林可链霉菌与委内瑞拉链霉菌种间原生质体融合的研究

本文报道氯霉素产生菌委内瑞拉链霉菌A-186株与林可霉素产生菌林可链霉菌林可变种78-11株种间原生质体融合的结果。首先,研究了委内瑞拉链霉菌A-186的原生质体制备和再生条件,再生率可达86％。然后,采用氯霉素产生菌S.venezuelae A-186的原生质体用紫外线灭活后,与具有耐药标记的S.lincolnensis var.lincolnensis78-11原生质体融合的方法,种间融合频率达到3.2×10~(-5) 。并筛选到一株遗传稳定的重组子,经初步鉴定它能同时产生两亲株所产的两种抗生素。     

新霉素产生菌弗氏链霉菌灭活原生质体的融合

把新霉素产生菌弗氏链霉菌(Sir·fradae)的原生质体分别用热或u.v.灭活的单亲株或双亲株经PEG融合,获得了重组体菌株。用热或u.v.灭活的单亲株与另一活亲株融合重组率多数为10~(-5) ～10~(-3),约为二个活亲株融合重组率的10~(-4)～10~(-2)。用热和u.v.或皆用u.v.分别灭活两亲株,而后使之融合,其重组率多数为10~(-2)～10~(-1),接近二个活亲株融合的水平;而皆用热灭活的两亲株融合后未得到重组体。上述结果为工业微生物杂交育种摆脱遗传标记提示了新的可能性。     

费氏链霉菌遗传操作体系的优化与应用

目的 建立并优化费氏链霉菌的遗传操作体系,并通过分子改造得到新霉素效价提高的重组菌株,为后续获得新霉素高产菌株奠定理论基础。方法 选择费氏链霉菌最适产孢培养基和抗性筛选标记,对接合转移体系的关键影响因素进行优化,获得过表达neoC基因的重组菌株,以进一步研究neoC基因对新霉素效价的影响。结果 费氏链霉菌接合转移最适培养基为A75培养基,孢子最适处理条件为50℃热激10min,37℃预培养4h,最适供受比为10:1,安普霉素最适添加时间为15h,优化后接合转移频率提高了7.69倍,并得到了一株新霉素效价提高了22.29%的neoC基因过表达菌株SF-neoC。结论 成功建立并优化了费氏链霉菌的遗传操作体系,为后续基于费氏链霉菌分子改造的其它应用提供依据。     

dauW基因对柔红霉素产量的影响

报道了先前克隆的柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌(Streptomyces coeruleorubidus)dauW基因的过表达和阻断对柔红霉素产量的影响.通过原生质体融合将dauW表达质粒导入天蓝淡红链霉菌DM,所得重组菌DM-W1的柔红霉素产量无明显提高;而通过大肠杆菌-链霉菌接合转移获得的发生同源重组单交换的dauW阻断突变株DM-W2,柔红霉素产量达(192.0±61.6)μg/ml,且遗传稳定性好.试验结果表明,对dauW基因的阻断突变能明显提高柔红霉素的发酵单位.     

通过原生质体融合获得青霉素高产菌株

采用两株分别带有不同抗药性标记的产黄青霉原生质体以1:1相混合,用30％的聚乙二醇(MW6000)原生质体融合处理。将混和物涂布在补给有两种药物同时存在的高渗性分离培养基上,培养后获得异核体菌落。洗下异核体分生孢于继续分离在补给有两种药物同时存在的分离培养基上,得到了同时带有两种抗性标记的重组体。纯化后,进行抗性稳定性和摇瓶效价的测定,将一株具有双重抗性、摇瓶发酵效价较高的菌株作出发菌株,经诱变因子处理后,获得了一株43u7c—57菌株,在摇瓶中效价比生产菌株平均提高4.94％,该菌株在40吨发酵罐试生产后,发酵效价平均提高4.4％,产量则平均增加12.15％。     

链霉菌的原生质体融合

链霉菌中许多品种可以产生抗生素,为此引起人们对它们极大的兴趣。关于在链霉菌中可以通过种内结合的方法来产生低频重组(<10~(-6))进行遗传学分析早有报道~[8]。但最近发现,在人工诱导原生质体形成后,即使是在已知性因子缺失的情况下,也可以产生高频的重组。这样,对于链霉菌的遗传学分析方便多了,推动了链霉菌基础研究及应用研究的发展。 原生质体再生 通过原生质体融合在链霉菌中建立有效的基因转移方法必须解决两个问题。即从细胞如何形成原生质体以及原生质体如何在合     

原生质体诱变及高通量筛选选育链霉素高产菌株

目的 通过诱变和筛选方法的研究，提高灰色链霉菌(Streptomyces griseus)生产链霉素的水平。方法 优化灰色链霉 菌的原生质体的生成和再生条件，并对得到的原生质体进行紫外诱变，然后利用微孔板高通量方式对获得菌株进行筛选。结果 经过诱变选育获得一株菌NP-11703，其链霉素产量在100L罐上比出发菌株提高了21.8%。结论 用紫外诱变原生质体，可以有 效提高灰色链霉菌产链霉素的能力。结合高通量筛选模型的应用，可大大加快高产菌株的筛选效率。     

