血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE一2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）的特异性小片段干扰RNA（siRNA）对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用，为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法：体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z，并分成正常氧状态培养组（20％）和低氧（1％）培养组。采用脂质体（LF2000）将VEGF siRNA转染两组细胞，并采用RT—PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGF mRNA和蛋白质表达的差异。结果：与未转染组和转染空载体组相比，在正常氧和低氧状态下，VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达（P〈0．01）；正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下：未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为：423．92、419．68和328．86pg／mL；低氧状态下VEGF165的含量分别为：813．62、799．89和500．96pg／mL，转染VEGF siRNA组VEGF的表达下调。结论：VEGF siRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF mRNA和蛋白质的表达，因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

RNA干扰技术

在基因治疗领域里，继反义RNA、核酶和三链DNA技术之后，现在又掀起了RNA干扰技术，这项技术在2002年度里荣登美国著名“科学”杂志评选出的世界十大科技进展之榜首，现将有关RNA干扰技术作一介绍。     

RNA干扰抑制视网膜母细胞瘤细胞血管内皮生长因子的表达

目的利用RNA干扰（RNAi）技术,研究血管内皮生长因子（VEGF）编码基因的siRNA对人视网膜母细胞瘤（RB）细胞的影响,从而探讨通过抑制血管内皮生长因子在视网膜母细胞瘤组织中的表达来治疗视网膜母细胞瘤的机理。方法将VEGF编码基因特异的siRNA转染入视网膜母细胞瘤细胞,采用RT PCR和Western blot技术检测siRNA处理前后RB细胞VEGF基因表达变化。MTT法检测siRNA处理前后RB细胞生长的抑制情况。结果RT PCR和Western blot均显示VEGF特异性siRNA对视网膜母细胞瘤细胞血管内皮生长因子基因的表达有抑制作用,MTT法检测RB细胞生长的抑制情况显示,抑制率可达40%。结论VEGF特异性siRNA的特异性基因沉默作用对RB细胞VEGF基因的表达有抑制作用。     

血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)的特异性小片段干扰RNA(siRNA)对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用,为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z,并分成正常氧状态培养组(20%)和低氧(1%)培养组。采用脂质体(LF2000)将VEGFsiRNA转染两组细胞,并采用RT-PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGFmRNA和蛋白质表达的差异。结果与未转染组和转染空载体组相比,在正常氧和低氧状态下,VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达(P<0.01);正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下:未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为:423.92、419.68和328.86pg/mL;低氧状态下VEGF165的含量分别为:813.62、799.89和500.96pg/mL,转染VEGFsiRNA组VEGF的表达下调。结论VEGFsiRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGFmRNA和蛋白质的表达,因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

血管内皮生长因子小干扰RNA有效抑制小鼠视网膜新生血管

Background The mechanism of retinal neovascularization is not understood completely.Many growth factors are involved in the process of retinal neovascularization,such as vascular endothelial growth fac...     

血管内皮生长因子在鼻咽癌中的表达及意义

目的 探讨血管内皮因子（ＶＥＧＦ）与鼻咽癌发生、生长及转移的关系。方法 应用ＬＳＡＢ免疫组织化学技术检测５０例鼻咽鳞状上皮癌组织中ＶＥＧＦ的表达。结果 鼻咽鳞状上皮癌组织中ＶＥＧＦ的表达明显高于鼻咽慢性炎症组织组（Ｐ〈０．０５）,在鼻咽癌组织中,Ⅲ,Ⅳ期患者明显高于Ⅰ,Ⅱ期,而有颈部淋巴结转移组又明显高于无颈部淋巴结转移组（Ｐ〈０．０５）。结论 ＶＥＧＦ可作为判断鼻咽癌的发生、转移及预后的临床指标     

RNA干扰沉默血管内皮生长因子抑制人舌癌细胞增殖的实验研究

目的:通过转染能特异性沉默血管内皮生长因子(VEGF)表达的小干扰RNA(siRNA),观察能否抑制人舌癌Tca8113细胞株的增殖.方法:将自行构建的两对表达siRNA的重组质粒(PU-VEGF-siRNA1,PU-VEGF-siRNA2)转染到舌癌Tca8113细胞株中,以空载体组转染为实验对照组,以正常生长的舌癌细胞做空白对照组.实验组和实验对照组经G418筛选后,与空白对照组以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测VEGF mRNA的表达,流式细胞技术分析细胞凋亡,MTT比色法检测细胞的生长抑制率.结果:与实验对照组相比,PU-VEGF-siRNA1,PU-VEGF-siRNA2重组体显著降低舌癌细胞VEGF mRNA的表达(P＜0.01),MTT的结果显示分别在24、48、72、96 h对细胞增殖的抑制率增加(P＜0.05),细胞凋亡率也明显增高(P＜0.01);而空载体转染组与空白对照组相比,对Tca8113细胞株增殖无抑制作用,对细胞凋亡变化无明显影响(P＞0.05).结论:PU-VEGF-siRNA在细胞内表达的siRNA 不仅能显著降低VEGF表达,而且能有效抑制人舌癌细胞的增殖.     

