclin1、p65、PI3K蛋白表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平;生物信息学预测和双萤光素酶验证miR-1和PI3K的靶向关系。结果与正常组相比,诱导组的H9c2细胞中,miR-1表达水平显著升高（P<0.05）,PI3K蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。与正常组相比,诱导组H9c2细胞Beclin1蛋白表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高,自噬小体增多,细胞增殖率、p62蛋白表达以及PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平显著降低（P<0.05）;与诱导组和miR-1 NC组相比,miR-1 inhibitor组H9c2细胞miR-1水平、Beclin1蛋白表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低,自噬小体减少,细胞增殖率、p62蛋白表达以及PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.05）;miR-1和PI3K间存在靶向关系。结论在高糖诱导的H9c2细胞中,miR-1表达水平升高,抑制miR-1,可通过靶向激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制高糖诱导的H9c2心肌细胞自噬。     

黄芪多糖对基底细胞样乳腺癌细胞增殖和Akt磷酸化的影响

目的：观察黄芪多糖对基底细胞样乳腺癌细胞株MDA-MB-468细胞增殖和Akt蛋白磷酸化的影响。方法：用不同浓度的黄芪多糖（Astragalus polysaccharide,APS）干预MDA-MB-468细胞,用甲基噻唑基四唑法检测不同浓度APS干预对MDA-MB-468细胞增殖的量效和时效关系。用细胞内蛋白质印迹法检测APS干预MDA-MB-468细胞株1、2、4和7d后对磷酸化Akt（phospho-Akt,p-Akt）（Thr308）和p-Akt（Ser473）蛋白表达水平的影响,以及p53/鼠双微体2（murine double minute 2,MDM2）信号转导通路中的关键靶点p53、MDM2和人第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN）蛋白表达水平的影响。用小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）技术沉默PTEN的表达,用细胞内蛋白质印迹法检测APS干预MDA-MB-468细胞2d对p-Akt（Thr308）和p-Akt（Ser473）蛋白表达水平的影响。结果：1和0.5mg/mL的APS对MDA-MB-468细胞的增殖有明显的抑制作用。1和0.5mg/mL的APS干预1、2、4和7d后能下调p-Akt（Thr308）的表达;干预1和2d后下调p-Akt（Ser473）的表达,上调MDM2蛋白的表达;干预7d后上调p53和PTEN蛋白的表达。PTEN沉默后,APS在干预2d后对p-Akt（Thr308）和p-Akt（Ser473）的表达没有影响,细胞增殖的抑制率低于PTEN未沉默时。结论：APS能抑制MDA-MB-468细胞的增殖,下调MDA-MB-468细胞Akt磷酸化的水平,其抑制MDA-MB-468细胞增殖的机制可能与通过对p53/MDM2正负反馈环的调节从而上调p53和PTEN蛋白的表达有关。     

小分子干扰RNA沉默黏着斑激酶基因对人宫颈癌Hela细胞生物学特征的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)沉默黏着斑激酶(FAK)基因对人宫颈癌Hela细胞生物学特征的影响。方法培养人宫颈癌Hela细胞,根据转染物的不同分为siRNA-FAK组、siRNA-阴性对照组和空白对照组,实时荧光定量聚合酶链反应技术检测细胞中FAK基因表达,噻唑蓝法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot法检测各组细胞中FAK、RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶-1(Raf-1)、磷酸化-Raf-1(p-Raf-1)、丝裂原活化蛋白激酶1/2(MEK1/2)、磷酸化-MEF1/2(p-MEK1/2)、细胞外信号调节激酶(ERK)和磷酸化-ERK(p-ERK)蛋白表达。结果空白对照组、siRNA-阴性对照组、siRNA-FAK组细胞中FAK mRNA相对表达量、细胞凋亡率、细胞迁移细胞数、侵袭细胞数、FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白相对表达量及细胞增殖能力比较差异均有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与siRNA-阴性对照组细胞中FAK mRNA的相对表达量、细胞增殖能力、细胞凋亡率、迁移细胞数、侵袭细胞数以及FAK、Raf-1、p-Raf-1、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK和p-ERK蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05);siRNA-FAK组细胞中FAK mRNA相对表达量、细胞增殖能力、迁移细胞数、侵袭细胞数以及FAK、p-Raf-1、p-MEK1/2、p-ERK蛋白相对表达量均显著低于空白对照组和siRNA-阴性对照组(P<0.05),细胞凋亡率及Raf-1、MEK1/2和ERK蛋白相对表达量均显著高于空白对照组和siRNA-阴性对照组(P<0.05)。结论特异性抑制人宫颈癌Hela细胞中FAK基因可减少细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,其机制可能与抑制Raf/MEK/ERK信号通路有关。     

葛根素对肾透明细胞癌786-O细胞生长抑制作用的研究

目的通过观察葛根素对肾透明细胞癌786-O细胞增殖与凋亡的影响,探讨其抑制786-O细胞生长的作用机制。方法分别以二甲基亚砜（空白对照）、不同浓度（10、20、40mg/L）葛根素和70mg/L5-氟尿嘧啶干预对数生长期786-O细胞48h,采用CCK-8法检测各组细胞增殖率,细胞克隆实验观察细胞克隆形成能力,流式细胞术分析细胞周期分布,AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡水平,Westernblot法检测细胞周期和细胞凋亡相关蛋白表达水平。结果与空白对照相比,20、40mg/L葛根素或5-氟尿嘧啶干预能够降低786-O细胞增殖率和细胞克隆数目（均P＜0.01）,提高处于G0/G1期细胞百分比并降低S期细胞百分比（均P＜0.01）,提高细胞凋亡率（均P＜0.01）,上调第10号染色体缺失的磷酸酶（PTEN）、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CleavedCaspase-3）、周期蛋白激酶抑制因子p27表达水平（均P＜0.01）,下调磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、细胞周期蛋白D1（cyclinD1）表达水平（均P＜0.05或0.01）,降低PI3K、Akt磷酸化比值（均P＜0.05或0.01）。与5-氟尿嘧啶干预相比,40mg/L葛根素干预能够降低786-O细胞增殖率和细胞克隆数目（均P＜0.01）,提高G0/G1期细胞百分比并降低S期细胞百分比（P＜0.05或0.01）,提高细胞凋亡率（P＜0.05）,上调PTEN、CleavedCaspase-3、p27表达水平并下调p-PI3K、p-Akt、cyclinD1表达水平（P＜0.05或0.01）,降低PI3K、Akt磷酸化比值（均P＜0.05）。结论葛根素能够通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡而抑制肾透明细胞癌786-O细胞生长,可能与诱导PTEN表达而抑制PI3K/Akt通路有关。