原癌基因USP22启动子的克隆及转录活性分析

 目的克隆原癌基因USP22部分启动子序列,探讨其转录活性。方法应用cDNA 5忆末端快速扩增（5'RACE）方法定位
USP22基因转录起始点;在此基础上针对其5'端非编码区处包括转录起始点在内的-2 828~+52片段进行PCR扩增,产物克隆
入荧光素酶表达载体pGL3-Basic。重组质粒与内参质粒pRL-TK共转染HepG2 与Hela 细胞,双荧光素酶活性检测确定其转录
活性。结果成功确定USP22基因转录起始位点,酶切及测序结果证实USP22基因5'端非编码区2 880 bp 序列正确插入到荧
光素酶报告基因载体pGL3-Basic。重组质粒pGL3-USP22 promoter 转染HepG2 细胞和Hela 细胞后,检测到荧光素酶的高表达
（ P<0.05）。结论成功构建具有转录活性的USP22启动子片段,为进一步研究USP22表达调控机制奠定基础。     

肿瘤细胞新的标记基因——USP22

2005年,G.V.Glinsky等[1-2]利用mRNA微集阵列(microarray)技术,对不同组织来源的肿瘤细胞进行大量分析,归纳出11个在多数细胞中普遍高表达的标记基因,包括BMI-1、cyclin B1、FGFR-2、USP22、BUB1、HEC1、GBX2、Ankyrin3、RNF2、Mad2、Ki67等.以上基因在肿瘤发生、进展中扮演着重要的角色,不仅编码促使肿瘤生长的蛋白质,并且其表达程度与肿瘤转移的潜能、化疗耐药性及患者预后密切相关,因此,也被认为是肿瘤细胞的标记基因[3].其中去泛素化酶DUB基因家族成员USP22尚不为研究者熟知,本文就USP22的研究进展作一综述.     

PKA信号通路通过CREB正性调控USP22基因的转录激活

【目的】 通过对原癌基因USP22的5'端启动子活性分析,获得 PKA信号通路调控USP22转录激活的直接证据并探索其中机制。 【方法】 克隆USP22基因5'端核心启动子,定向插入荧光素酶报告载体pGL3-Basic;重组质粒经脂质体转染人宫颈癌HeLa细胞12 h后,分别采用PKA信号的激动剂Forkslin和抑制剂H-89刺激;双萤光素酶实验分析USP22启动子片段的相对活性;在此基础上,利用real-time PCR检测Forkslin和H-89对内源性USP22表达影响,以获得PKA信号通路调控USP22转录激活的直接证据;采用DNA定点突变技术,剔除该启动子区一个典型的CREB/ATF结合位点,经Forkslin和H-89处理,双萤光素酶检测以证实PKA信号通路通过CREB/ATF反应元件调控USP22的转录;最后,联合染色质免疫共沉淀(ChIP)与real-time PCR实验观察H-89对转录因子CREB与USP22启动子结合能力的影响。 【结果】 USP22基因的启动子活性及内源性mRNA表达受到PKA通路抑制剂H-89的显著抑制,但并未因为PKA的激活而出现明显上调;破坏CREB/ATF结合位点可消除USP22启动子对H-89的反应性;H-89抑制CREB与USP22启动子中CREB/ATF反应元件的结合导致USP22转录活性的下降。 【结论】 CREB/ATF结合位点控制着USP22基因的常规表达;USP22的转录受到PKA信号通路的正性调控;PKA信号通路通过转录因子CREB实现上述功能。     

cyclin B1 的启动子在乏氧条件下活性的变化

目的探讨细胞周期素B1(cyclin B1)的启动子在乏氧条件下活性的变化。方法采用PCR法获得对Hela细胞cy-clin B1的启动子,通过基因重组插入pGL3 promoter vector从而获得表达。荧光素酶的活性检测,了解通过双萤光素酶活性检测分析cyclin B1的启动子在乏氧条件下活性的变化。结果双萤光素酶活性检测cyclin B1的启动子活性在乏氧条件下,表达明显下降。结论在乏氧条件下,Hela细胞的cyclin B1的启动子活性下降,可能是乏氧条件下肿瘤细胞的自我保护机制。     

Sp1和Egr-1对LCRG1基因启动子转录活性的调节研究

目的:目前LCRG1基因转录调控机制不清,现拟研究Sp1和Egr-1对人LCRG1基因启动子的转录调节. 方法:利用MatInspector软件分析LCRG1基因启动子区域内潜在的转录因子结合位点,Sp1、wtEgr-1、mtEgr-1真核表达质粒与LCRG1启动子重组质粒的共转染实验,分析其对LCRG1启动子活性的影响. 结果:生物信息学提示LCRG1基因启动子区域存在Sp1和Egr-1等位点,外源性突变型转录因子Egr-1能上调LCRG1基因启动子的活性.结论:突变型转录因子Egr-1可能参与该基因的表达调控.     