基因组重排选育麦迪霉素高产菌株

目的以生米卡链霉菌(Streptomyces mycarofaciens)突变株为研究对象,选育麦迪霉素高产菌株。探索并验证基因组重排技术在菌种选育中的重要作用。方法通过2轮多亲株灭活原生质体融合技术实现基因组重排。将来自不同育种方法的5株麦迪霉素高产菌株B64-5、01-GM-1、H-101、H-106和H-108作为第一轮亲本,在质量浓度为3 g.L-1溶菌酶3、2℃水浴60 min条件下制备原生质体,分别采用紫外线照射148 s和52℃加热60 min灭活原生质体,然后采用质量分数35%PEG 4000、37℃保温2 min诱导原生质体融合。融合子经过初筛和复筛,获得产量进一步提高的重组子作为亲本进行第二轮的多亲株灭活原生质体融合实验。用生物学方法测定麦迪霉素效价,用HPLC方法测定麦迪霉素A1含量。结果与结论经过2轮基因组重排实验成功选育出3株高产且遗传稳定的麦迪霉素生产菌株。其中1株菌株GSZ2-32发酵前补加前体X-1后摇瓶产量比原始出发菌株Streptomyces mycarofaciens var.464提高1.1倍,麦迪霉素A1(MDMA1)质量分数含量保持在80%以上。     

金色链霉菌原生质体电融合

为了提高去甲基金霉素的发酵效价,将金霉素链霉菌产生去甲基金霉素的变株的原生质体与金霉素高产变株热灭活的原生质体,用非交流电场法和交流电场法进行了电融合。在非交流电场法实验中。先用25％PEG将原生质体聚集,再以BAEKON 2000和SDⅡ型二种基因转移仪,采用几种不同的实验参数(脉冲强度、宽度和个数)进行融合,皆未能提高融合频率。交流电场法融合实验用SD3000细胞融合仪,当原生质体在交流电场(频率0.5MHz,强度800v/cm,作用时间60s)中形成串珠状后,施加直流脉冲(脉冲强度7kv/cm,宽度20μs,间隔0.5s,个数3),融合频率为2×10~(-4)左右,比50％PEG诱导的融合频率(2.5×10~(-5)高约一个数量级。对225株融合子进行了初筛发酵和效价测定。结果表明,其中效价高菌株所占百分数高于对照组(去甲基金霉素产生菌不同营养缺陷型的融合子),而且85％以上的融合子只产生去甲基组分。尽管融合子的发酵效价皆不稳定,但经过几次自然分离后仍获得了产量比出发菌株提高一倍左右并只产生去甲基组分较为稳定的融合子菌株。     

60Co诱变选育平阳霉素高产株的研究

目的 筛选平阳霉素高产菌株。方法 以平阳霉素产生菌-平阳链霉菌为出发菌株,采用60C0诱变处理并通过遥瓶试验。结果 获得一株高产突变株,其产素能力达到出发菌株效价的1.86倍。传代试验表明该突变株的高产遗传特性稳定。结论     

林肯链霉菌林肯变种和小单孢菌属间融合

以阿司米星产生菌(Micromonospora sp.SIPI 4812 LM~s,EM~(?),GM~r,KM~r)和林可霉素产生菌(Streptomyces lincolnensis var.lincolnensis 20-2 LM~r,EM~r,GM~s,KM~s)为出发菌株,进行属间原生质体融合,其融合频率为6.7×10~(-5)。还测定了其它遗传重组频率。得到的融合子中有一些在菌落形态、抗菌活性等方面与出发亲株明显不同。     

原生质体再生与诱变在硫霉素产生菌选育中的应用

以硫霉素产生菌卡特利链霉菌３５８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｔｌｅｙａ３５８）为原始菌株,用原生质体形成与再生结合物理、化学诱变的方法进行菌种选育。在最适条件下原生质体释放浓度和再生率分别为１．６×１０９／ｍｌ和２９．５％。原生质体再生处理后,硫霉素产量变异向正方向移动,筛选到１株ＰＲ－１１７,相对效价提高６０％。分别以菌株ＰＲ－１１７的孢子和原生质体进行紫外线及亚硫酸氢钠诱变,原生质体对诱变剂的敏感性强于孢子,致死率增加,效价分布更分散。原生质体与孢子紫外线诱变正变率分别为１６．５％和９％,亚硫酸氢钠诱变的正变率都为４％。从原生质体紫外线诱变株中筛选到１株ＰＲｕ－３３６,相对效价比原始菌株提高９０％。     