RNA干扰与基因功能研究

去除或降低某个或某些基因在细胞或机体中的表达 ,是研究正常基因的结构、功能、疾病的发病机制的重要手段。进行这类研究 ,需要在遗传学和分子生物学上有易于控制的实验体系。比如基因敲除 (ｋｎｏｃｋｏｕｔ)或基因表达降低(ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ)等方法就成功地对许多特殊基因在生理或病理状态下的功能进行了研究。但这些基础方法操作比较复杂 ,费时费力 ,对靶基因的选择有很大的局限性。显性阴性(ｄｏｍｉｎａｎｔｎｅｇａｔｉｖｅ)和反义法 (ａｎｔｉｓｅｎｓｅ)是对以上方法的补充 ,但仍然具有结果不稳定 ,无法预知实验效果等缺点。因此…     

RNA干扰血管内皮生长因子受体表达对人肺腺癌细胞的抑制作用

目的:观察人血管内皮生长因子受体(VEGFR)RNA干扰重组腺病毒(Ad-VEGFRshRNA)对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用.方法:制备携带人VEGFR的RNA干扰重组腺病毒,转染A549细胞,通过荧光显微镜观察转染效率.应用Western印迹法检测A549细胞VEGFR蛋白的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线,细胞周期及集落形成试验测定细胞生长抑制情况.同时,制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果:Western印迹法显示RNA干扰组VEGFR表达水平明显降低;细胞生长曲线表明,RNA干扰后细胞生长明显减缓;细胞周期及集落形成试验提示RNA干扰后肿瘤细胞生长受到明显抑制.裸鼠皮下移植瘤生长情况提示RNA干扰可以显著抑制肿瘤生长.结论:RNA干扰重组腺病毒Ad-VEGFRshRNA能有效抑制A549细胞中VEGFR的表达,并能抑制肿瘤生长.     

RNAi沉默VEGF表达对大肠癌细胞肝转移的影响

目的:研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对大肠癌肝转移的影响。方法:根据VEGF基因mRNA设计合成小干扰RNA,采用荧光实时定量PCR检测VEGF mRNA水平,分别以软琼脂集落培养试验和Boyden模型观察癌细胞锚着不依赖性增殖和癌细胞侵袭能力。以脾切除法建立大肠癌肝转移模型,以不同方法处理的癌细胞接种模型,观察对大肠癌细胞肝转移的影响。结果:转染组VEGF基因mRNA水平明显降低,且呈浓度和时间依赖性。经VEGF siRNA转染处理的癌细胞软琼脂集落形成数和穿膜细胞数明显减少,且呈浓度依赖性(P<0.05,P<0.05)。体内试验发现,对照组10只全部出现大肠癌肝转移灶,而siRNA组仅仅1只出现肝转移,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。结论:VEGF基因在大肠癌肝转移中起着重要的作用;以RNAi技术沉默VEGF基因表达,可抑制大肠癌细胞肝转移。     

RNA干扰对VEGF在人卵巢癌细胞中表达及细胞增殖的影响

目的:探讨小发夹RNA(shRNA)载体介导抑制人卵巢癌细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达和对卵巢癌细胞增殖的影响.方法::采用脂质体介导的方法将抗VEGF小发夹状双链RNA真核基因表达载体转染到人卵巢癌细胞(HO-8910)中,用G418 筛选获得阳性克隆.用Western印迹法、RT-PCR检测VEGF基因在卵巢癌细胞中的表达;通过MTT及细胞周期分析观察其对卵巢癌细胞增殖的影响. 结果:转染特异性小发夹RNA质粒表达载体的HO-8910细胞中VEGF表达量明显减少;HO-8910细胞生长减慢,阻滞于G1期的增多,S期细胞减少.结论:VEGF小发夹RNA质粒载体可显著抑制HO-8910细胞中的VEGF基因的表达,抑制卵巢癌细胞的增殖,该研究为应用RNAi进行肿瘤的基因治疗提供了实验依据.     

腺病毒介导RNA干扰抑制人结肠癌VEGF受体表达及肿瘤生长

目的:观察腺病毒介导的RNA干扰抑制人结肠癌中血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)表达及肿瘤生长的作用.方法:将RNA干扰pAd-Easy/VEGFR腺病毒载体用Lipofectamine 2000转染293细胞,制备携带人VEGFR的腺病毒,转染CW2细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率,通过RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGFR mRNA的表达;以MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线.同时,制备裸鼠CW2细胞移植瘤模型,注射腺病毒后,每天观察肿瘤生长情况.应用免疫组化法检测微血管密度(MVD).结果:pAd-Easy/VEGFR重组腺病毒成功构建,转染效率为99.7%.RT-PCR、 Western印迹实验结果显示转染pAd-Easy/VEGFR后,VEGFR的表达明显被抑制.细胞生长曲线表明,重组载体转染后细胞生长明显减缓.体内实验表明,pAd-Easy/VEGFR治疗后肿瘤生长慢并伴有较低的MVD.结论:pAd-Easy/VEGFR介导的VEGFR shRNA能有效抑制CW2细胞中VEGFR的表达,并能抑制肿瘤生长.     