USP22基因在氟尿嘧啶对肝癌细胞毒性作用中的影响

目的:探讨USP22基因在氟尿嘧啶对肝癌细胞毒性作用中的影响。方法:用Western blotting检测肝癌细胞HepG2和BEL7402中USP22基因的表达状态,构建并对肝癌细胞转染USP22基因的siRNA(siRNAUSP22),然后以氟尿嘧啶处理24h后,MTT检测法观察在USP22基因沉默前后,氟尿嘧啶对肝癌细胞活性的影响。结果:USP22基因在肝癌细胞中显著高表达。siRNA-USP22转染后显著抑制USP22基因的表达,同时可明显增强氟尿嘧啶对HepG2和BEL7402细胞的毒性作用,降低其细胞活性[(53.2±6.8)%,P<0.05;(49.8±7.3)%,P<0.05]结论:下调USP22基因可提高肝癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性,提示USP22高表达可能是造成肝癌化疗抵抗的原因之一。     

泛素水解酶22调控丝裂原活化蛋白激酶激酶6基因的转录活性

目的：克隆丝裂原活化蛋白激酶激酶6(mitogen-activated protein kinase kinase 6,MKK6)基因启动子,研究泛 素水解酶22(ubiquitin specific peptidase 22,USP22)对MKK6转录活性的调控作用。方法：采用PCR扩增MKK6基因启动 子片段,并以该片段为模板对USP22结合位点进行定点突变,将野生型与突变型启动子片段定向插入荧光素酶表达 载体pGL3-Basic;用重组载体与内参质粒pRL-TK共转染HeLa细胞,行双荧光素酶活性检测以确定其转录活性;利用 染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)实验观察USP22蛋白与MKK6启动子是否存在直接的结合;下 调USP22表达后,检测MKK6转录活性的变化。结果：成功扩增MKK6启动子及其突变体并构建荧光素酶表达载体; USP22结合位点的突变导致该启动子活性在HeLa细胞中明显降低(P<0.05);USP22与MKK6启动子在细胞中存在直接结 合;抑制USP22的表达导致MKK6转录水平明显下降(P<0.05)。结论：在HeLa细胞中,USP22有效地调控MKK6基因的 转录。     

神经细胞中乙酰化对NOS1基因启动子活性的调节

 目的 探讨乙酰化对人神经母细胞瘤SK-N-SH 细胞中NOS1基因启动子活性的调节作用。方法 构建系列截短的NOS1 5′侧翼序列萤光素酶报告基因载体,应用萤光素酶报告基因检测系统分析SK-N-SH 细胞中NOS1启动子活性,并比较组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A (TSA)刺激前后启动子活性的变化。结果 构建并鉴定了系列截短的NOS1 启动子萤光素酶报告基因载体;在NOS1基因启动子区鉴定了两个正调控区域和两个负调控区域,同时TSA可上调不同长度启动子的转录活性。结论 乙酰化参与调节神经细胞中NOS1基因启动子活性。     

含人DNA聚合酶β基因启动子萤光素酶报告载体的构建

目的:构建含人DNA聚合酶B(DNA polymerase beta,polβ)基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter.方法:利用PCR技术扩增人类polβ基因启动子的核心片段,克隆至含新霉素抗性的萤光素酶表达载体pGL3-Neo-enhancer,构建含DNA polβ启动子的萤光素酶表达载体pGLpolβ/promoter,重组子经双酶切、PCR及测序鉴定.将构建的载体用脂质体转染体外培养的食管癌EC-1细胞株,应用萤光素酶测定系统检测萤光素酶的表达活性.结果:测序结果表明,克隆获得的polβ基因启动子序列与GenBank报道的一致,且插入方向正确.pGL3polβ/promoter组萤光素酶的表达活性(2 207 348.000±71 626.763)与空白组(451.670±23.347)和pGL3.Neo-enhancer组(4 884.330±1 623.047)相比,差异有统计学意义(F=5 681.596,P<0.05).结论:成功构建了含人DNA polβ基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3polβ/promoter.     

