人源脐带间充质干细胞对脑缺血再灌注小鼠神经功能及神经炎症的影响

目的探究人源脐带间充质干细胞对脑缺血再灌注损伤小鼠神经功能及神经炎症的影响。方法将96只野生型C57BL/6小鼠随机分为假手术组、磷酸盐缓冲液(PBS)处理组、WJ-MSCs细胞移植组,每组32只。PBS处理组和细胞移植组小鼠通过线栓法构建大脑中动脉阻塞再灌注模型;术后24h,通过脑立体定位技术注射细胞悬液或PBS溶液。每组取6只小鼠,于细胞移植后对小鼠腹腔注射BrdU溶液,持续5d。于术前及术后1、6、12、24d对各组小鼠进行改良神经功能损伤评分;术后6d时,采用神经元标志物NeuN免疫荧光单标记染色技术检测缺血侧大脑梗死灶及梗死灶周围区皮质神经元的变性丢失情况;采用RT-qPCR技术检测各组小鼠缺血侧大脑半球炎症因子的表达量;采用小胶质细胞/巨噬细胞标志物Iba1及增殖标记物BrdU免疫荧光双标记染色技术检测小胶质细胞/巨噬细胞的活化和增殖情况。结果与PBS处理组相比,WJ-MSCs细胞移植组小鼠神经功能显著改善(P<0.01),且位于缺血侧大脑梗死灶及梗死灶周围区皮质的存活神经元数目显著增多(P<0.01)。与PBS处理组相比,WJ-MSCs细胞移植组小鼠缺血侧脑组织的抗炎因子表达量升高,促炎因子表达量下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与PBS处理组相比,WJ-MSCs细胞移植组小鼠缺血侧梗死灶和梗死灶周围区皮质小胶质细胞/巨噬细胞的活化显著抑制(P<0.05),且小胶质细胞/巨噬细胞的增殖明显降低(P<0.05)。结论人源脐带间充质干细胞可抑制神经炎症反应并改善脑缺血再灌注小鼠的神经功能。     

脐带间充质干细胞对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)抑制人卵巢癌SKOV3细胞增 殖及促进其凋亡的作用。方法：采用Transwell共培养观察UC-MSCs向卵巢癌细胞靶向归巢的作用;MTT 实验检测UCMSCs 条件培养基抑制SKOV3细胞增殖情况;Annexin V-FITC/PI双染法检测其凋亡率;实时PCR检测与SKOV3细胞增殖 和凋亡相关基因Ki-67,Bax,Bcl-2的表达。结果：UC-MSCs体外向SKOV3细胞靶向归巢。MTT 结果显示UC-MSCs条件 培养基明显抑制SKOV3细胞的增殖(P<0.01)。Annexin V-FITC/PI双染法提示75%条件培养基组的凋亡率明显高于对照 组(P<0.05)。实时PCR发现增殖相关基因Ki-67的表达明显下降(P<0.01),凋亡相关基因Bcl-2的表达明显降低(P<0.01), Bax的表达明显增加(P<0.01)。结论：UC-MSCs体外能向卵巢癌细胞靶向归巢,通过调节增殖相关基因Ki-67的表达, 抑制SKOV3细胞增殖;通过调节凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达,促进SKOV3细胞凋亡。     

骨髓间充质干细胞抑制小胶质细胞介导的炎症反应

目的 研究骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs）对小胶质细胞介导的炎症反应的抑制作用。方法：实验分为四组：组一：小胶质细胞（BV-2)生长于DMEM(High Glucose)培养液中;组二：BV-2细胞生长于加入脂多糖（LPS）的上述培养液中;组三：BV-2细胞、BMMSCs共培养于加入LPS的上述培养液中;组四：骨髓间充质干细胞（BMMSCs）生长于加入LPS的上述培养液中。观察BV-2细胞的生长状态、电镜超微结构变化及其分泌的炎症因子TNF-α表达量的变化。结果：光镜下BV-2细胞密度依次为：组一>组三>组二,组四中BMMSCs生长状态良好;电镜下可见组二BV-2细胞内出现大量肿胀及空泡化的线粒体、内质网等细胞器,少见生长活跃多核仁细胞,同时可见大量崩解细胞,组三细胞状态明显好于组二;BV-2细胞分泌的炎症因子TNF-α表达量依次为组二>组三>组一>组四。结论 BM-MSCs抑制小胶质细胞介导的炎症反应,进而发挥神经保护作用。     

