人树突状细胞SOCS1基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人树突状细胞（hDCs）信号传导通路抑制因子1（SOCS1）基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体。方法根据人树突状细胞SOCS1基因（NM-0037）,筛选出一个靶序列,设计并合成包含正反义靶序列的互补单链寡核苷酸,与经BamH和Xho酶切后的慢病毒载体质粒pRNA-Lenti-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）（含U6启动子和EGFP）连接产生pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒重组质粒,与慢病毒包装混合物共转染293T细胞,包装产生慢病毒,收集病毒上清,采取系列稀释法测定慢病毒滴度。然后转染hDCs,通过荧光显微镜观察细胞转染情况,利用荧光实时定量PCR和Westernblot检测干扰组、阴性对照组、空白对照组SOCS1的表达情况。结果将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功。荧光实时定量PCR及Westernblot检测显示慢病毒重组质粒感染hDCs后,与空白对照组及阴性对照组比较,siRNA组mRNA和SOCS1蛋白的表达量显著降低,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论构建的pRNA-Lenti-SOCS1-EGFP慢病毒载体可有效地抑制hDCs的SOCS1的表达,为进一步研究DCs增强抗肿瘤免疫应答效应奠定基础。     

微载体旋转立体培养成人退变髓核细胞及鉴定

背景：旋转生物反应器是目前应用较多的微载体培养系统。 目的：应用微载体旋转立体培养方法对成人退变髓核细胞进行扩增及鉴定。 方法：对手术切除的髓核组织进行原代培养,传代后进行单层培养和微载体旋转立体培养的对比,并行苏木精-伊红、Gimsa染色观察细胞形态,利用电镜观察其超微结构,利用MTT比色法检测细胞生长活性。 结果与结论：倒置相差显微镜观察培养的细胞符合退变髓核细胞形态,透射电镜下可显示其退变改变。倒置相差显微镜和扫描电镜下观察,可见退变的髓核细胞呈立体状生长,并能够成功甩珠传代。细胞在对数生长期时,微载体培养的细胞的生长活性明显高于单层培养组的细胞。表明微载体旋转立体培养法可以较好的维持细胞表型,对对数生长期髓核细胞的细胞活性具有明显的刺激作用。     

人EGFL7基因RNA干扰慢病毒载体的构建及其在人喉癌细胞中的表达

 目的：构建人表皮生长因子样结构域7（epidermal growth factor-like domain 7, EGFL7）基因RNA干扰（RNA interference, RNAi）慢病毒表达载体,并建立稳定干扰EGFL7基因表达的喉癌细胞亚系,为研究EGFL7蛋白在喉癌发生发展中的功能奠定基础。方法：针对人EGFL7基因序列,设计特异性RNAi靶序列,与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR线性载体定向连接,得到的阳性重组子再与pLenti6.3-MCS/V5-DEST慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体。在POLOdelivererTM 3000介导下将慢病毒包装质粒和EGFL7基因重组慢病毒载体导入293T细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人喉癌细胞HEp-2,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰EGFL7基因的细胞亚系。结果：成功构建EGFL7 pLenti6.3-EGFL7-miR真核表达慢病毒干扰载体并获得相应慢病毒,经测定病毒滴度为5×1011 TU/L,实时荧光定量PCR证实pLenti6.3-EGFL7-miR慢病毒载体对喉癌细胞HEp-2 EGFL7基因的沉默效率为97%。结论：成功构建人EGFL7基因特异性的慢病毒干扰载体,并获得EGFL7基因稳定干扰的喉癌细胞亚系。     

尼古丁在人椎间盘髓核细胞退变中的作用

目的探讨不同浓度及时间的尼古丁在人椎间盘髓核细胞退变中的作用。方法随机选择5例腰椎骨折患者的椎间盘髓核组织进行体外细胞培养,种于12孔板中,按照0、1、33.3、100、200、500ng/m L的尼古丁浓度以及1、2、3、7、10天加入来培养,每组细胞用Trizol法提取总RNA,用荧光定量PCR测定AQP1,AQP3和II型胶原(Collagen)以及蛋白多糖(Aggrecan)的m RNA表达。用SPSS19.0进行统计分析。结果随着尼古丁浓度升高及培养时间的延长,髓核细胞形态变化明显,贴壁能力减弱,胞质减少,胞核萎缩,空泡形成,凋亡增加。且细胞AQP1及AQP3的m RNA水平随着尼古丁浓度及时间的增加而降低,II型胶原及蛋白聚糖m RNA水平也降低,细胞发生退变。结论尼古丁会降低人椎间盘髓核细胞AQP1和AQP3的表达,进而降低髓核细胞II型胶原和蛋白聚糖的表达,促进椎间盘退变,且作用时间越长,浓度越高,细胞退变越严重。     