SP1调控PIWIL1基因启动子转录活性研究

目的 克隆转录因子SP1编码序列,构建真核表达质粒PCDNA3.1-SP1,并研究其对PIWIL1基因转录活性的影响。方法 RT-PCR法从正常人外周血总RNA中钓取SP1基因的编码序列,插入至真核表达载体PCNDA3.1（+）,酶切及测序鉴定重组质粒。Western blot法分别验证重组表达载体的在COS-7细胞中的表达效应。分别将活性最高的PIWIL1基因启动子报告基因截短体（即核心启动子区域）、活性最低的PIWIL1基因启动子报告基因截短体,与SP1重组质粒共转染COS-7细胞,利用Dual-Luciferase reporter assay system测定不同启动子活性区的PIWIL1基因转录活性的改变,同时应用光辉霉素A下调SP1的表达来进一步验证SP1对PIWIL1活性的影响。结果 酶切及测序鉴定结果显示SP1表达质粒构建成功,Western blot法结果表明重组SP1表达载体能有效表达于COS-7细胞,过表达SP1可明显提高PIWIL1不同活性区的启动子的活性（P<0.05）。结论 外源性SP1真核表达载体转染能有效表达于COS-7细胞,并对PIWIL1的转录活性起着上调的作用,提示SP1可能是PIWIL1转录活性的正调控元件之一。     

中药成分CDP逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子低转录活性的研究

目的 研究中药成分CDP逆转高甲基化状态的GSTP1基因启动子低转录活性的作用.方法 构建含完全甲基化GSTP1启动子区的重组质粒pGL3-GSTP1prom并转染MCF-7细胞,分别用不同剂量的CDP和5-aza-C作用细胞,检测表达的萤光素酶活性.观察GSTP1启动子转录活性的变化. 结果 GSTP1启动子区被完全甲基化后转录活性显著降低;CDP能够逆转高甲基化状态下GSTP1基因启动子区的低转录活性且呈剂量依赖关系.结论 中药成分CDP能够逆转高甲基化状态的GSTP1 基因启动子区的低转录活性.     

部分骨钙素启动子控制荧光素酶基因真核载体的构建及表达

目的 构建部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，转染细胞后检测报告基因对rhBMP-2的反应，以期用于rhBMP活性的定量测定。方法 用PCR方法扩增骨钙素部分启动子147bp，克隆入pGEM-3zf(-)中，经酶切鉴定和序列分析正确后，亚克隆人能稳定高效表达荧光素酶的真核表达载体pcDNA3-Luc中，构建真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc，然后分别将pcDNA3-Luc和pcDNA3-OCP-Luc转染细胞，并检测其对rhBMP-2的反应。结果 成功构建了部分骨钙素启动子控制荧光素酶报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc；转染细胞后其报告基因的基础活性较pcDNA3-Luc大为降低，而且报告基因的表达与rhBMP-2剂量在一定范围内成线性正相关。结论 真核表达载体pcDNA3-OCP-Luc的报告基因表达具有特异性，可代替直接测定骨钙素用于rhBMP-2活性的定量测定研究。     

高血压相关基因CAT启动子多态结构对基因转录活性作用初步研究

目的 研究高血压相关基因过氧化氢酶(Catalase,CAT)基因启动子上游区T多态结构对转录活性的影响.方法 将CAT基因启动子T多态片断插入pGFP-1报告载体GFP基因上游的多克隆位点,重组质粒转化E.coli TG1受体细胞,经蛋白电泳和荧光显微镜观察,检测GFP报告基因的表达情况.结果 显示CAT启动子上游T多态不影响GFP报告基因的表达,实验结果与人细胞中分析结果相同.结论 说明从多态遗传结构而言,CAT启动子上游T多态结构不影响转录活性.     

ERK通路对PHA诱导人外周血单个核细胞中USP22基因表达的影响

目的 探讨细胞外信号调节激酶(ERK)对植物血凝素(PHA)诱导人外周血单个核细胞USP22基因表达的调控作用.方法 不同浓度PHA刺激人外周血淋巴细胞,Western blot检测ERK1/2的磷酸化水平及USP22蛋白表达;ERK1/2磷酸化抑制剂PD98059预处理细胞,Western blot和RT-PCR分别检测PHA诱导的USP22蛋白及mRNA的表达.结果 Western blot显示受PHA刺激后,人外周血单个核细胞USP22和p-ERK1/2蛋白的表达水平均高于对照组;而p-ERK1/2抑制剂阻断ERK磷酸化水平,进而下调USP22蛋白及mRNA表达水平.结论ERK1/2信号通路参与PHA对人外周血单个核细胞USP22基因的转录激活.     