血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响

目的探讨血清对脐带间充质干细胞体外培养的影响。方法将人脐带间充质干细胞分别培养在不含血清、含灭活血清和含未灭活血清的低糖达尔伯克改良伊格尔培养基(L-DMEM)中。每天用显微镜观察脐带间充质干细胞在3种培养基中的生长情况,并计算细胞总数、统计细胞成活率。结果脐带间充质干细胞在含未灭活血清的L-DMEM中生长状况最好,在不含血清的L-DMEM中生长状况最差。结论含未灭活血清的L-DMEM是脐带间充质干细胞体外培养的最佳培养基。     

人脐带间充质干细胞修复大鼠坐骨神经损伤的实验研究

 目的观察人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）在体内微环境中修复大鼠坐骨神经损伤的效果。方法取80 只SD 大鼠,
制作羊膜管包绕的缺损10 mm的坐骨神经损伤模型。将大鼠随机分为实验组和对照组,每组各40只,实验组羊膜管内注入
hUC-MSCs 悬液50 μL（1.0*105/mL）,对照组注入等量的DF12 培养基。分别于术后4、8、12、16、20 周行肢体一般状态、腓肠肌湿
质量恢复率检测。结果2 周后术侧足底踝关节负重区出现红肿及溃疡,5～10 周时各组大鼠术侧肢体溃疡逐渐愈合,对照组较
实验组红肿及溃疡程度严重,且愈合较慢;实验组术侧腓肠肌恢复率随时相延长而逐步好转,而对照组则逐步下降,2 组间差异
有统计学意义（P < 0.01）。结论直接植入体内的hUC-MSCs 可分化神经样细胞,对坐骨神经损伤可起修复作用。     

人脐带间充质干细胞对肝癌细胞增殖性及凋亡的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchyma cell, MSC)对肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)癌细胞增殖和凋亡的影响,为HCC的治疗提供新的思路。 方法 取50%覆盖率的MSC培养皿,换上新鲜的DMEM/F-12培养基,待其培养至100%的覆盖率后收集培养基备用,即为MSC条件培养基。用新鲜DMEM/F-12培养基加上等量的MSC条件培养基的混合培养基培养HepG₂人类肝癌细胞株24、48和72h,使用MTT法测定HepG₂细胞的增殖活性、通过Hoechest33342和PI双染色后在荧光倒置显微镜下观察计数以测定HepG₂细胞的凋亡、用Transwell侵袭实验和黏附实验测定HepG₂细胞侵袭能力以及通过Western blot法检测凋亡相关信号通路蛋白的表达。 结果 混合培养基培养HepG₂细胞24h后,对其生长和凋亡及侵袭黏附能力没有显著影响(P>0.05)。但是培养延长到48h和72h后,HepG₂细胞的活性、增殖能力、侵袭能力和黏附能力都受到显著的抑制,这些变化伴随着细胞分裂相关因子Ki-67、PCNA和组蛋白H3磷酸化水平下调,以及细胞凋亡执行者caspase-3的激活和抗凋亡蛋白Bcl-2的抑制。 结论 体外间接共培养实验表明,人脐带间充质干细胞具有抑制肝脏肿瘤细胞增殖及促进其凋亡的作用。     

人脐带间充质干细胞对宫颈癌Hela细胞增殖的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)对宫颈癌细胞生物学特性的影响.方法 分离培养脐带MSCs,将MSCs或其条件培养基与宫颈癌细胞Hela共培养,生长曲线、集落形成实验及RT-PCR分别检测MSCs细胞或条件培养基对Hela细胞增殖及凋亡相关基因表达的影响.结果 生长曲线结果显示,MSCs细胞及条件培养液可抑制Hela细胞增殖,并呈现一定的浓度依赖性.集落形成实验结果显示,MSCs条件培养液可抑制Hela细胞集落形成能力;RT-PCR结果显示,MSCs条件培养基促进Hela细胞P53、Bax及caspase-3基因表达,下调Bcl-2及survivin表达.结论 MSCs体外可促进宫颈癌细胞凋亡,抑制Hela细胞增殖.     