麦迪霉素产生菌—生米卡链霉菌原生质体融合的研究

用甘氨酸—溶菌酶方法成功地分离生米卡链要菌(S.mycarofaciens)原生质体。在MgSO_4加倍的完全培养基(cm)上,原生质体再生频率远远超过R_2再生培养基。用3.68％的CaCl_2溶液,配制成30％(w/v)的PEG4000或6000溶液,可有效地诱导生米卡链霉菌原生质体融合,融合重组频率10~(-2)～10~(-3)。融合重组体和亲本在菌落形态、孢子形态和抗生素产量上有显著差异,不同的融合重组体之间,也表现了这些差异。实验分离到抗生素生产能力超过亲本40％的C_(69)菌株,经紫外光诱变后,又获得抗生素能力超过亲本15％(均以两亲本的平均值计)以上的C_(64112)菌株。融合重组体对紫外光的敏感度低于亲本,而抗生素生产能力的正变频率超过亲本。     

麦迪霉素产生菌880103#菌株的选育

麦迪霉素产生菌生米加链霉菌A03菌株经过多次诱变筛选及抗自身代谢物突变,得到了产量正变株;通过推理筛选的方法,应用初级代谢产物生物合成途径的调节突变株,分离得到了一主要组分麦迪霉素A_1高于对照菌株的优良菌株880103。并通过加入前体的方法,使其麦迪霉素A_1组分进一步提高。在试产中,该菌株与对照菌株相比,发酵单位相对提高16％,麦迪霉素 A_1组分相对提高 28％,成品效价相对提高4.7％;且发酵周期短、温度适中、遗传性能稳定、适应性强,是一株优于对照菌株的优质高产菌株。     

黑暗链霉菌原生质体融合

报道了黑暗链霉菌原生质体制备和融合的方法。将一原养型亲株原生质体经紫外线灭活2分钟,与另一苯丙氨酸缺陷型突变株原生质体等量混合,40％PEG处理,32℃保温3分钟,获得了重组后代,经分析,融合子的代谢产物中次组分的含量有所降低。     

四环素生产菌诱变育种与发酵性能的研究

采用紫外线对四环素生产菌金色链霉菌４－２８的原生质体进行诱变处理,选是到一株高产突变株Ｈ３２－３７。该菌在形态上与出发菌株存在明显差异;菌落小,呈图形或梅花形,表面粗糙,孢子丰富,孢子颜色深,四环素生产能力比出发菌株提高２３．９％,研究了其发酵性能,优化了培养基组成和发酵工艺条件,使四环素效价提高了４４．４％。     

基因组重组技术选育埃博霉素B高产菌株

目的 用基因重组技术选育埃博霉素高产菌株.方法 本研究首先从不同生境中分离筛选到4株能产生埃博霉素B的纤维堆囊菌,以这些野生菌株作为Genome shuffling递归原生质体融合出发菌株.结果 通过五轮基因组重组成功选育到了3株遗传稳定的高产埃博霉素B重组菌株,其中一株重组菌株So F5-09的埃博霉素B产量达到了15.8mg/L,比原始出发菌株So 07-9埃博霉素B产量提高了35.1倍.结论 本研究证明使用野生菌株作为Genome shuffling递归原生质体融合出发菌株也能有效提高目标代谢产物的产量.     

文摘

16-41 用原生质体融合和再生法筛选抗生素产生菌 抗生素产生菌的原生质体融合和再生获得的重组体能合成与原株产抗生素化学结构不同的抗菌物质,这种抗生素的合成可能是原生质体融合和再生过程引起次级代谢产物沉默基因活化的结果,在抗生素产生菌初筛中无生物活性的链霉菌基因组中存在有编码次级代谢产物合成的沉默基因,它对药物筛选具有很大的潜在意义。基于上述的认识,作     

2-酮基-L-古龙酸产生菌原生质体的属间融合

用配对法筛选得一株氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans)10-3的优良伴生菌短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus)97002，混合菌发酵产生2－酮基－L－古龙酸，山梨糖的转化率达90％左右，两菌分别经诱变处理，获得耐利福平B.pumilus 97002-1-6 Rif^r和耐红霉素G.oxydans 10-3-20 Em^r遗传标记菌株，并确定B.pumilus 97002-1-6Rif^r菌原生质体形成和再生最佳条件。初步尝试两菌属间原生质体融合。     

透明颤菌血红蛋白基因的克隆及其在林可链霉菌中的表达

目的通过将透明颤菌血红蛋白基因vgb克隆到林可链霉菌染色体黑色素生物合成基因m elC位点,使m elC基因被破坏失活,vgb基因实现表达同时提高林可霉素产量。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pYHT04,通过接合转移实验将重叠延伸PCR得到的具有红霉素抗性基因启动子的透明颤菌血红蛋白基因,以双交换的方式整合进林可链霉菌黑色素生物合成基因m elC中。采用不同装瓶量摇瓶发酵,HPLC检测发酵液中林可霉素含量。结果重组菌株颜色变浅,CO结合差光谱显示在420 nm处有明显吸收峰,随着装瓶量的增加重组菌株发酵液中林可霉素效价与对照菌株相比降低幅度较小。结论重组菌株m elC基因失活不能继续合成黑色素,vgb基因得到表达并表现出生物学功能,限氧条件下重组菌株发酵液中林可霉素效价高于对照菌株,有希望应用于工业发酵生产。