腺病毒介导RNA干扰抑制血管内皮生长因子的表达治疗人肺腺癌的实验研究

目的:构建针对人血管内皮生长因子(VEGF)的腺病毒载体pAd-Easy/VEGF,应用RNA干扰的方法,观察其在体内和体外对人肺腺癌细胞株A549生长的抑制作用.方法:应用PCR构建RNA干扰pAd-Easy/VEGF腺病毒载体,并利用该线性化质粒用Lipofectamine 2000转染293细胞,制备携带人VEGF的腺病毒转染A549细胞.荧光显微镜和流式细胞仪观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的转染效率,RT-PCR和蛋白质印迹法检测VEGF mRNA的表达,MTT比色法测定活细胞数并绘制细胞生长曲线.同时制备裸鼠A549细胞移植瘤模型,观察肿瘤生长情况.结果:pAd-Easy/VEGF重组质粒经测序证实已把预设人VEGF基因RNA干扰的siRNA模板序列插入载体.转染重组腺病毒及空病毒24 h后流式细胞术测得转染效率分别为100%、99.7%.pAd-Easy/VEGF组VEGF表达水平较生理盐水对照组明显降低.pAd-Easy/VEGF组细胞生长明显减缓.pAd-Easy/VEGF治疗组肿瘤体积和质量明显小于对照组(P＜0.01).结论: pAd-Easy/VEGF介导的VEGF shRNA能有效抑制A549细胞中VEGF的表达,并在体内抑制肿瘤生长.     

靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用

目的构建靶向舌癌Tca8113细胞血管内皮细胞生长因子（VEGF）基因的siRNA表达载体并在体外检测其对VEGF基因表达的抑制作用。方法设计合成靶向舌癌Tca8113细胞VEGF基因的siRNA cDNA序列并与Psilencer2.1-U6-neo连接,构建VEGF-siRNA表达载体（Pu-VEGF-siRNA）,酶切鉴定和测序确认后,经脂质体Lipofectamine2000转染入Tca8113细胞,以空载体组为实验对照组（Pu-HK）,未转染组为空白对照组。采用酶联免疫吸附（ELISA）和免疫组化方法检测染后Tca8113细胞VEGF蛋白表达差异。结果经过双酶切鉴定和测序分析,成功构建了靶向Tca8113细胞VEGF基因的siRNA表达载体。与实验对照组和空白对照相比较,转染Pu-VEGF-siRNA后Tca8113细胞的VEGF蛋白表达明显下降（P〈0.05）,但两对照组间差异无统计学意义（P〉0.05）。结论成功构建了靶向舌癌Tca8113细胞VEGF基因的siRNA表达载体,且该载体在体外能有效抑制Tca8113细胞VEGF蛋白的表达。     

RNAi抑制鼻咽癌细胞表皮生长因子受体表达对细胞生长的影响

目的利用RNAi技术抑制鼻咽癌细胞5-8F表皮生长因子受体（EGFR）表达,观察细胞生长变化,探讨EGFR与鼻咽癌发生发展之间的相关性。方法利用体外转录法合成EGFR特异性siRNA,将其瞬时转染5-8F．收集转染后细胞总RNA和蛋白,利用RT．PCR和Western blot法测定EGFR表达水平的变化,并检测EGFR表达抑制后细胞生长速度和生长周期的变化。结果合成的3对siRNA中,有一对使EGFR mRNA表达下降67．5％,蛋白表达下降77％。EGFR表达抑制后5．8F生长速度减慢,并诱导细胞周期停止在G1期。结论RNAi沉默EGFR表达可抑制鼻咽癌细胞生长,并诱导癌细胞停止在G1期,RNAi可作为探索鼻咽癌发生发展机制和基因治疗的有效工具。     

血管内皮生长因子siRNA对人膀胱癌裸鼠移植瘤生长的实验研究

目的观察VEGF siRNA对人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用，探讨VEGF作为膀胱癌基因治疗靶点的有效性。方法已稳定转染pGC-siVEGF的T24接种至裸鼠皮下，建立荷瘤裸鼠膀胱癌模型。利用免疫组织化学方法（SABC）检测肿瘤细胞VEGF和肿瘤间质CD34的水平，根据CD34表达情况评价肿瘤微血管密度（MVD），末端脱氧核苷酸转移酶标记法（TUNEL）测定肿瘤细胞凋亡指数。结果实验组与对照组相比较：成瘤率低，肿瘤生长速度缓慢（P〈0．01）；VEGF水平下降（P〈0．01）；肿瘤微血管密度减少（P〈0．01）；凋亡指数升高（P〈0．01）。组间比较差异均具有显著性。结论以VEGF为靶点的小干扰RNA有抑制VEGF表达、遏制膀胱癌T24细胞在体内生长的作用，VEGF有可能成为临床膀胱癌基因治疗的有效靶点，为膀胱癌的抗血管生成疗法提供理论基础。