人脐带间充质干细胞分离扩增方法的优化

【目的】 探究一种高效稳定分离、扩增人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）的方法。【方法】取材脐带20条,获得Wharton’s Jelly组织,分别用酶联合消化法（12例）和酶序贯消化法（8例）来分离、提取hUC-MSCs,比较两种方法分离hUC-MSCs的成功率、原代培养时间及获得的细胞数量;利用低糖DMEM（LG-DMEM）完全培养基和LD-Mesen培养基（MesenPro RSTM与LG-DMEM的混合培养基）分别培养hUC-MSCs,比较两种培养体系的扩增效率。对所获取细胞的免疫表型以流式细胞术进行鉴定,并诱导成脂、成骨分化验证其多向分化潜能。【结果】 酶联合消化法和酶序贯消化法成功率分别为100%（12/12）和12.5%（1/8）,二者相比有显著统计学差异（P=1.03×10-4）,前者原代培养平均时间为（14.17±1.14）d,获得细胞（1.30±0.14）×106个。2×105个hUC-MSCs用LD-Mesen和LG-DMEM两种体系培养12d后,扩增所得的细胞数分别为(14.86±0.08)×106和(5.08±0.08)×106,二者有显著统计学差异（P=1.38×10-8)。hUC-MSCs高表达CD73、CD105、CD90、CD29、CD44,不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR;并可向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化。【结论】 酶联合消化Wharton’s Jelly组织并以LD-Mesen体系进行扩增可高效获取hUC-MSCs,效率明显优于传统方法。     

人脐带间充质干细胞对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制

目的:探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响,阐明其可能的作用机制.方法:分离培养人脐带MSCs,采用光学显微镜观察细胞形态表现,并采用流式细胞仪分析鉴定其表面抗原标记物CD90、CD105、CD34和CD45的表达,以未加一抗仅加二抗的MSCs为平行对照组.将20％和60％浓度的MSC...     

脐带源间充质干细胞的分离和生物学性状

目的建立从脐带分离间充质干细胞的方法,并研究其生物学性状。方法脐带经酶消化后于DMEMLG/F12培养基中培养,倒置显微镜及电镜观察细胞形态学,细胞计数绘制细胞生长曲线,计数成纤维细胞集落形成单位(CFUF),流式细胞仪测定细胞周期及细胞免疫表型,免疫组织化学染色及RTPCR检测其体外诱导成脂肪和成骨分化的能力,RTPCR检测其细胞因子的分泌,与脐血来源CD34+细胞共同培养检测其支持造血的能力。结果经酶消化后,每cm脐带可得到中位数为1.01×106的有核细胞,CFUF产率为1/1609有核细胞,经贴壁传代可分离出成纤维样细胞,细胞倍增时间为(28.02±10.53)h。流式细胞仪分析细胞周期显示,>80%的细胞处于G0/G1期,S+G2+M期的细胞仅占(13.04±4.31)%。免疫表型分析显示,CD13、CD29、CD44、CD105(SH2)、CD73(SH3)、CD166和MHCI阳性,CD45、CD34、CD38、CD31和MHCⅡ阴性。体外诱导实验证实,该细胞具有成脂肪和成骨分化的能力。RTPCR显示,该细胞表达干细胞因子、血小板生成素,酪氨酸激酶受体配基、白细胞介素6、巨噬细胞集落刺激因子、白血病抑制因子、基质细胞衍生因子和血管内皮细胞生长因子,不表达白细胞介素3。与脐血来源CD34+细胞共同培养2周可见鹅卵石形成区,共培养8周证实其支持长期造血能力。结论建立从脐带中分离间充质干细胞的方法,脐带是间充质干细胞的新的来源。     

蜕皮甾酮对人脐带间充质干细胞增殖的影响

摘要：目的研究不同剂量蜕皮甾酮（EDS）对人脐带间充质干细胞体外增殖的影响。方法分离培养并鉴定人脐带间充质
干细胞(hUCMSCs)。取第3代hUCMSCs分别在基础培养基(低糖DMEM培养基、10%的胎牛血清、100 U/m青/链霉素、4
mmol/L L-谷氨酰胺)中加入不同浓度（0、25、50、100、150、200 μg/ml）EDS予以干预,分别于第1、3、5、7天行MTT法检测细
胞增殖活性;另外,设置相同分组EDS干预培养hUCMSCs7 天,绘制细胞生长曲线。结果第3 代细胞阳性表达CD29、
CD105,阴性表达CD34、CD45。MTT法检测结果显示经EDS干预培养的hUCMSCs增殖能力较空白对照组有明显差异
(P<0.05),其中EDS 100、150及200 μg/ml三组细胞活性比较无显著差异(P>0.05),较其他实验组有统计学意义(P<0.05)。
细胞生长曲线同样显示EDS实验组可有效促进间充质干细胞的增殖。结论一定浓度范围内EDS对hUCMSCs具有促增
殖作用,该作用在EDS浓度为100 μg/ml时较为显著,不随浓度的增加而增强。这有望成为促进脐带间充质干细胞增殖的
新方法。     