人TIPE2基因启动子的鉴定及其表达调控区域的研究

目的克隆人TIPE2基因启动子区及一系列5’截短片段,并鉴定其DNA表达调控区域。方法采用PCR技术从人基因组DNA中克隆扩增TIPE2基因5’上游1 252 bp启动子序列并对该片段5’端的截短,分别瞬时转染人卵巢癌来源细胞系SKOV3,通过双萤光素酶活性的检测鉴定其启动子活性及表达调控区域。结果克隆扩增的8个TIPE2基因启动子截短片段经测序证明无误;TIPE2-pGL4-F1重组质粒双萤光素酶活性检测显示其具有明显的启动子活性,约为pGL4-Basic的7.9倍;5’系列截短片段重组质粒的启动子活性检测显示,与1 252 bp片段相比,TIPE2上游-965～-593 bp、-501～-390 bp缺失,启动子活性分别升高6.38、7.82倍;-593～-501 bp的缺失,使-501～+79 bp片段相对于-593～+79 bp片段的启动子活性降低2.04倍。结论人TIPE2基因上游1 252 bp区域有明显的启动子活性,该片段内存在2个潜在的负性调控区和1个潜在的正性调控区。     

Hes1基因启动子的克隆及活性研究

目的:获取人Hes1基因的启动子并对其进行活性分析。方法:以人Hela细胞基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增Hes1基因5’侧翼序列,将扩增的片段与pMD18-T载体连接,然后利用双酶切进行鉴定,并送测序;将测序正确的启动子插入pGL3-Basic,双酶切并测序鉴定。将测序正确的重组DNA质粒瞬时转染宫颈癌细胞,运用双荧光素酶报告基因检测系统检测其启动子的活性。结果:PCR扩增到的人Hes1基因启动子与基因库的序列完全一致,双荧光素酶报告基因检测系统显示其在宫颈癌细胞中具有启动子活性。结论:成功得到人Hes1基因启动子并且其具有活性。     

重组人白介素-22生物学活性检测方法研究

目的 建立重组人白介索-22(IL-22)生物学活性的检测方法.方法 将pSTAT3-TA-Luc质粒与pcDNA3.1质粒共转染HepG2细胞,经G418筛选出稳定转染的HepG2/STAT3细胞株.用重组人IL-22刺激细胞,定量检测荧光强度确定IL-22的活性.通过正交实验确定最佳检测条件,观察此方法的重复性和特异性,并进行方法对比.结果 最佳检测条件为细胞密度4×105/mL,加重组人IL-22刺激4h.加入萤光素酶底物50μL.本方法检测结果为半数有效量(ED50)=16.89 ng/mL,变异系数(RSD)=7.09%.中和抗体实验证实其特异性好.与ELISA法比较.该方法稳定性更好,耗时少且价格更便宜.结论 选择萤光素酶为报告基因,将报告基因的检测与细胞的转录诱导机制相结合,构建了生物活性检测细胞株,建立了IL-22活性检测方法.     

转录因子MZF1对大鼠RGC32基因启动活性的影响及可能的结合部位

目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的MZF1结合位点。方法:将RGC32基因启动子全长(-686~-1 nt)插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-RGC32-FL)后,再将p GL3-RGC32-FL与本课题组前期构建的大鼠野生型MZF1表达质粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,以确定MZF1对RGC32基因的启动作用。另用生物信息学软件预测RGC32基因启动子上转录因子MZF1潜在的结合位点,并据此构建3个RGC32基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。将上述RGC32基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒与MZF1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,以筛选MZF1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠RGC32基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共转染HEK293细胞发现,RGC32基因启动子活性显著增加。而将p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分别与p IRES2-EGFP-MZF1共转染HEK293细胞后显示,p GL3-RGC32-3的启动活性显著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能结合在RGC32基因启动子的-286~-86 nt区域。结论 :成功构建了大鼠RGC32基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,证实过表达MZF1可促进RGC32基因的启动,并初步筛查出转录因子MZF1在RGC32基因启动子上可能的结合区域。