构建人端粒酶催化亚单位基因慢病毒表达载体转染人骨髓基质细胞

背景：骨髓基质细胞不表达端粒酶,因而在体外传代扩增过程中端粒长度逐渐缩短,导致细胞衰老,这是限制其用于细胞治疗应用的一个重要因素。 目的：构建人端粒酶催化亚单位基因慢病毒表达载体,探讨以慢病毒介导的人端粒酶催化亚单位基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。 方法：以pReceiver-M02-hTERT质粒为模板PCR扩增获得目的基因。用BP重组系统将目的片段重组到载体pDONR221上。然后使用LR重组系统将目的序列重组到载体pLenti6.3/V5-DEST上。将重组载体与包装质粒充分混合,利用脂质体共转染293FT细胞获得慢病毒颗粒。 结果与结论：成功构建人端粒酶催化亚单位慢病毒表达载体,病毒的平均物理滴度为1.07×10¹² LP/L。以之转染人骨髓基质细胞,目的基因表达水平有显著提升,细胞正确表达人端粒酶反转录酶蛋白。说明以慢病毒介导的人端粒酶催化亚单位基因修饰人骨髓基质细胞能强化细胞表达人端粒酶催化亚单位。     

核因子κB、基质金属蛋白酶3在退变腰椎间盘组织中的表达

背景：对于椎间盘退变的原因一直是国内外学者研究的重点。近年来随着研究的深入,在椎间盘退变过程中多种细胞因子、黏附分子、趋化因子、炎症递质、蛋白质酶等发挥着重要作用。 目的：比较正常腰椎间盘组织及退变腰椎间盘组织中核因子κB、基质金属蛋白酶3的表达,分析两者的相关性。 方法：收集唐山市第二医院脊柱外科手术切除退变椎间盘组织68例(病变组),腰椎爆裂骨折正常椎间盘组织10例(对照组),应用苏木精-伊红染色、免疫组织化学方法和ELISA方法检测核因子κB、基质金属蛋白酶3的表达,并对两者相关性进行分析。 结果与结论：苏木精-伊红染色结果显示对照组可见纤维环和髓核结构,腰椎间盘髓核的软骨细胞表现为不规则的软骨陷窝,病变组细胞增殖明显,细胞核呈圆形或卵圆形,髓核细胞胞质呈空泡状。免疫组织化学方法显示病变组核因子κB、基质金属蛋白酶3吸光度值明显高于对照组(P < 0.05)。ELISA检测病变组核因子κB、基质金属蛋白酶3的表达均高于对照组(P < 0.05)。两者具有正相关性(r=0.643 0,P < 0.01)。     

人颈椎间盘退变与细胞凋亡及基质金属蛋白酶11的表达

背景：前期研究发现基质金属蛋白酶11基因在人退变颈、腰椎间盘组织中明显上调。 目的：观察人退变颈椎间盘髓核组织中基质金属蛋白酶11的表达与细胞凋亡的关系。 方法：纳入30个经MRI确认的退变颈椎间盘髓核组织和20个因颈椎创伤治疗获得的正常颈椎间盘髓核组织。 结果与结论：苏木精-伊红染色显示退变的颈椎间盘髓核组织中髓核细胞较正常髓核组织明显减少(P < 0.01),而凋亡细胞较正常髓核组织明显增多(P < 0.01)。免疫组化染色显示退变的颈椎间盘髓核组织中基质金属蛋白酶11的表达明显高于正常髓核组织(P < 0.01),且基质金属蛋白酶11表达与TUNEL染色检测到的细胞凋亡正相关(r=0.44,P < 0.05)。说明高表达的基质金属蛋白酶11不仅可直接破坏细胞外基质尚可诱导髓核细胞凋亡,在椎间盘退变的过程中发挥重要作用。     

基质金属蛋白酶1在不同程度退变腰椎间盘髓核与纤维环中的表达及意义

背景：基质金属蛋白酶在椎间盘退变中通过影响基质合成及降解导致基质成分紊乱及功能的改变。 目的：观察基质金属蛋白酶1在人类退变腰椎间盘组织中的表达变化。 方法：获取经手术治疗腰椎间盘突出症患者椎间盘标本30份,突出型、脱出型、游离型各10份,分离髓核与纤维环,设为实验组;腰椎损伤致椎体骨折切除椎间盘10份设为对照组。应用免疫组织化学法检测基质金属蛋白酶1在椎间盘中髓核与纤维环细胞中的表达。 结果与结论：①苏木精-伊红染色显示,对照组椎间盘标本纤维环仍保持着致密的板层结构,实验组椎间盘组织多呈纤维化样改变。②两组髓核细胞中基质金属蛋白酶1表达均高于纤维环细胞中的表达。③实验组突出型椎间盘标本中基质金属蛋白酶1表达明显高于对照组(P < 0.01),脱出型和游离型椎间盘标本中基质金属蛋白酶1表达明显高于突出型 (P < 0.01)。 关键词：椎间盘退变;基质金属蛋白酶1;椎间盘突出症;髓核;纤维环 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.13.015     