低温冻存对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的比较人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)冻存前与复苏后的生物学特性,为规模化储备UC-MSCs提供试验支持。方法采用胶原酶消化法从脐带中分离UC-MSCs,贴壁培养传代,将第3代UC-MSCs利用程控降温仪冷冻,置于-196℃液氮中冻存6个月后复苏,比较冻存前和复苏后UC-MSCs的细胞形态、生长曲线、免疫表型及多向分化潜能等生物学特性。结果复苏后UC-MSCs仍呈成纤维样形态生长,生长曲线与冻存前相似;免疫表型仍高表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45、CD40、CD80、CD86、CD154、HLA-DR;在特定的体外诱导条件下,仍可以向骨、脂肪、软骨分化。结论冻存复苏后UC-MSCs的生物学特性仍保持稳定。     

脐带间充质干细胞移植治疗肌萎缩侧索硬化症的疗效分析

目的通过对临床住院接受干细胞治疗的99例肌萎缩侧索硬化症患者分析,了解干细胞治疗肌萎缩侧索硬化（ALS）的效果,同时对接受治疗的患者进行跟踪随访,从而进一步判断干细胞治疗ALS的长期疗效。方法采集脐带间充质干细胞并进行培养、流式鉴定、无菌鉴定;临床收集ALS病例,所有的ALS诊断均符合El Escorial诊断标准;确诊的ALS患者均给予4次腰椎穿刺脐带间充质干细胞移植,移植术前及术后由同一康复师使用ALSFRS评分、Plaitaks评分以及本课题改良的Plaitaks评分进行评价,最后对所得数据进行统计分析。结果三种评分方法都证明干细胞移植可以改善ALS患者的运动功能（P〈0.001）,但是疗效维持时间较短,出院半年后只有25%的患者症状较治疗前改善。结论干细胞治疗ALS是有效的、安全的。     

抑瘤素M对人脐带间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的：探讨抑瘤素M（OSM）对体外培养的人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）增殖及成骨分化的影响,阐明OSM是一种有效的成骨诱导活性因子。方法：体外培养hUCMSCs,流式细胞术检测第3代hUCMSCs表面标志物;CCK-8法测定不同剂量（0.1、1.0和10.0 μg·L^-1）重组人抑瘤素M（rhOSM）处理后hUCMSCs的增殖活性。将hUCMSCs分为对照组、经典成骨诱导剂组和不同剂量（0.1、1.0和10.0 μg·L^-1） rhOSM组,于成骨诱导第4、7和14天,采用BCIP/NBT法进行碱性磷酸酶（ALP）染色并定量检测细胞中ALP活性,茜素红染色法检测钙结节的生成情况并半定量分析细胞矿化活性,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测hUCMSCs中Runt相关转录因子2（Runx2）和OCN mRNA表达水平。结果：hUCMSCs符合间充质干细胞（MSCs）鉴定标准。rhOSM处理hUCMSCs 72 h,与对照组比较,10.0 μg·L^-1 rhOSM组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）;处理96 h,与对照组比较,各剂量rhOSM组细胞增殖活性均明显降低（P<0.05）,且各剂量rhOSM组组间比较差异有统计学意义（P<0.01）。成骨诱导第4、7和14天,与经典成骨诱导剂组比较,各剂量rhOSM组细胞中ALP活性和Runx2 mRNA表达水平均明显升高（P<0.05）;与0.1 μg·L^-1 rhOSM组比较,1.0和10.0 μg·L^-1 rhOSM组ALP活性和Runx2 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）;与成骨诱导第7天比较,诱导第14天各剂量rhOSM组细胞中ALP活性和Runx2 mRNA表达水平略降低,但差异无统计学意义（P>0.05）。成骨诱导第7、14和21天,与经典成骨诱导剂组比较,各剂量rhOSM组细胞矿化活性均明显升高（P<0.01）;与0.1 μg·L^-1 rhOSM组比较,1.0和10.0 μg·L^-1 rhOSM组细胞矿化活性明显升高（P<0.05）。与经典成骨诱导组比较,各剂量rhOSM组OCNmRNA表达水平均明显升高（P<0.05）;成骨诱导第7、14和21天,与0.1μg·L^-1rhOSM组比较,1.0和10.0μg·L^-1rhOSM组细胞中OCNmRNA表达水平明显升高（P<0.05）,具有时间-剂量依赖性。结论：rhOSM通过上调Runx2和OCN的表达及增加成骨细胞ALP的活性和钙盐沉积促进hUCMSCs体外成骨分化,是一种有效的成骨诱导活性因子。     