沉默Toll样受体4基因表达的RNAi慢病毒载体的构建

背景：Toll样受体4 (toll-like receptor4,TLR4)是介导内毒素/脂多糖应答的主要受体,在由内毒素诱导的炎性反应的信号通路中发挥着重要作用。 目的：构建人TLR4基因的RNA干扰慢病毒载体,并观察其对人脐静脉内皮细胞TLR4在蛋白水平的沉默效应。 方法：利用Invitrogen在线软件设计人TLR4基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核苷酸后克隆到线性载体pENTRTM/H1/TO的黏性末端,并进行DNA测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组反应,从而获得干扰TLR4基因真核表达的慢病毒载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助复合体和TLR4基因的真核表达慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染人脐静脉内皮细胞,检验其干扰TLR4基因表达的有效性。 结果与结论：实验成功构建TLR4基因真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8.7×10⁶ U/mL。免疫印迹杂交结果表明,所获得的慢病毒感染人脐静脉内皮细胞TLR4基因在蛋白水平的表达显著降低。实验成功构建了人TLR4基因慢病毒RNA干扰表达载体,并验证了其在人脐静脉内皮细胞上的有效性。     

兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定*

背景：膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。 目的：针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。 方法：针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI 双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108 TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR 和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

Slug基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建Slug基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体。方法针对人Slug基因的序列,设计出RNA干扰的靶序列,合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,通过Age I和EcoR I酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生shRNA慢病毒载体,质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆并用插入鉴定引物进行PCR鉴定阳性克隆并测序,同时应用Real-time PCR和Western blot方法检测HCT116结肠癌细胞中Slug基因mRNA和蛋白的表达情况。结果 PCR鉴定与DNA测序证实合成的含Slug shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。Western blot证实Slug RNAi慢病毒载体能够抑制Slug的表达。结论成功构建Slug基因RNAi慢病毒表达载体,为后续感染结肠癌细胞,为探索在结直肠癌发生和发展中的作用奠定基础。     

EZH2基因RNAi慢病毒载体的包装及鉴定

目的 外周T细胞淋巴瘤（PTCL）源于成熟的胸腺后淋巴细胞,是一类少见的生物学行为及临床表现均高度异质性的疾病,且预后差.包装zeste基因增强子同源物2（EZH2）RNA干扰（RNAi）慢病毒载体,可为今后相关实验研究奠定基础.方法 靶向EZH2基因的短发夹RNA（EZH2-shRNA）质粒转化感受态细菌,筛选阳性克隆,经测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒三质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装.病毒载体感染Hut78细胞后,观察感染效率,并用反转录定量PCR（RT-qPCR）和Western Blot检测EZH2mRNA和蛋白表达水平.结果 成功包装了慢病毒表达载体,对Hut78细胞的感染效率在95％以上.RT-qPCR和Western Blot检测结果显示,EZH2基因在靶细胞中的表达水平降低.结论 成功包装并鉴定了EZH2基因RNAi慢病毒表达载体.     

SIRT1基因shRNA慢病毒载体构建及干扰效应检测

背景：SIRT1基因在细胞能量代谢、凋亡及衰老过程中发挥极重要的作用,另有研究发现SIRT1可能在炎症反应方面起着调控作用。 目的：构建SIRT1特异性的shRNA慢病毒载体,并初步检测其对THP-1细胞SIRT1基因的抑制效应。 方法：设计SIRT1靶点特异性的寡核苷酸序列,连接到经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切线性化的pGCSIL-GFP载体,包装293T细胞产生慢病毒,再转染THP-1细胞,通过实时荧光定量PCR实验及Western Blot检测对SIRT1靶基因的抑制情况。 结果与结论：阳性克隆PCR及测序证实SIRT1基因shRNA慢病毒载体构建成功,实时荧光定量PCR及Western Blot检测该载体在mRNA和蛋白水平能抑制THP-1细胞的SIRT1表达。     