体外条件下蜕皮甾酮对大鼠脐带间充质干细胞增殖的实验研究

目的:研究体外条件下蜕皮甾酮(ecdysterone,EDS)对于大鼠脐带间充质干细胞增值活性的影响。方法：采用胶原酶消化法分离培养大鼠脐带间充质干细胞,并通过动态观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面抗原加以鉴定;取第3代脐带间充质干细胞分别在基础培养基(DMEM-LG培养基、10%的胎牛血清、100U/ml青/链霉素、2mmol/L L-谷氨酰胺)中加入不同浓度（0、25、50、100、150、200μg/ml）EDS予以干预,分别于第1、3、5、7天MTT法检测细胞增殖活性;另外,设置相同分组EDS干预培养大鼠脐带间充质干细胞7天,绘制细胞生长曲线。结果：采用酶消化法能有效分离纯化大鼠脐带间充质干细胞。细胞细胞流式仪鉴定显示,第3代细胞阳性表达CD44、CD90,阴性表达CD34、CD45。实验采用MTT法检测大鼠脐带间充质干细胞活力,结果显示经EDS干预培养的大鼠脐带间充质干细胞生长状态良好,在细胞活力方面较空白对照组有明显差异(P<0.05),EDS 100μg/ml、150μg/ml及200μg/ml三组细胞活性比较无显著差异(P>0.05),其他实验组之间无统计学意义(P>0.05)。细胞生长曲线同样显示EDS实验组可有效促进干细胞的增殖,缩短细胞倍增时间,此作用在EDS浓度为100μg/ml时达到最佳。结论：体外条件下,EDS对大鼠脐带间充质干细胞具有促增殖作用,该作用在EDS浓度为100μg/ml时较为显著,不再随浓度的增加而增强。这有望成为促进脐带间充质干细胞增殖的新方法。     

当归对人脐血间充质干细胞增殖的影响

目的:探讨当归对人脐血间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖的影响及当归诱导后脐血间充质干细胞nestin变化情况。方法:无菌条件下收集新生儿脐血,以Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度法分离单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)。分离获得的MNCs采用DMEM/F12培养基/10%胎牛血清进行MNCs培养传代。向培养基内加入1μl/ml当归注射液,分为两组,阳性对照组为加当归注射液,阴性对照组不加当归注射液,进行台盼兰染色活细胞计数,以平均数为结果分别绘制两组的细胞生长曲线。对人脐血间充质干细胞进行神经标志物nestin的免疫组化检查。结果:阳性对照组脐血MSCs细胞生长曲线比阴性对照组高,在体外应用当归诱导后表达nestin。结论:当归注射液有促进脐血MSCs分化增值的作用,脐血MSC具有较强的可朔性,当归在体外使脐血间充质干细胞nestin表达增高。     

小鼠脐带间充质干细胞的体外诱导分化

目的分离扩增小鼠脐带间充质干细胞（mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSCs）探讨其是否可诱导成软骨、脂肪和成骨细胞。方法 通过贴壁培养法将mUCMSCs体外分离、扩增、纯化,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达进行鉴定。运用诱导培养液对分离的mUCMSCs分别定向诱导培养为软骨、脂肪和成骨细胞。结果 运用组织贴块培养法可从新鲜脐带中分离到贴壁生长的成纤维样细胞,这些细胞高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD34。成软骨诱导后阿新兰染色呈蓝色;成脂诱导后油红O染色,出现红色脂滴;茜红素染色成骨诱导的mUCMSC,可见红色结节。结论 贴壁培养法分离培养所获得的mUCMSCs在体外可诱导分化为软骨、脂肪和成骨细胞。     

脐带间质干细胞多向分化潜能的鉴定

目的:研究脐带间质干细胞的多向分化潜能,为心血管组织工程研究提供一个新的种子细胞来源?方法:采用胶原酶胰酶消化脐带组织,将获得的细胞传代培养,流式细胞仪鉴定细胞表面分子,再以不同方法使其向骨?脂肪?心肌和内皮细胞方向诱导,分别采用Von Kossa?油红O染色和免疫组化对分化的细胞进行鉴定?结果:脐带间质干细胞分别向成骨细胞和成脂肪细胞诱导培养后,Von Kossa染色和油红O染色阳性?在5-氮胞苷诱导后,心肌特异性抗体肌动蛋白α-actin和肌球蛋白myosin免疫组化染色阳性?在VEGF诱导后,细胞形成网格样结构,免疫荧光示CD31?CD34染色阳性?结论:脐带间质干细胞具有分化为骨?脂肪?心肌和内皮细胞的潜能,是非常有前途的心血管组织工程种子细胞来源?