正常与退变髓核细胞的变形能力

背景：细胞的变形能力在较大程度上能反映出细胞结构与功能的改变,目前对髓核细胞在细胞力学方面的研究较少。 目的：分析正常和退变髓核细胞的变形能力。 方法：正常髓核组织和退变髓核组织分别取材于3例脊柱侧弯患者和3例椎间盘突出患者术中取出的废弃髓核组织,用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分离提取细胞,行原代培养,通过微管加载装置适宜负压下测量细胞在第4秒时吸入微管的长度,并行统计学处理。 结果与结论：正常髓核细胞和退变髓核细胞所用的负压分别为(411.31±27.93) Pa,(434.24±46.26) Pa,差异有显著性意义(P < 0.05)。在4 s时吸入长度分别为(2.20±0.92) μm,(2.48±0.71) μm,差异无显著性意义(P > 0.05)。结果可见在规定时间的情况下,吸入微管的长度基本相同时,退变髓核细胞所需要的负压较正常髓核细胞大,说明退变髓核细胞的变形能力比正常髓核细胞差。     

白藜芦醇通过上调SIRT1促进退变髓核细胞胞外基质合成

目的:研究白藜芦醇(RES)对人退变椎间盘髓核细胞(DNPCs)合成细胞外基质(ECM)的影响.方法:对人退变椎间盘髓核组织进行分离、单层培养细胞鉴定、藻酸盐培养.取原代藻酸盐培养细胞分别用0、12.5、25、50、100、200μmol/L的RES分别刺激DNPCs 12、24、48 h,Western blot法检测沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(silent mating type information regulation 2 homolog 1,SIRT1)、Ⅱ型胶原(Colla2α1)、蛋白聚糖聚合物(aggrecan)蛋白表达,real-time 荧光定量PCR检测SIRTl mRNA表达水平.用SIRT1-siRNA 转染后再与100 μmol/L RES共培养24h,观察Colla2α1、aggrecan的蛋白表达.结果:RES上调SIRTl mRNA和蛋白水平的表达,促进DNPCs合成ECM的表达,与对照组相比具有统计意义(P＜0.05).siRNA靶向沉默SIRT1表达后,再加入RES刺激,观察到Colla2α1与aggrecan的蛋白表达与对照组相比显著下降(P＜0.05).结论:RES可刺激DNPCs ECM的合成,且呈现一定的量效关系,这种调节作用与SIRT1的活性有关.     

大鼠硫酸软骨素蛋白多糖基因shRNA慢病毒载体的构建及干扰效率鉴定

背景：最近研究发现硫酸软骨素蛋白多糖(NG2)在中枢神经系统中参与多种生理病理功能,慢病毒载体可感染分裂期细胞或非分裂期的细胞,并能在细胞内高效稳定的表达。 目的：构建大鼠源性NG2基因shRNA慢病毒载体并检测其干扰效率。 方法：选择大鼠NG2基因RNA干扰的靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Hpa Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生pLV-NG2-RNAi,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。将重组载体与pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体通过lipofectamineTM 2000共转染293T细胞包装产生慢病毒LV-NG2-RNAi,收集病毒上清并浓缩。采用孔稀释滴度测定法计算病毒滴度。将LV-NG2-RNAi慢病毒感染C6细胞,于感染后96 h提取细胞总蛋白,采用Western blot检测NG2的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目的序列一致,实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi。包装浓缩慢病毒的滴度为8×1011 TU/L。Western blot检测显示在感染复数为50时,感染LV-NG2-RNAi慢病毒的C6细胞较感染对照慢病毒及未感染细胞NG2的表达明显降低,干扰效率可达100%(P < 0.05)。结果证实了实验成功构建大鼠NG2基因shRNA慢病毒载体,且该载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。     

RPS14基因RNAi慢病毒载体构建及在SKM-1细胞中的表达

背景：有研究表明,造血干/祖细胞内RPS14表达减少可导致造血细胞病态造血,尤其是向红系分化受阻,提示RPS14的正常表达有助于维持机体的正常造血。 目的：构建RPS14基因RNAi慢病毒载体,并观察该基因在人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1细胞中的表达。 方法：针对已经筛选确定的RPS14基因RNAi有效靶序列,构建GC-shRPS14慢病毒载体并测序鉴定。用GC-shRPS14、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度;并将获得的RPS14shRNA慢病毒载体GC-shRPS14转染人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1,用Western Blot检测靶细胞内RPS14蛋白的表达。 结果与结论：经测序证实,构建出了RPS14shRNA的慢病毒载体GC-shRPS14。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×109 TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为75%,Western Blot检测到转染后RPS14在靶细胞中表达明显被抑制。说明成功构建RPS14基因RNAi慢病毒载体,转染人SKM-1细胞株后RPS14蛋白表达沉默。